周 薇， 徐金升， 白亞玲， 張慧然， 何 雷， 張勝雷， 張東雪

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科，河北石家莊050011）

血管鈣化（vascular calcification，VC）與心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）和慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）患者的死亡率有關(guān)［1-2］，且在 CKD 患者全因死亡率中 CVD 死亡率占第1 位［3-4］。VC 是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及不同的分子途徑，包括血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞樣細(xì)胞［5］。VSMCs 暴露于高磷（high phosphcrus，HP）和（或）高鈣環(huán)境下會(huì)導(dǎo)致鈣化增加，與成骨信號(hào)通路有關(guān)［6］，而成骨信號(hào)通路和VC 的主要特征是Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）的特異性上 調(diào)［7］。 miR-30s、miR-204 等 miRNAs 通 過 參 與VSMCs 向成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，進(jìn)而參與血管鈣化［8］。miR-30b 在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及凋亡中起著重要作用［9-10］。為進(jìn)一步研究 HP 條件下 miR-30b 通過何種途徑影響大鼠VSMCs 鈣化，本研究以體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs 為研究對(duì)象，探討miR-30b 在HP 誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化發(fā)生過程中的作用及其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)液及胎牛血清均購自Gibco；β-甘油磷酸購自Sigma；茜素紅染料購自Solarbio；鈣含量測(cè)定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；堿性磷酸酶（abkaline phosphatase，ALP）活性檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物公司；RNA 提取試劑盒及RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Thermo Fisher；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；PCR引物、miR-30b 模擬物（miR-30b mimic，mimic-30b）及其陰性對(duì)照（mimic-NC）均購自廣州市銳博生物科技有限公司；抗Runx2 抗體購自Abcam；抗GAPDH抗體購自Bioworld。

2 模型的制備與分組

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 5/6 腎切除術(shù)加骨化三醇灌胃法構(gòu)建鈣化模型［11］。取4周齡、體重80～100 g的清潔級(jí)雄性健康SD 大鼠（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為1305090），隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組和慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）所致VC（CRF+VC）組。假手術(shù)組大鼠未行腎切除，僅將腎周筋膜分離，且術(shù)后給予1.5%甲基纖維素灌胃；CRF+VC 組行5/6 腎切除術(shù)，且術(shù)后給予1.5%甲基纖維素加上骨化三醇（600 ng·kg-1·d-1）灌胃，共20 d。

2.2 體外實(shí)驗(yàn) 分離大鼠胸主動(dòng)脈，用組織貼壁法行 VSMCs 原代培養(yǎng)［11］。取第 3～4 代細(xì)胞接種于 6 孔板中，融合度至70%～80%時(shí)給予刺激。將VSMCs分為正常（normal，N）組和HP（10 mmol/L β-甘油磷酸）組。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-30b 對(duì)VSMCs 的作用，將細(xì)胞分為3組：HP組（細(xì)胞未轉(zhuǎn)染）、mimic-NC 組（轉(zhuǎn)染mimic-NC）和mimic-30b 組（轉(zhuǎn)染mimic-30b），均給予10 mmol/L β-甘油磷酸。

3 方法

3.1 血管鈣化染色 玻片滴加5%硝酸銀溶液，紫外光照射1 h，于堿性品紅溶液中復(fù)染，顯微鏡下觀察血管的鈣化情況，鈣鹽沉積處呈黑色。

3.2 血管鈣含量測(cè)定 將烤干的大鼠胸主動(dòng)脈10 mg，放入鹽酸（0.6 mmol/L）中37℃過夜，取上清液測(cè)鈣含量，酶標(biāo)儀600 nm 處檢測(cè)吸光度，計(jì)算出鈣含量，以mg/g為單位。

3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)血管Runx2 的表達(dá) 使用羅氏全自動(dòng)免疫組化染色儀，進(jìn)行染色，選擇中修復(fù)，Ⅰ抗孵育30 min，棕黃色顆粒為陽性。隨機(jī)選取6 個(gè)高倍視野，陽性細(xì)胞和染色強(qiáng)度積分相加大于3分為陽性。

3.4 細(xì)胞茜素紅染色 取第3 代VSMCs 接種于12孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度至70%～80%時(shí)進(jìn)行干預(yù)，用95%乙醇于室溫固定30 min，用0.1%茜素紅染液（pH 8.4）染色，于37℃孵育30 min，觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況（橘紅色結(jié)節(jié)為鈣鹽沉積）并照相。

3.5 細(xì)胞鈣含量測(cè)定 將VSMCs 接種于12 孔板，細(xì)胞刺激后棄上清液，用1 mol/L稀鹽酸脫鈣24 h，取上清液，測(cè)定鈣含量。VSMCs 用0.1 mol/L 氫氧化鈉和0.1%十二烷基硫酸鈉溶解30 min，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。細(xì)胞鈣含量用鈣與蛋白質(zhì)含量的比值表示［mg/（g protein）］。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

3.6 細(xì)胞ALP 活性測(cè)定 將VSMCs 接種于12 孔板，細(xì)胞刺激后棄上清液，加100 μL 1% TritonX-100，4℃冰箱靜置30 min，充分裂解細(xì)胞，離心取上清液，酶標(biāo)儀選取520 nm波長測(cè)定吸光度；測(cè)定蛋白質(zhì)含量來校正ALP 的活性，單位為U/（g protein）。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

3.7 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 提取刺激后VSMCs 的RNA，測(cè)定miR-30b及Runx2 mRNA的表達(dá)。檢測(cè)miR-30b時(shí)以5S rRNA 為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。檢測(cè) Runx2 mRNA 時(shí)以 GAPDH 為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性20 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸20 s。Runx2 的上游引物序列為5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3′，下游引物序列為 5′-CGCTCCGGCCCACAAATCTC-3′；GAPDH 的上游引物序列為5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物序列為 5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

3.8 Western blot 檢測(cè)Runx2 蛋白表達(dá) 提取刺激后 VSMCs 的總蛋白，取 50 μg 進(jìn)行 10% SDS-PAGE（恒壓95 V 持續(xù)1.5 h），再以恒壓95 V 轉(zhuǎn)膜1 h，牛奶封閉 1 h，加入I 抗（抗GAPDH 抗體1∶5 000 稀釋，抗Runx2 抗體1∶500 稀釋），4℃孵育過夜；洗膜，加入II抗（1∶5 000），室溫下孵育1 h，于蛋白成像儀上顯色。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；相關(guān)性評(píng)估采用Pearson 相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠血管組織鈣化及Runx2表達(dá)情況

硝酸銀染色結(jié)果顯示CRF+VC 組黑色沉積比sham 組顯著增多，而免疫組化染色顯示CRF+VC 組Runx2褐色沉積顯著增多，見圖1A；組織鈣含量結(jié)果顯示，CRF+VC 組鈣含量顯著增加（P＜0.05），見圖1B；相關(guān)分析結(jié)果顯示，Runx2與血管鈣化呈顯著正相關(guān)（r=0.971，P＜0.05），見圖1C。

Figure 1.Vascular calcification and Runx2 expression.A：silver nitrate staining（black）and Runx2 immunohistochemical staining（brown），scale bar=20 μm；B：tissue calcium content determination；C：Runx2 and calcium content correlation analysis.Mean±SD. n=6.**P＜0.05 vs sham group.圖1 血管組織鈣化及Runx2表達(dá)情況

2 HP對(duì)大鼠VSMCs鈣化的影響

2.1 VSMCs 茜素紅染色及鈣含量測(cè)定 茜素紅染色顯示，與N 組比較，HP 組茜素紅染色橘紅色鈣節(jié)明顯增多，見圖2A；鈣含量測(cè)定結(jié)果顯示，HP 組VSMCs鈣含量顯著升高（P＜0.05），見圖2B。

2.2 HP 對(duì)大鼠 VSMCs 中 Runx2 表達(dá)和 ALP 活性的影響 RT-qPCR 和 Western blot 結(jié)果顯示，與 N 組比較，HP組大鼠VSMCs中Runx2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），見圖3A、B；ALP 活性測(cè)定結(jié)果顯示，HP 組大鼠 VSMCs 中 ALP 活性較 N 組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），見圖3C。

2.3 HP對(duì)大鼠VSMCs中miR-30b表達(dá)的影響 RT-qPCR 結(jié)果顯示，與 N 組比較，HP 組大鼠 VSMCs 中miR-30b的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖4。

3 miR-30b對(duì)HP誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化的影響

3.1 轉(zhuǎn)染mimic-30b 后miR-30b 的表達(dá)情況 RT-qPCR 結(jié) 果 顯 示 ，與 HP 組 和 mimic-NC 組 比 較 ，mimic-30b 組大鼠 VSMCs 中 miR-30b 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

Figure 2.Calcification of the vascular smooth muscle cells in the 2 groups.A：alizarin red staining of VSMCs after high phosphorus（HP）induction（scale bar=200μm）；B：calcium content determination.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal（N）group.圖2 兩組血管平滑肌細(xì)胞鈣化情況

Figure 3.The mRNA（A）and protein（B）expression of Runx2，and ALP activity（C）in the vascular smooth muscle cells of the 2 groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs N group.圖3 兩組血管平滑肌細(xì)胞Runx2表達(dá)和ALP活性測(cè)定

Figure 4.Expression of miR-30b in vascular smooth muscle cells of the 2 groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs N group.圖4 兩組血管平滑肌細(xì)胞的miR-30b的表達(dá)

Figure 5.Expression of miR-30b in the vascular smooth muscle cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs HP group；#P＜0.05 vs mimic-NC group.圖5 各組血管平滑肌細(xì)胞miR-30b的表達(dá)

3.2 miR-30b 對(duì)大鼠VSMCs 茜素紅染色及鈣含量的影響 茜素紅染色顯示，與HP 組和mimic-NC 組比較，mimic-30b 組橘紅色鈣結(jié)節(jié)顯著減少，見圖6A；鈣含量測(cè)定結(jié)果顯示，mimic-30b組鈣含量較HP組和mimic-NC組顯著降低（P＜0.05），見圖6B。

Figure 6.Effect of miR-30b on calcification of vascular smooth muscle cells.A：alizarin red staining of VSMCs after transfection with mimic-30b（scale bar=200 μm）；B：calcium content determination.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs HP group；#P＜0.05 vs mimic-NC group.圖6 miR-30b對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響

3.3 miR-30b對(duì)大鼠VSMCs中Runx2表達(dá)和ALP活性的影響 RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與HP組和 mimic-NC 組比較，mimic-30b 組大鼠 VSMCs 中Runx2 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖7A、B；ALP 活性測(cè)定結(jié)果顯示，與HP組和mimic-NC組比較，mimic-30b組ALP活性顯著降低（P＜0.05），見圖7C。

Figure 7.The mRNA（A）and protein（B）expression of Runx2，and ALP activity（C）in the vascular smooth muscle cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs HP group；#P＜0.05 vs mimic-NC group.圖7 各組血管平滑肌細(xì)胞Runx2表達(dá)和ALP活性測(cè)定

討 論

高磷血癥是導(dǎo)致血管中膜鈣化的重要危險(xiǎn)因素［12］，VSMCs 是血管中膜的重要組成成分。研究表明，VSMCs 的表型轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致VSMCs 鈣化發(fā)生的重要機(jī)制之一［5］。本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠原代VSMCs，探究HP 誘導(dǎo)的大鼠VSMCs 鈣化的發(fā)生機(jī)制。結(jié)果顯示HP可誘導(dǎo)大鼠VSMCs鈣化，可能是通過抑制miR-30b 表達(dá)、促進(jìn)大鼠VSMCs 表型轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的。

Runx2是血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，而ALP 是血管鈣化發(fā)生的經(jīng)典生物標(biāo)志物［5］。在成骨/軟骨細(xì)胞樣表型的VSMCs 中，成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2 和礦化調(diào)節(jié)蛋白 ALP 表達(dá)上調(diào)［13］。本研究構(gòu)建大鼠鈣化模型，發(fā)生鈣化的大鼠血管組織Runx2表達(dá)升高，且Runx2 表達(dá)與血管鈣化顯著相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HP 在血管鈣化中的作用，給予HP 刺激，驗(yàn)證了HP 可以促進(jìn)大鼠VSMCs 的表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而引起細(xì)胞鈣化。

研究顯示miR-30s、miR-204、miR-141等miRNAs參與血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化和血管重塑，同時(shí)在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化過程中也有miRNAs 參與，這意味著miRNAs 參與了VSMCs 介導(dǎo)的血管鈣化［14-15］。Balderman 等［16］報(bào)道了在骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2誘導(dǎo)人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞VC 過程中miR-30b 的表達(dá)降低，并且miR 微陣列和靶預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫分析表明miR-30b 可以調(diào)控Runx2 表達(dá)。本研究顯示給予HP刺激大鼠VSMCs 后，miR-30b 的表達(dá)下降，由此可見，HP 抑制miR-30b 的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證HP 條件下miR-30b 對(duì)大鼠VSMCs 的影響，在HP 誘導(dǎo)條件下給予細(xì)胞過表達(dá)miR-30b，以探討miR-30b 對(duì)于HP誘導(dǎo)的VSMCs鈣化的緩解作用。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-30b 的類似物后鈣化減少，且Runx2 表達(dá)和ALP活性降低。進(jìn)一步說明了HP 條件下，過表達(dá)miR-30b 可抑制 Runx2 表達(dá)，對(duì) HP 誘導(dǎo)的大鼠 VSMCs 鈣化起到緩解作用。

綜上所述，HP可以通過抑制miR-30b表達(dá)，促進(jìn)Runx2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)大鼠VSMCs鈣化的發(fā)生。