張旭 ，馬芳，納瑋，李曉菡，黃琦，于晶晶，王嘉，王立斌

0 引言

乳腺癌是一種常見的女性高危惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性健康[1]。研究表明，年齡、雌激素水平異常、遺傳和表觀遺傳因素都可導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。盡管乳腺癌的診療技術(shù)不斷發(fā)展，但乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍頻繁發(fā)生[3]。早期診斷能夠提前預(yù)警，減少腫瘤的惡化。因此，探索更高效、敏感的分子標(biāo)志物，對(duì)乳腺癌的臨床防治具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是一種具有連續(xù)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，由外顯子、內(nèi)含子或兩者共同的反向剪切而來(lái)[4]。circRNA由于其環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶降解，在生物體內(nèi)比線性RNA更加穩(wěn)定[5]。大多數(shù)circRNA在不同物種間表達(dá)具有組織特異性，在腫瘤疾病中大量差異表達(dá)[6-7]。穩(wěn)定性、組織特異性和疾病特異性使circRNA具有成為檢測(cè)分子標(biāo)志物的潛力。然而，大多數(shù)circRNA的潛在功能尚不清楚。

因此，本研究通過一系列篩選過濾確定Hsacirc-0026352（Hsa_circ_0026352）為候選的分子標(biāo)志物，并驗(yàn)證其在乳腺癌患者外周血及健康人群外周血中的差異表達(dá)，探討Hsa_circ_0026352的表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征的相關(guān)性，評(píng)價(jià)Hsa_circ_0026352作為乳腺癌診斷標(biāo)志物的價(jià)值。為乳腺癌的早期防治提供新的思路和見解。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年1月—2018年10月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤外科確診為乳腺癌患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本共18對(duì)，乳腺癌患者外周血標(biāo)本100例。乳腺癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）女性；（2）年滿18周歲；（3）無(wú)既往病史；（4）無(wú)艾滋病毒感染；（5）乳房切除術(shù)后；（6）無(wú)放療、化療史。收集2018年10月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院體檢中心體檢健康人群外周血標(biāo)本50例。健康人群的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）女性；（2）無(wú)惡性腫瘤病史；（3）無(wú)乳房功能障礙；（4）無(wú)其他任何臨床全身性急性或慢性炎性反應(yīng)性疾??；（5）無(wú)自身免疫疾病；（6）無(wú)高血壓。所有標(biāo)本的收集對(duì)象在調(diào)查取樣前簽署知情同意書。本研究已獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本及患者信息收集

組織樣本：接受手術(shù)乳房切除的乳腺癌患者，收取乳腺癌組織標(biāo)本及癌旁正常組織標(biāo)本（正常組織為腫瘤邊緣＞5 cm處）。外周血樣本：乳腺癌患者，健康人群空腹過夜后，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管從肘部正中靜脈采血5 ml。組織樣本及血液樣本在使用前后均儲(chǔ)存于-80℃。

收集乳腺癌患者的一般臨床資料和腫瘤病理學(xué)特征信息，包括：年齡、腫瘤大小、腫瘤是否轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期（依據(jù)美國(guó)腫瘤聯(lián)合委員會(huì)惡性腫瘤分期系統(tǒng)進(jìn)行分期）[8]、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、糖蛋白抗原153（carbohydrate antigen,CA153）測(cè)定結(jié)果、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）測(cè)定結(jié)果。

1.3 circRNA芯片檢測(cè)及分析

以人類circRNA V2芯片（北京博奧生物科技股份有限公司，中國(guó)）對(duì)3對(duì)乳腺癌和癌旁組織的circRNA芯片檢測(cè)分析。下機(jī)數(shù)據(jù)通過GeneSpring V13.0軟件進(jìn)行初步歸一化及熒光信號(hào)值分析。該芯片共包含162 351個(gè)人類circRNA的標(biāo)記探針。以癌旁組織檢測(cè)結(jié)果為對(duì)照，篩選乳腺癌組織中產(chǎn)生差異的circRNA。篩選條件為：初始熒光信號(hào)值＞100，差異倍數(shù)（Fold change,FC）≥2，顯著性P＜0.05。采用Cluster 3.0，Graphpad Prism 8.0.1軟件繪制環(huán)狀RNA表達(dá)聚類圖，采用ggPlot2軟件分析散點(diǎn)圖及火山圖。使用circPrimer 1.2軟件繪制環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)圖。

1.4 qRT-PCR驗(yàn)證

使用TRIzol（Invitrogen,美國(guó)）法提取組織樣本中的RNA，RNA大量提取試劑盒（百泰克，中國(guó)）提取血液樣本中的RNA。取0.3 μg總RNA電泳驗(yàn)證RNA質(zhì)量（1.3 g瓊脂糖/100 ml，1×TAE緩沖液，120 V電壓，25 min）。使用PrimeScript? RT reagent Kit（Thermo，美國(guó)）將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為：1 μl總RNA（約500 ng），1 μl random primer，10 μl ddH2O，2 μl dNTP，4 μl反轉(zhuǎn)錄buffer，1 μl RNA酶抑制劑，1 μl反轉(zhuǎn)錄酶，總體積20 μl；反轉(zhuǎn)錄條件為：25℃5 min；42℃ 60 min，70℃ 5 min。RNA及cDNA置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取各組cDNA使用TB Green premix Ex TaqTMⅡ（TAKARA，日本）在Light-Cycler480Ⅱ定量平臺(tái)（Roche，美國(guó)）以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為：1 μl模板cDNA，0.5 μl+0.5 μl上下游引物，8 μl ddH2O，10 μl SYBR MIX，總體積20 μl；PCR條件為：94℃30 s預(yù)變性反應(yīng)；94℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；65℃ 5 s分析融解曲線。檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)通過2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。所有引物序列見表1。

表1 qRT-PCR使用的引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS23.0軟件（IBM，美國(guó)）和GraphPad Prism version 8.0軟件（GraphPad，美國(guó)）對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素ANOVA分析，采用卡方檢驗(yàn)分析分類變量的顯著性，采用曲線回歸分析及Pearson檢驗(yàn)分析相關(guān)性，采用ROC曲線評(píng)價(jià)環(huán)狀RNA的診斷價(jià)值，以曲線下面積（AUC）≥0.6表示具有診斷價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hsa_circ_0026352的篩選及驗(yàn)證

在初始篩選條件下，共發(fā)現(xiàn)1 972個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)的環(huán)狀RNA546個(gè)，下調(diào)的環(huán)狀RNA1 426個(gè)。熱圖、火山圖和散點(diǎn)圖均顯示了乳腺癌組織與癌旁組織間差異表達(dá)的circRNA，見圖1A。擴(kuò)大篩選條件為差異倍數(shù)≥8，P＜0.01，熒光值≥1000，來(lái)源基因位于腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路，最終確定circ-0026352滿足篩選要求。通過qRT-PCR在18對(duì)乳腺癌及癌旁組織中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Hsa-circ-0026352在乳腺癌組織中表達(dá)顯著低于癌旁組織（FC=9.45,P＜0.01），見圖1B。ROC曲線分析顯示，Hsa-circ-0026352在乳腺癌及癌旁組織檢測(cè)中的AUC＞0.6（AUC=0.881,P＜0.01），見圖1C。相關(guān)結(jié)果提示Hsa_circ_0026352具有乳腺組織特異性，具備成為乳腺癌檢測(cè)標(biāo)志物的潛力。

2.2 Hsa_circ_0026352的結(jié)構(gòu)特征及其在乳腺癌患者外周血中的差異表達(dá)

通過circ Primer1.2軟件分析，Hsa_circ_0026352是由NR4A1基因第3、4、5外顯子反向剪切而成，見圖2 A。為確保qRT-PCR驗(yàn)證有效性，在circRNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)兩條引物，Hsa_circ_0026352-junction為該環(huán)狀RNA結(jié)合位點(diǎn)特異性引物，Hsa_circ_0026352-linear為該環(huán)狀RNA臂上引物（可同時(shí)識(shí)別NR4A1 mRNA），使用核酸外切酶RNase R處理血液中提取的circRNA，結(jié)果顯示，線性RNA會(huì)被核酸酶消化，而Hsa_circ_0026352無(wú)法被核酸酶消化，見圖2B。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，相對(duì)于健康人群外周血，Hsa_circ_0026352乳腺癌患者外周血中相對(duì)表達(dá)顯著下調(diào)，見圖2C。ROC曲線分析顯示，Hsa_circ_0026352在乳腺癌患者外周血檢測(cè)中的AUC=0.826（P＜0.01），敏感度為68%，特異性為90%，見圖2D。相關(guān)結(jié)果提示Hsa_circ_0026352具有血液樣品特異性，具備成為乳腺癌外周血診斷分子標(biāo)志物的潛力。

2.3 Hsa_circ_0026352在外周血中的表達(dá)及其與乳腺癌患者病例資料中連續(xù)數(shù)值結(jié)果的相關(guān)性分析

圖1 Hsa_circ_0026352的芯片篩選及其在乳腺癌組織中表達(dá)的驗(yàn)證Figure 1 Screening of Hsa_circ_0026352 through circular RNAs microarray and verification of its expression in breast cancer tissues

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Hsa_circ_0026352的ΔCt值與外周血CA153水平呈顯著正相關(guān)（n=100，r2=0.287,P=0.004）；曲線回歸分析結(jié)果顯示，Hsa_circ_0026352相對(duì)表達(dá)與外周血CA153水平呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與年齡、腫瘤大小、CEA值的變化無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），見圖3、表2。提示Hsa_circ_0026352可與CA153檢測(cè)協(xié)同使用。

2.4 Hsa_circ_0026352在外周血中的表達(dá)及其在乳腺癌患者各臨床分組中的差異顯著性分析

單因素ANOVA分析及ROC曲線結(jié)果顯示，Hsa_circ_0026352的相對(duì)表達(dá)在CA153陽(yáng)性、CEA陽(yáng)性、ER陽(yáng)性、腫瘤是否轉(zhuǎn)移、TNM分期、Edmondson分級(jí)中分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。ROC曲線分析結(jié)果顯示，Hsa_circ_0026352在乳腺癌患者中鑒別出ER陽(yáng)性的AUC為0.710（P＜0.01），鑒別乳腺癌Edmondsen分級(jí)的AUC為0.771（P＜0.01）；鑒別乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的AUC為0.722（P＜0.01）。與之相比，本組資料中CA153鑒別乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的AUC為0.719（P＜0.01），見圖4。結(jié)果表明，Hsa_circ_0026352診斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的能力與CA153相當(dāng)，Hsa_circ_0026352具備成為乳腺癌轉(zhuǎn)移、ER陽(yáng)性及臨床分期輔助外周血分子標(biāo)志物的潛力。

表2 乳腺癌患者臨床連續(xù)計(jì)量數(shù)值資料統(tǒng)計(jì)表Table 2 Clinical continuous measurement data of breast cancer patients

圖2 Hsa_circ_0026352的結(jié)構(gòu)特征及其在乳腺癌患者外周血中表達(dá)的驗(yàn)證Figure 2 Structure characteristics of Hsa_circ_0026352 and its expression verification in peripheral blood of breast cancer patients

圖3 Hsa_circ_0026352在外周血中的表達(dá)及其與乳腺癌患者臨床特征的相關(guān)性Figure 3 Expression levels of hsa_circ_0026352 in peripheral blood and its correlation with clinicopathological characteristics of breast cancer patients

表3 Hsa_circ_0026352在外周血中的表達(dá)及其在乳腺癌患者各臨床分組中的差異顯著性分析Table 3 Expression of Hsa_circ_0026352 in peripheral blood and its significant difference among different clinical groups of breast cancer patients

3 討論

乳腺癌的高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重威脅著人類的健康，早期診斷和分型有助于乳腺癌患者的治療。circRNA是一種非編碼RNA，其通過外顯子或內(nèi)含子首尾相連形成一個(gè)閉合環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，沒有3'和5'端[9]。這種結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)賦予circRNA不易被降解的特性，無(wú)論在RNA酶作用、煮沸、反復(fù)凍融或長(zhǎng)期保存等多種影響下，其表達(dá)具備穩(wěn)定性[10]。此外，circRNA在大多數(shù)癌組織及血漿中的表達(dá)具有組織特異性和疾病特異性[11-12]。這些特性使circRNA有可能成為許多疾病，特別是癌癥早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

本研究使用circRNA芯片篩選乳腺癌與癌旁組織中差異表達(dá)的circRNA，在差異倍數(shù)≥8，P＜0.01，熒光值≥1 000，來(lái)源基因位于腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路，最終確定Hsa_circ_0026352滿足篩選要求。其來(lái)源于核受體激素基因NR4A1（nuclear receptor subfamily 4 group A member 1）的外顯子，有報(bào)道證實(shí)抑制NR4A1的表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，并抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡[13-14]。Hsa_circ_0026352結(jié)構(gòu)序列上具有大量miRNA吸附位點(diǎn)及少量蛋白編碼閱讀框，其在乳腺癌患者組織及外周血中表達(dá)顯著下調(diào)（FC≈9），基于NR4A1在乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡過程中的重要作用，我們推測(cè)Hsa_circ_0026352可能通過miRNA吸附功能或編碼蛋白功能介入NR4A1基因?qū)?xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控過程。ROC分析顯示，Hsa_circ_0026352在乳腺癌患者組織檢測(cè)中的AUC為0.881（P＜0.01），在外周血檢測(cè)中的AUC為0.826（P＜0.01）。這證實(shí)Hsa_circ_0026352具備作為乳腺癌外周血診斷標(biāo)志物的潛力。circRNA在腫瘤診斷標(biāo)志物的應(yīng)用潛力已在多篇報(bào)道中得到證實(shí)。Gao等發(fā)現(xiàn)Hsa_circ_0006528在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，且其異常表達(dá)與乳腺癌的化療耐藥密切相關(guān)，可能作為化療耐藥預(yù)測(cè)標(biāo)志物[15]。Yin等研究發(fā)現(xiàn)Hsa_circ_0001785能夠作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物[16]。而本研究首次報(bào)道了Hsa_circ_0026352與乳腺癌的關(guān)系。

圖4 Hsa_circ_0026352用于乳腺癌患者外周血分子標(biāo)志物的ROC分析Figure 4 ROC analysis of Hsa_circ_0026352 in peripheral blood of breast cancer patients

確定Hsa_circ_0026352在乳腺癌診斷中的價(jià)值后，我們進(jìn)一步探討了乳腺癌患者臨床特征中的分布和相關(guān)性，結(jié)果顯示，作為檢測(cè)指標(biāo)，Hsa_circ_0026352在外周血中的相對(duì)表達(dá)與CA153水平呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），并且當(dāng)患者以CA153是否陽(yáng)性分組后，Hsa_circ_0026352的表達(dá)差異顯著（P＜0.05）。CA153是乳腺癌最重要的特異性標(biāo)志物之一，是乳腺癌診斷、轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的最佳指標(biāo)[17]。但是，只有30%～60%的乳腺癌患者可見CA153明顯升高，其在轉(zhuǎn)移性乳腺癌最高達(dá)80%[18]。因此，Hsa_circ_0026352可能作為CA153的協(xié)同監(jiān)測(cè)指標(biāo)，可能有效提高CA153的診斷準(zhǔn)確性。此外，我們發(fā)現(xiàn)Hsa_circ_0026352的相對(duì)表達(dá)在CA153陽(yáng)性、ER陽(yáng)性、腫瘤是否轉(zhuǎn)移、Edmondson分級(jí)中分布差異顯著（P＜0.05）。ROC曲線分析，Hsa_circ_0026352可能作為ER陽(yáng)性、乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移、乳腺癌分期監(jiān)測(cè)的重要循環(huán)系統(tǒng)標(biāo)志物。在本組數(shù)據(jù)中，其鑒別乳腺癌轉(zhuǎn)移的效果與CA153相當(dāng)。

綜上所述，本研究顯示Hsa_circ_0026352在乳腺癌外周血中特異性表達(dá)下調(diào)，其具備成為乳腺癌診斷、乳腺癌轉(zhuǎn)移、ER陽(yáng)性監(jiān)測(cè)標(biāo)志物的潛力。而其在乳腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。