蔣思怦， 張 瑞， 李曉歌， 張 榮， 郭東銘， 袁中華

（南華大學心血管疾病研究所，動脈硬化學湖南省重點實驗室，湖南省動脈硬化性疾病國際科技創(chuàng)新合作基地，湖南衡陽421001）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)病機制復雜，至今未被完全闡明，其中脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應被廣泛認為是誘導AS 發(fā)生發(fā)展的原因。低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）經(jīng)氧化修飾［氧化LDL（oxidized LDL，ox-LDL）］后被巨噬細胞所吞噬，轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，大量堆積在血管內(nèi)皮下，促進動脈粥樣斑塊的形成與發(fā)展［1］。脂滴包被蛋白2（perilipin 2，PLIN2）是圍繞在細胞內(nèi)脂滴表面的主要脂滴相關(guān)蛋白之一，高表達在泡沫細胞中［2-3］，對脂滴的合成和降解起著重要的作用，可作為脂質(zhì)蓄積的標志。大量研究表明，PLIN2 具有一定的促進AS作用［4］，但其具體機制尚未闡明。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋 白（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）是一類可激活涉及膽固醇、甘油三酯等生物合成及脂質(zhì)代謝所需酶轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子超家族，其中SREBP2廣泛存在于各種組織，主要參與膽固醇代謝酶轉(zhuǎn)錄的調(diào)控［5］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞動態(tài)的膜細胞器，一旦受到有害因素（如饑餓、病毒感染等）侵襲，大量的錯誤折疊及未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)募集，將誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。新近研究表明，PLIN2敲除小鼠的ERS 受到顯著抑制，同時肝臟中SREBPs 活性降低，血清脂質(zhì)蓄積水平減少，SREBP2 表達降低［6］，提示 PLIN2 與ERS 和SREBP2 活性具有密切聯(lián)系。我們前期研究顯示，PLIN2 可以促進巨噬細胞中脂滴聚積［7］。因此，本研究旨在探討PLIN2 是否通過影響ERS 調(diào)控SREBP2的表達，從而影響巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

材 料 和 方 法

1 主要材料

RAW264.7小鼠單核/巨噬細胞白血病細胞來自上海生科院細胞生物學研究所。RPMI1640 培養(yǎng)液（蘇州巨能世紀公司）；新生胎牛血清（杭州四季青公司）；ox-LDL（廣州奕源公司）；游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）檢測試劑盒（Applygen）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Omega Bio-tek）；SYBR Green 和Trizol（TIANGEN）；4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA；北京索萊寶公司）；Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑（上海碧云天公司）；油紅O（北京鼎國昌盛公司）；鼠抗3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR）Ⅰ抗（武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司）；鼠抗β-actin Ⅰ抗，兔抗PLIN2、SREBP2 和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）Ⅰ抗，山羊抗鼠/抗兔IgG Ⅱ抗（Proteintech）；其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司根據(jù)設(shè)計合成，見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 將RAW264.7 細胞置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，當細胞貼壁率達到75%時傳代。實驗分為4 步。實驗一：細胞經(jīng) ox-LDL 處理不同時間（0、6、12、24 和48 h），構(gòu)建泡沫細胞模型［8］。實驗二：（1）PLIN2 過表達實驗，分為 PLIN2-Con 組（將 pQCXIP 轉(zhuǎn)染入細胞）、PLIN2-Con+ox-LDL 組、HA-PLIN2 組（將 pQCXIP-HAAdipophilin 轉(zhuǎn)染入細胞）和 HA-PLIN2+ox-LDL 組；（2）PLIN2沉默實驗，分為siRNA-Con 組（將pSuperscramble siRNA 轉(zhuǎn)染入細胞）、siRNA-PLIN2 組（將pSuper-Adipophilin siRNA 轉(zhuǎn)染入細胞）、siRNAPLIN2+ox-LDL 組和 siRNA-Con+ox-LDL 組。實驗三：分為HA-PLIN2 組及siRNA-PLIN2 組。實驗四：ERS抑制劑4-PBA 處理實驗，分為control 組（空白對照組）、ox-LDL組、4-PBA組和ox-LDL+4-PBA組。

2.2 提取與鑒定質(zhì)粒 將含pQCXIP、pQCXIP-HAPLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 質(zhì)粒的菌液解凍混勻，接種在含氨芐西林的瓊脂培養(yǎng)基上，在細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h后挑出陽性單菌落置于含氨芐西林的LC 培養(yǎng)液中，37℃搖床震蕩18～24 h（220 r/min）。取一部分菌液提取質(zhì)粒并通過AGE 鑒定，余下已鑒定的菌液再劃板挑取陽性單菌落接種于200 mL的LC培養(yǎng)液中，通過質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，使用紫外分光光度計測量質(zhì)粒的濃度。

2.3 轉(zhuǎn)染pQCXIP、pQCXIP-HA-PLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 入 RAW264.7細胞 轉(zhuǎn)染前1 d 將RAW264.7 細胞接種于6 孔板中，后放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。用250 μL 的DMEM 培養(yǎng)液稀釋上面提取的pQCXIP、pQCXIPHA-PLIN2、pSuper-scramble siRNA 和 pSuper-retro-PLIN2 siRNA 質(zhì)粒（各 4 μg），并用 250 μL DMEM 培養(yǎng)液稀釋10 μL Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑，均在室溫下靜置5 min 混勻，后又置于室溫中20 min，將混勻液均勻加入6 孔板中。再于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h 后換為含10%胎牛血清的PRMI-1640 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，1～2 d后可通過Western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染效果。

2.4 Western blot 實驗 將收集好的未處理的RAW264.7 細胞或經(jīng)轉(zhuǎn)染后的RAW264.7 細胞中加入細胞裂解混合液冰上裂解，提取總蛋白。使用BCA 試劑盒對蛋白定量。制備10%分離膠和5%濃縮膠，蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至PDVF 膜上；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后經(jīng)脫脂牛奶封閉，后分別加入相應Ⅰ抗，搖床震蕩孵育6～8 h（4℃過夜）；接著加入對應的Ⅱ抗，搖床搖動孵育2 h（室溫），開始顯影。

2.5 油紅O 染色 配制油紅O 工作液（油紅O 儲存液∶雙蒸水=6∶4），使用4%多聚甲醛（30 min）固定細胞后使用 PBS 洗滌 3 次，每次 10 min；將油紅 O 染液加入24 孔板中，每孔至少1 mL，1 h 后吸出染液，PBS再洗滌3次，每次10 min；后用蘇木素染核5 s，最后用PBS洗滌3次。在顯微鏡下拍片并保存。

2.6 細胞免疫熒光 使用4%多聚甲醛（30 min）固定細胞，PBS清洗3次；使用0.1%Trition X-100（每孔300～500 μL）處理24 孔板中的細胞15～30 min，PBS清洗 3 次，每次 5 min；使用 300～500 μL 的 10% 胎牛血清封閉1 h 后孵育對應的Ⅰ抗（4℃過夜），PBS 清洗3 次，每次5 min；接著Ⅱ抗孵育（常溫），PBS 清洗3 次，每次 5 min；使用 1 mg/L 的 DAPI 染核 30 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；最后使用抗熒光淬滅劑進行封片，在熒光顯微鏡下拍攝并保存。

2.7 細胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分中FC 的測定 （1）提取細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：細胞懸浮后1 000×g離心10 min，丟棄上清液；加入500 μL 試劑A 后放于冰上10 min，將勻漿在 1 000×g和 11 000×g（4℃）下分別離心5 min 和10 min，收集上清液；后于30 000×g（4℃）條件下離心 45 min，收集沉淀；加入 400 μL 的試劑 B 在30 000×g（4℃）下再次離心45 min，收集的沉淀即為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品。（2）檢測FC：在培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)瓶和制備的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分中分別加入150 和100 μL 的裂解混合液，2 000×g離心5 min 后收集30 μL 上清液，余下裂解液使用BCA 法進行蛋白定量；將5 nmol/L 膽固醇標準品以無水乙醇稀釋后設(shè)置濃度梯度；96 孔板中每孔加入190 μL R1+R2 工作液（R1∶R2=4∶1），后每孔分別加入10 μL標準品、空白對照溶液或待測樣品（37℃，20 min）；使用酶標儀測量每孔吸光度（A），繪出標準曲線，根據(jù)標準曲線測出膽固醇濃度，再用蛋白濃度進行校正。

2.8 RT-qPCR 實驗 收集各組細胞，按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，去除其中混雜的DNA 及DNase，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，合成第 1 鏈 cDNA 采用20 μL 體系，反應程序為：42℃ 15 min，95℃ 3 min。50 μL 兩步法 PCR 程序為：95℃ 15 min；95℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 25 s，40 個循環(huán)。以 β-actin 為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計算SREBP2 mRNA的相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行制圖和統(tǒng)計分析。結(jié)果均以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 ox-LDL 處理不同時間對SREBP2和PLIN2蛋白水平的影響

Western blot 實驗結(jié)果顯示，24 h 內(nèi)，ox-LDL 呈時間依賴性增加PLIN2 和SREBP2 表達水平（P＜0.05），但 24 h 后 SREBP2 蛋白水平開始降低，見圖1；同時24 h后出現(xiàn)細胞死亡、偽足增多現(xiàn)象，見圖2。因此，本研究選擇ox-LDL孵育細胞時間為24 h。

2 PLIN2對SREBP2和HMGCR 表達、脂質(zhì)蓄積及FC含量的影響

Western blot 及 RT-qPCR 實驗結(jié)果顯示，與PLIN2-Con 組相比，HA-PLIN2 組 PLIN2 和 SREBP2的mRNA 和蛋白水平及HMGCR 的蛋白水平顯著上升（P＜0.05）；與 PLIN2-Con+ox-LDL 組相比，HAPLIN2+ox-LDL 組 PLIN2 和 SREBP2 的 mRNA 和蛋白水平及HMGCR 的蛋白水平顯著增加（P＜0.05），圖3A 及圖4A、B。與siRNA-Con 組相比，siRNA-PLIN2組PLIN2和SREBP2 的mRNA 和蛋白水平及HMGCR的蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與siRNA-Con+ox-LDL 組相比，敲減PLIN2可顯著逆轉(zhuǎn) ox-LDL 誘導的SREBP2 mRNA和蛋白水平及HMGCR蛋白水平的升高（P＜0.05），見圖3B及圖4C、D。

Figure 1.Western blot was used to determine the protein levels of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages exposed to ox-LDL for different time（0，6，12，24 and 48 h）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 h.圖1 ox-LDL處理不同時間對PLIN2和SREBP2蛋白表達的影響

Figure 2.Micrograph of RAW264.7 macrophages cultured with ox-LDL for different time（A：0 h；B：24 h；C：48 h）.The death of the cells increased after ox-LDL treatment for 24 h.The scale bar=100 μm.圖2 ox-LDL處理不同時間后細胞的形態(tài)

油紅O 染色結(jié)果顯示，HA-PLIN2+ox-LDL 組較ox-LDL 組脂質(zhì)蓄積增加，而 siRNA-PLIN2+ox-LDL 組較ox-LDL組脂質(zhì)蓄積減少，見圖5。

FC檢測結(jié)果顯示，與siRNA-PLIN2+ox-LDL組相比，HA-PLIN2+ox-LDL組細胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的FC含量均顯著增加（P＜0.05），見圖6。

3 PLIN2 對 GRP78 蛋白水平及 SREBP2 核移位 的影響

Western blot結(jié)果顯示，HA-PLIN2組細胞內(nèi)GRP78表達較siRNA-PLIN2組顯著增加（P＜0.05），見圖7。

免疫熒光結(jié)果顯示，與control 組相比，siRNAPLIN2組綠色熒光主要分布于細胞質(zhì)，在核內(nèi)很少表達，而HA-PLIN2組細胞核內(nèi)出現(xiàn)強熒光，見圖8。

4 ERS抑制劑4-PBA對GRP78、SREBP2和HMGCR表達的影響

Western blot 實驗結(jié)果顯示，4-PBA 組 GRP78、SREBP2 和HMGCR 蛋白水平較control 組顯著降低（P＜0.05）；與 ox-LDL 組 相比 ，4-PBA+ox-LDL 組GRP78、SREBP2 和HMGCR 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖9。

RT-qPCR 實驗結(jié)果顯示，4-PBA 組 SREBP2 的mRNA 水平較control 組降低（P＜0.05）；與 ox-LDL 組相比，4-PBA+ox-LDL 組SREBP2 mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），見圖10。

討 論

隨著人民生活的日益提高，AS源性心血管疾病的發(fā)病率逐年增加，嚴重威脅著人們身心健康。但AS發(fā)病機制復雜，其中脂質(zhì)代謝異常是導致AS發(fā)生發(fā)展的主要因素之一［9］。相關(guān)研究表明，PLIN2能夠增加巨噬細胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇酯含量，抑制膽固醇流出，促進膽固醇蓄積及泡沫細胞形成［7，10］。同時也有報道證實，在AS 斑塊區(qū)域，PLIN2 表達顯著增加［11］，提示PLIN2 可能通過促進泡沫細胞形成進而影響AS 發(fā)生發(fā)展。但是PLIN2 調(diào)節(jié)脂質(zhì)蓄積的具體機制仍不明確。本研究表明，PLIN2 能夠通過ERS 調(diào)控 SREBP2 表達和活性，促進 HMGCR 表達和膽固醇合成，進而誘導巨噬細胞脂質(zhì)蓄積。

Figure 3.Effects of PLIN2 on the protein levels of SREBP2 and HMGCR.A：the RAW264.7 macrophages were transfected with pQCXIP or pQCXIP-HA-PLIN2 for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h；B：the RAW264.7 macrophages were transfected with pSuper-scramble siRNA or pSuper-retro-PLIN2 siRNA for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PLIN2-Con group；#P＜0.05 vs HA-PLIN2 group；&P＜0.05 vs ox-LDL group；▲P＜0.05 vs siRNA-Con group；△P＜0.05 vs siRNA-PLIN2 group；☆P＜0.05 vs siRNA-Con+ox-LDL group.圖3 PLIN2對SREBP2和HMGCR蛋白表達的影響

Figure 4.Effects of PLIN2 on the mRNA expression of SREBP2.A，B：the mRNA expression of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages transfected with pQCXIP or pQCXIP-HA-PLIN2 for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h；C，D：the mRNA expression of PLIN2 and SREBP2 in RAW264.7 macrophages transfected with pSuper-scramble siRNA or pSuper-retro-PLIN2 siRNA for 24 h and then treated with or without ox-LDL for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PLIN2-Con group；#P＜0.05 vs HA-PLIN2 group；&P＜0.05 vs ox-LDL group；▲P＜0.05 vs siRNA-Con group；△P＜0.05 vs siRNAPLIN2 group；☆P＜0.05 vs siRNA-Con+ox-LDL group.圖4 PLIN2對SREBP2 mRNA表達的影響

Figure 5.Lipid droplets in RAW264.7 macrophages detected by oil red O staining.The scale bar=50 μm.圖5 油紅O染色觀察PLIN2對脂滴變化的影響

既往研究表明，細胞內(nèi)膽固醇豐富時，SREBPs錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；但細胞膽固醇水平較低時，SREBPs被site-1 及site-2 蛋白酶切割并釋放，轉(zhuǎn)移至細胞核與LDL 受體或HMGCR 合成酶的基因操縱子結(jié)合并促進其表達［5，12］。其中，SREBP2 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作為膜結(jié)合蛋白，可通過蛋白酶水解后釋放N 端結(jié)構(gòu)域進入細胞核，與固醇反應元件結(jié)合，激活SREBP2 靶基因HMGCR的轉(zhuǎn)錄，進而促進細胞內(nèi)膽固醇合成。Vergnes 等［13］發(fā) 現(xiàn)，在 小鼠 胚胎 中 敲除SREBP2，HMGCR 表達水平顯著降低，膽固醇的生物合成減少。新近研究報道，在小鼠中敲除PLIN2能夠降低SREBP2 表達，抑制其活性，減少脂質(zhì)蓄積［6］，提示PLIN2 與SREBP2 存在相互作用，但其具體機制尚不明確。本研究顯示，在RAW246.7 細胞中過表達PLIN2，能夠促進并激活 SREBP2，增加SREBP2 核移位，上調(diào)HMGCR 表達，提高細胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上FC水平，導致細胞脂質(zhì)蓄積；降低PLIN2 水平則出現(xiàn)相反的結(jié)果。這說明PLIN2 可通過激活SREBP2 增加HMGCR 的表達，促進細胞內(nèi)膽固醇合成進而引起細胞脂質(zhì)蓄積。

Figure 6.Effects of PLIN2 on intracellular free cholesterol content（A）and free cholesterol content in endoplasmic reticulum（B）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs siRNA-PLIN2+Ox-LDL group.圖6 PLIN2對細胞內(nèi)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上游離膽固醇含量的影響

Figure 7.Effects of PLIN2 on the protein level of GRP78 detected by Western blot.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs HA-PLIN2 group.圖7 PLIN2對GRP78蛋白水平的影響

Figure 8.Effects of PLIN2 on the nuclear translocation of SREBP2 detected by immunofluorescence staining.PLIN2 was visualized by FITC-conjugated Affinipure（green），and nuclei were stained with DAPI（blue）.The scale bar=50 μm.圖8 PLIN2對SREBP2核轉(zhuǎn)位的影響

Figure 9.Effects of 4-PBA on the protein levels of GRP78，SREBP2 and HMGCR in each group detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs 4-PBA group；△P＜0.05 vs ox-LDL group.圖9 4-PBA對GRP78、SREBP2和HMGCR蛋白水平的影響

Figure 10.Effects of 4-PBA on the mRNA expression of SREBP2 in each group detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs 4-PBA group；△P＜0.05 vs ox-LDL group.圖10 4-PBA處理后對SREBP2 mRNA表達的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)膽固醇含量的重要細胞器［14］，通過感知細胞內(nèi)膽固醇含量而調(diào)節(jié)胞內(nèi)膽固醇水平［15］。ERS 發(fā)生能夠促進膽固醇負荷，增加脂質(zhì)蓄積和泡沫細胞形成，說明ERS 與AS 發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系［16-17］。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，在調(diào)節(jié)ERS的動態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是ERS的標志［18］。ERS發(fā)生時，ERS 相關(guān)蛋白 GRP78 與 SREBP 裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）-SREBP復合物分離，激活SREBP2，促進其發(fā)揮生物活性［19］。此外，Chen 等［20］觀察到 PLIN2 在胰腺 β 細胞中可參與ERS 調(diào)節(jié)。由此我們猜想，PLIN2 可能通過ERS調(diào)控SREBP2 從而影響RAW264.7 巨噬細胞脂質(zhì)蓄積。本研究表明，過表達PLIN2 能促進GRP78 表達，說明過表達PLIN2 能夠引起ERS 的發(fā)生。ERS 特異性抑制劑 4-PBA 降低 SREBP2 及 HMGCR 表達，進一步表明PLIN2可通過ERS 影響SREBP2活性，從而調(diào)控RAW264.7細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

綜上所述，PLIN2可促進RAW264.7細胞脂質(zhì)蓄積，其機制是其誘導ERS的發(fā)生，激活SREBP2，從而促進脂質(zhì)蓄積。但鑒于本工作是以RAW264.7 巨噬細胞為研究對象進行的體外細胞實驗，與臨床疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的區(qū)別，因此在AS 發(fā)展中PLIN2 對SREBP2的具體作用機制仍有待進一步研究。