蔣思怦, 張 瑞, 李曉歌, 張 榮, 郭東銘, 袁中華
(南華大學心血管疾病研究所,動脈硬化學湖南省重點實驗室,湖南省動脈硬化性疾病國際科技創(chuàng)新合作基地,湖南衡陽421001)
動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)病機制復雜,至今未被完全闡明,其中脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應被廣泛認為是誘導AS 發(fā)生發(fā)展的原因。低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)經(jīng)氧化修飾[氧化LDL(oxidized LDL,ox-LDL)]后被巨噬細胞所吞噬,轉(zhuǎn)化為泡沫細胞,大量堆積在血管內(nèi)皮下,促進動脈粥樣斑塊的形成與發(fā)展[1]。脂滴包被蛋白2(perilipin 2,PLIN2)是圍繞在細胞內(nèi)脂滴表面的主要脂滴相關(guān)蛋白之一,高表達在泡沫細胞中[2-3],對脂滴的合成和降解起著重要的作用,可作為脂質(zhì)蓄積的標志。大量研究表明,PLIN2 具有一定的促進AS作用[4],但其具體機制尚未闡明。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋 白(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)是一類可激活涉及膽固醇、甘油三酯等生物合成及脂質(zhì)代謝所需酶轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子超家族,其中SREBP2廣泛存在于各種組織,主要參與膽固醇代謝酶轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞動態(tài)的膜細胞器,一旦受到有害因素(如饑餓、病毒感染等)侵襲,大量的錯誤折疊及未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)募集,將誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。新近研究表明,PLIN2敲除小鼠的ERS 受到顯著抑制,同時肝臟中SREBPs 活性降低,血清脂質(zhì)蓄積水平減少,SREBP2 表達降低[6],提示 PLIN2 與ERS 和SREBP2 活性具有密切聯(lián)系。我們前期研究顯示,PLIN2 可以促進巨噬細胞中脂滴聚積[7]。因此,本研究旨在探討PLIN2 是否通過影響ERS 調(diào)控SREBP2的表達,從而影響巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。
RAW264.7小鼠單核/巨噬細胞白血病細胞來自上海生科院細胞生物學研究所。RPMI1640 培養(yǎng)液(蘇州巨能世紀公司);新生胎牛血清(杭州四季青公司);ox-LDL(廣州奕源公司);游離膽固醇(free cholesterol,F(xiàn)C)檢測試劑盒(Applygen);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒(上海貝博生物科技有限公司);無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Omega Bio-tek);SYBR Green 和Trizol(TIANGEN);4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA;北京索萊寶公司);Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑(上海碧云天公司);油紅O(北京鼎國昌盛公司);鼠抗3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase,HMGCR)Ⅰ抗(武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司);鼠抗β-actin Ⅰ抗,兔抗PLIN2、SREBP2 和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)Ⅰ抗,山羊抗鼠/抗兔IgG Ⅱ抗(Proteintech);其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)設(shè)計合成,見表1。
表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR
2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 將RAW264.7 細胞置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天換液,當細胞貼壁率達到75%時傳代。實驗分為4 步。實驗一:細胞經(jīng) ox-LDL 處理不同時間(0、6、12、24 和48 h),構(gòu)建泡沫細胞模型[8]。實驗二:(1)PLIN2 過表達實驗,分為 PLIN2-Con 組(將 pQCXIP 轉(zhuǎn)染入細胞)、PLIN2-Con+ox-LDL 組、HA-PLIN2 組(將 pQCXIP-HAAdipophilin 轉(zhuǎn)染入細胞)和 HA-PLIN2+ox-LDL 組;(2)PLIN2沉默實驗,分為siRNA-Con 組(將pSuperscramble siRNA 轉(zhuǎn)染入細胞)、siRNA-PLIN2 組(將pSuper-Adipophilin siRNA 轉(zhuǎn)染入細胞)、siRNAPLIN2+ox-LDL 組和 siRNA-Con+ox-LDL 組。實驗三:分為HA-PLIN2 組及siRNA-PLIN2 組。實驗四:ERS抑制劑4-PBA 處理實驗,分為control 組(空白對照組)、ox-LDL組、4-PBA組和ox-LDL+4-PBA組。
2.2 提取與鑒定質(zhì)粒 將含pQCXIP、pQCXIP-HAPLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 質(zhì)粒的菌液解凍混勻,接種在含氨芐西林的瓊脂培養(yǎng)基上,在細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~16 h后挑出陽性單菌落置于含氨芐西林的LC 培養(yǎng)液中,37℃搖床震蕩18~24 h(220 r/min)。取一部分菌液提取質(zhì)粒并通過AGE 鑒定,余下已鑒定的菌液再劃板挑取陽性單菌落接種于200 mL的LC培養(yǎng)液中,通過質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,使用紫外分光光度計測量質(zhì)粒的濃度。
2.3 轉(zhuǎn)染pQCXIP、pQCXIP-HA-PLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 入 RAW264.7細胞 轉(zhuǎn)染前1 d 將RAW264.7 細胞接種于6 孔板中,后放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。用250 μL 的DMEM 培養(yǎng)液稀釋上面提取的pQCXIP、pQCXIPHA-PLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 質(zhì)粒(各 4 μg),并用 250 μL DMEM 培養(yǎng)液稀釋10 μL Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑,均在室溫下靜置5 min 混勻,后又置于室溫中20 min,將混勻液均勻加入6 孔板中。再于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6 h 后換為含10%胎牛血清的PRMI-1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),1~2 d后可通過Western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染效果。
2.4 Western blot 實驗 將收集好的未處理的RAW264.7 細胞或經(jīng)轉(zhuǎn)染后的RAW264.7 細胞中加入細胞裂解混合液冰上裂解,提取總蛋白。使用BCA 試劑盒對蛋白定量。制備10%分離膠和5%濃縮膠,蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至PDVF 膜上;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后經(jīng)脫脂牛奶封閉,后分別加入相應Ⅰ抗,搖床震蕩孵育6~8 h(4℃過夜);接著加入對應的Ⅱ抗,搖床搖動孵育2 h(室溫),開始顯影。
2.5 油紅O 染色 配制油紅O 工作液(油紅O 儲存液∶雙蒸水=6∶4),使用4%多聚甲醛(30 min)固定細胞后使用 PBS 洗滌 3 次,每次 10 min;將油紅 O 染液加入24 孔板中,每孔至少1 mL,1 h 后吸出染液,PBS再洗滌3次,每次10 min;后用蘇木素染核5 s,最后用PBS洗滌3次。在顯微鏡下拍片并保存。
2.6 細胞免疫熒光 使用4%多聚甲醛(30 min)固定細胞,PBS清洗3次;使用0.1%Trition X-100(每孔300~500 μL)處理24 孔板中的細胞15~30 min,PBS清洗 3 次,每次 5 min;使用 300~500 μL 的 10% 胎牛血清封閉1 h 后孵育對應的Ⅰ抗(4℃過夜),PBS 清洗3 次,每次5 min;接著Ⅱ抗孵育(常溫),PBS 清洗3 次,每次 5 min;使用 1 mg/L 的 DAPI 染核 30 min,PBS 清洗3 次,每次5 min;最后使用抗熒光淬滅劑進行封片,在熒光顯微鏡下拍攝并保存。
2.7 細胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分中FC 的測定 (1)提取細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng):細胞懸浮后1 000×g離心10 min,丟棄上清液;加入500 μL 試劑A 后放于冰上10 min,將勻漿在 1 000×g和 11 000×g(4℃)下分別離心5 min 和10 min,收集上清液;后于30 000×g(4℃)條件下離心 45 min,收集沉淀;加入 400 μL 的試劑 B 在30 000×g(4℃)下再次離心45 min,收集的沉淀即為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品。(2)檢測FC:在培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)瓶和制備的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分中分別加入150 和100 μL 的裂解混合液,2 000×g離心5 min 后收集30 μL 上清液,余下裂解液使用BCA 法進行蛋白定量;將5 nmol/L 膽固醇標準品以無水乙醇稀釋后設(shè)置濃度梯度;96 孔板中每孔加入190 μL R1+R2 工作液(R1∶R2=4∶1),后每孔分別加入10 μL標準品、空白對照溶液或待測樣品(37℃,20 min);使用酶標儀測量每孔吸光度(A),繪出標準曲線,根據(jù)標準曲線測出膽固醇濃度,再用蛋白濃度進行校正。
2.8 RT-qPCR 實驗 收集各組細胞,按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA,去除其中混雜的DNA 及DNase,逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,合成第 1 鏈 cDNA 采用20 μL 體系,反應程序為:42℃ 15 min,95℃ 3 min。50 μL 兩步法 PCR 程序為:95℃ 15 min;95℃ 10 s,56℃ 20 s,72℃ 25 s,40 個循環(huán)。以 β-actin 為內(nèi)參照,用2-ΔΔCt法計算SREBP2 mRNA的相對表達量。
采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行制圖和統(tǒng)計分析。結(jié)果均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
Western blot 實驗結(jié)果顯示,24 h 內(nèi),ox-LDL 呈時間依賴性增加PLIN2 和SREBP2 表達水平(P<0.05),但 24 h 后 SREBP2 蛋白水平開始降低,見圖1;同時24 h后出現(xiàn)細胞死亡、偽足增多現(xiàn)象,見圖2。因此,本研究選擇ox-LDL孵育細胞時間為24 h。
Western blot 及 RT-qPCR 實驗結(jié)果顯示,與PLIN2-Con 組相比,HA-PLIN2 組 PLIN2 和 SREBP2的mRNA 和蛋白水平及HMGCR 的蛋白水平顯著上升(P<0.05);與 PLIN2-Con+ox-LDL 組相比,HAPLIN2+ox-LDL 組 PLIN2 和 SREBP2 的 mRNA 和蛋白水平及HMGCR 的蛋白水平顯著增加(P<0.05),圖3A 及圖4A、B。與siRNA-Con 組相比,siRNA-PLIN2組PLIN2和SREBP2 的mRNA 和蛋白水平及HMGCR的蛋白水平顯著降低(P<0.05);與siRNA-Con+ox-LDL 組相比,敲減PLIN2可顯著逆轉(zhuǎn) ox-LDL 誘導的SREBP2 mRNA和蛋白水平及HMGCR蛋白水平的升高(P<0.05),見圖3B及圖4C、D。
Figure 1.Western blot was used to determine the protein levels of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages exposed to ox-LDL for different time(0,6,12,24 and 48 h).Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 h.圖1 ox-LDL處理不同時間對PLIN2和SREBP2蛋白表達的影響
Figure 2.Micrograph of RAW264.7 macrophages cultured with ox-LDL for different time(A:0 h;B:24 h;C:48 h).The death of the cells increased after ox-LDL treatment for 24 h.The scale bar=100 μm.圖2 ox-LDL處理不同時間后細胞的形態(tài)
油紅O 染色結(jié)果顯示,HA-PLIN2+ox-LDL 組較ox-LDL 組脂質(zhì)蓄積增加,而 siRNA-PLIN2+ox-LDL 組較ox-LDL組脂質(zhì)蓄積減少,見圖5。
FC檢測結(jié)果顯示,與siRNA-PLIN2+ox-LDL組相比,HA-PLIN2+ox-LDL組細胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的FC含量均顯著增加(P<0.05),見圖6。
Western blot結(jié)果顯示,HA-PLIN2組細胞內(nèi)GRP78表達較siRNA-PLIN2組顯著增加(P<0.05),見圖7。
免疫熒光結(jié)果顯示,與control 組相比,siRNAPLIN2組綠色熒光主要分布于細胞質(zhì),在核內(nèi)很少表達,而HA-PLIN2組細胞核內(nèi)出現(xiàn)強熒光,見圖8。
Western blot 實驗結(jié)果顯示,4-PBA 組 GRP78、SREBP2 和HMGCR 蛋白水平較control 組顯著降低(P<0.05);與 ox-LDL 組 相比 ,4-PBA+ox-LDL 組GRP78、SREBP2 和HMGCR 蛋白水平顯著降低(P<0.05),見圖9。
RT-qPCR 實驗結(jié)果顯示,4-PBA 組 SREBP2 的mRNA 水平較control 組降低(P<0.05);與 ox-LDL 組相比,4-PBA+ox-LDL 組SREBP2 mRNA 水平顯著降低(P<0.05),見圖10。
隨著人民生活的日益提高,AS源性心血管疾病的發(fā)病率逐年增加,嚴重威脅著人們身心健康。但AS發(fā)病機制復雜,其中脂質(zhì)代謝異常是導致AS發(fā)生發(fā)展的主要因素之一[9]。相關(guān)研究表明,PLIN2能夠增加巨噬細胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇酯含量,抑制膽固醇流出,促進膽固醇蓄積及泡沫細胞形成[7,10]。同時也有報道證實,在AS 斑塊區(qū)域,PLIN2 表達顯著增加[11],提示PLIN2 可能通過促進泡沫細胞形成進而影響AS 發(fā)生發(fā)展。但是PLIN2 調(diào)節(jié)脂質(zhì)蓄積的具體機制仍不明確。本研究表明,PLIN2 能夠通過ERS 調(diào)控 SREBP2 表達和活性,促進 HMGCR 表達和膽固醇合成,進而誘導巨噬細胞脂質(zhì)蓄積。
Figure 3.Effects of PLIN2 on the protein levels of SREBP2 and HMGCR.A:the RAW264.7 macrophages were transfected with pQCXIP or pQCXIP-HA-PLIN2 for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h;B:the RAW264.7 macrophages were transfected with pSuper-scramble siRNA or pSuper-retro-PLIN2 siRNA for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs PLIN2-Con group;#P<0.05 vs HA-PLIN2 group;&P<0.05 vs ox-LDL group;▲P<0.05 vs siRNA-Con group;△P<0.05 vs siRNA-PLIN2 group;☆P<0.05 vs siRNA-Con+ox-LDL group.圖3 PLIN2對SREBP2和HMGCR蛋白表達的影響
Figure 4.Effects of PLIN2 on the mRNA expression of SREBP2.A,B:the mRNA expression of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages transfected with pQCXIP or pQCXIP-HA-PLIN2 for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h;C,D:the mRNA expression of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages transfected with pSuper-scramble siRNA or pSuper-retro-PLIN2 siRNA for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs PLIN2-Con group;#P<0.05 vs HA-PLIN2 group;&P<0.05 vs ox-LDL group;▲P<0.05 vs siRNA-Con group;△P<0.05 vs siRNAPLIN2 group;☆P<0.05 vs siRNA-Con+ox-LDL group.圖4 PLIN2對SREBP2 mRNA表達的影響
Figure 5.Lipid droplets in RAW264.7 macrophages detected by oil red O staining.The scale bar=50 μm.圖5 油紅O染色觀察PLIN2對脂滴變化的影響
既往研究表明,細胞內(nèi)膽固醇豐富時,SREBPs錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng);但細胞膽固醇水平較低時,SREBPs被site-1 及site-2 蛋白酶切割并釋放,轉(zhuǎn)移至細胞核與LDL 受體或HMGCR 合成酶的基因操縱子結(jié)合并促進其表達[5,12]。其中,SREBP2 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作為膜結(jié)合蛋白,可通過蛋白酶水解后釋放N 端結(jié)構(gòu)域進入細胞核,與固醇反應元件結(jié)合,激活SREBP2 靶基因HMGCR的轉(zhuǎn)錄,進而促進細胞內(nèi)膽固醇合成。Vergnes 等[13]發(fā) 現(xiàn),在 小鼠 胚胎 中 敲除SREBP2,HMGCR 表達水平顯著降低,膽固醇的生物合成減少。新近研究報道,在小鼠中敲除PLIN2能夠降低SREBP2 表達,抑制其活性,減少脂質(zhì)蓄積[6],提示PLIN2 與SREBP2 存在相互作用,但其具體機制尚不明確。本研究顯示,在RAW246.7 細胞中過表達PLIN2,能夠促進并激活 SREBP2,增加SREBP2 核移位,上調(diào)HMGCR 表達,提高細胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上FC水平,導致細胞脂質(zhì)蓄積;降低PLIN2 水平則出現(xiàn)相反的結(jié)果。這說明PLIN2 可通過激活SREBP2 增加HMGCR 的表達,促進細胞內(nèi)膽固醇合成進而引起細胞脂質(zhì)蓄積。
Figure 6.Effects of PLIN2 on intracellular free cholesterol content(A)and free cholesterol content in endoplasmic reticulum(B).Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs siRNA-PLIN2+Ox-LDL group.圖6 PLIN2對細胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上游離膽固醇含量的影響
Figure 7.Effects of PLIN2 on the protein level of GRP78 detected by Western blot.Mean±SD. n=3.#P<0.05 vs HA-PLIN2 group.圖7 PLIN2對GRP78蛋白水平的影響
Figure 8.Effects of PLIN2 on the nuclear translocation of SREBP2 detected by immunofluorescence staining.PLIN2 was visualized by FITC-conjugated Affinipure(green),and nuclei were stained with DAPI(blue).The scale bar=50 μm.圖8 PLIN2對SREBP2核轉(zhuǎn)位的影響
Figure 9.Effects of 4-PBA on the protein levels of GRP78,SREBP2 and HMGCR in each group detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs 4-PBA group;△P<0.05 vs ox-LDL group.圖9 4-PBA對GRP78、SREBP2和HMGCR蛋白水平的影響
Figure 10.Effects of 4-PBA on the mRNA expression of SREBP2 in each group detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs 4-PBA group;△P<0.05 vs ox-LDL group.圖10 4-PBA處理后對SREBP2 mRNA表達的影響
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)膽固醇含量的重要細胞器[14],通過感知細胞內(nèi)膽固醇含量而調(diào)節(jié)胞內(nèi)膽固醇水平[15]。ERS 發(fā)生能夠促進膽固醇負荷,增加脂質(zhì)蓄積和泡沫細胞形成,說明ERS 與AS 發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系[16-17]。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白,在調(diào)節(jié)ERS的動態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是ERS的標志[18]。ERS發(fā)生時,ERS 相關(guān)蛋白 GRP78 與 SREBP 裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)-SREBP復合物分離,激活SREBP2,促進其發(fā)揮生物活性[19]。此外,Chen 等[20]觀察到 PLIN2 在胰腺 β 細胞中可參與ERS 調(diào)節(jié)。由此我們猜想,PLIN2 可能通過ERS調(diào)控SREBP2 從而影響RAW264.7 巨噬細胞脂質(zhì)蓄積。本研究表明,過表達PLIN2 能促進GRP78 表達,說明過表達PLIN2 能夠引起ERS 的發(fā)生。ERS 特異性抑制劑 4-PBA 降低 SREBP2 及 HMGCR 表達,進一步表明PLIN2可通過ERS 影響SREBP2活性,從而調(diào)控RAW264.7細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。
綜上所述,PLIN2可促進RAW264.7細胞脂質(zhì)蓄積,其機制是其誘導ERS的發(fā)生,激活SREBP2,從而促進脂質(zhì)蓄積。但鑒于本工作是以RAW264.7 巨噬細胞為研究對象進行的體外細胞實驗,與臨床疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的區(qū)別,因此在AS 發(fā)展中PLIN2 對SREBP2的具體作用機制仍有待進一步研究。