任可，姚楠，吳蘇稼，施鑫，李超，陸軍

0 引言

骨肉瘤是青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，預后差[1]。近30年來骨肉瘤綜合治療成效顯著，但不少患者仍死于肺轉(zhuǎn)移。所以探尋骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制有助于揭示新的治療靶點。一些高侵襲性惡性腫瘤中存在血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry,VM）即腫瘤細胞通過自身變形模仿血管壁結(jié)構(gòu)，形成輸送血液的管道系統(tǒng)，建立特殊的腫瘤微循環(huán)，并可與內(nèi)皮依賴性血管相互獨立或協(xié)同提供腫瘤的灌注和播散[2]。研究顯示，VM與多種惡性腫瘤的進展和預后不良密切相關(guān)[2]。我們發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤存在VM結(jié)構(gòu)并與生存時間和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[3]。

遷移誘導基因-7（migration inducing gene-7,MIG-7）的蛋白產(chǎn)物位于多種腫瘤細胞的細胞膜和細胞質(zhì)[4]，局部侵襲或體循環(huán)中遠處播散的腫瘤細胞表達尤其強烈；相反，取自健康人群的25種組織標本均未檢測到MIG-7表達[5]。我們則在小樣本水平觀察到骨肉瘤組織中存在MIG-7陽性表達[3]。近期研究還發(fā)現(xiàn)MIG-7在多種腫瘤的VM形成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。然而，MIG-7對于人骨肉瘤的轉(zhuǎn)移、預后以及VM形成究竟有無影響，尚缺少大樣本臨床研究。

因此，我們擬在較大樣本水平考察MIG-7與四肢骨肉瘤患者VM水平及臨床病理特征之間的關(guān)系，并分析MIG-7和VM對骨肉瘤預后的影響，初步探討MIG-7在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 組織標本與臨床資料

收集2000年12月—2016年12月東南大學附屬中大醫(yī)院和東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的156例經(jīng)病理確診的原發(fā)性骨肉瘤活檢標本。納入標準：（1）組織學亞型為普通型；（2）原發(fā)灶位于四肢骨；（3）美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer,AJCC）分期為Ⅱ期；（4）具備化療前的組織學觀測活檢標本；(5）治療方案為新輔助化療-根治性手術(shù)-輔助化療，并完成了整個治療過程。化療方案如下：第一周期氨甲喋呤（MTX），劑量8～12 g/m2，6 h靜滴，8～12 h后甲酰四氫葉酸鈣（calcium folinate,CF）解救。第二周期阿霉素（ADM）+順鉑（DDP）；ADM劑量60～90 mg/m2，分3天輸入；DDP劑量120～150 mg/m2，第1天給藥。第三周期異環(huán)磷酰胺（IFO），劑量15 g/m2，分5天輸入。3周期為一療程。術(shù)前2個療程，術(shù)后8個療程。各周期之間及相鄰兩療程均間隔兩周。手術(shù)與術(shù)前第2療程以及術(shù)后第1療程也均間隔兩周。所有患者的劑量強度均按照體表面積嚴格計算。排除標準：（1） 繼發(fā)性骨肉瘤；（2）初診前已有放療或化療史；（3）源發(fā)于中軸骨骼和骨外組織的骨肉瘤；（4）骨旁骨肉瘤和骨膜骨肉瘤等其他組織學亞型；（5）因劑量不足或給藥延遲等原因而影響劑量強度的患者未被納入本研究；（6）隨訪期間失訪者。

通過病案、門診和電話方式，收集患者臨床病理特征。根據(jù)MIG-7分子的表達水平、VM情況、化療效果及其他若干臨床病理特征等暴露因素對患者分組。隨訪時間截至2019年12月31日。自確診至死亡的時間定義為總生存時間（overall survival time,OS），自手術(shù)至發(fā)生轉(zhuǎn)移的時間為無轉(zhuǎn)移生存時間（metastasis-free survival time,MFS）。

1.2 主要試劑

兔抗人MIG-7多克隆抗體購自中國北京Bioss公司；兔抗人CD31多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；Periodic acid-Schiff（PAS）染色試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；Envision?試劑盒購自丹麥Dako公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色及判定標準 石蠟標本4 μm厚切片脫蠟至水，微波熱修復，加MIG-7一抗，4℃過夜。根據(jù)試劑盒要求滴加相應的試劑，孵育顯色。免疫組織化學染色評分標準參照已有文獻[3]，0～2分為陰性，3～6分為陽性表達。

1.3.2 CD31/PAS雙重染色及VM判定標準 石蠟切片加抗人CD31一抗，DAB顯色，0.5%過碘酸中還原8 min，再于雪夫氏液中反應15 min，0.5%偏重亞硫酸鈉液滴洗，蘇木精對比染色，最后予分化、返藍、脫水透明及封片。VM定性標準：CD31/PAS雙重染色可見VM內(nèi)壁呈PAS陽性而CD31陰性，其內(nèi)含紅細胞，其外為腫瘤細胞，并排除壞死、出血及炎性細胞浸潤[6]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS（version 17）和R（version 3.2.1）軟件進行統(tǒng)計分析和模型構(gòu)建。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料行t檢驗，生存時間采用Kaplan-Meier法，各因素間比較用Log rank分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4.1 獨立預后因素的計算 為尋找獨立預后因素，首先進行單因素生存分析，得出有統(tǒng)計學意義的危險因素。然后在SPSS軟件中完成多因素生存分析，對所有單因素生存分析得出的危險因素采用基于最大偏似然估計的向后逐步回歸法進行自變量篩選，再納入Cox比例風險模型分析獨立預后因素；然后重新將上述單因素生存分析得出的危險因素納入全變量Cox比例風險回歸方程，再次計算獨立預后因素。

1.4.2 風險預測模型的構(gòu)建 為構(gòu)建風險預測模型，在R軟件中加載nomogram()函數(shù)和cph()函數(shù)，建立3年和5年的生存概率預測列線圖，命令每個變量的分值最大為10。最后調(diào)用相關(guān)函數(shù)進行驗證，計算一致性指數(shù)（index of concordance,C-index）評價模型的預測能力；并繪制校準曲線。

2 結(jié)果

2.1 四肢骨肉瘤中MIG-7的表達及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

156例患者中男92例（59.0%）、女64例（41.0%）；年齡5～56歲，中位年齡18.2歲。隨訪時間6～160月，中位隨訪時間55.0月；5年總生存率為52.7%。92例（59.0%）MIG-7陽性、64例（41.0%）陰性，染色部位主要在腫瘤細胞的細胞質(zhì)，部分細胞膜亦有染色，見圖1A～B。一些病例可見MIG-7陽性的腫瘤細胞構(gòu)成VM管壁，內(nèi)含紅細胞，且VM管壁的腫瘤細胞染色稍深于其他區(qū)域的腫瘤細胞，見圖1C。CD31/PAS雙重染色進一步證實這些病例中瘤細胞構(gòu)成了CD31-/PAS+的管道結(jié)構(gòu)，且管腔內(nèi)存在紅細胞，符合VM判定標準，見圖1D。正常松質(zhì)骨標本和陰性對照均未見MIG-7表達，見圖1E。

統(tǒng)計分析顯示，MIG-7與患者的性別、年齡、AJCC ⅡA/ⅡB期、腫瘤部位、術(shù)式（保肢/截肢）、術(shù)前化療的腫瘤壞死率等臨床病理參數(shù)均無相關(guān)性，但MIG-7陽性患者的VM存在率高于MIG-7陰性患者，33.7%（31/92）vs.12.5%（8/64），P=0.003，提示MIG-7與VM之間顯著相關(guān)，見表1。

2.2 MIG-7表達與四肢骨肉瘤患者預后的關(guān)系

MIG-7（-）組平均OS為108.8月，平均MFS為90.2月，5年總生存率為70.8%，5年無轉(zhuǎn)移生存率為54.6%；MIG-7（+）組平均OS為59.8月，平均MFS為49.9月，5年總生存率為39.7%，5年無轉(zhuǎn)移生存率為24.4%。Kaplan-Meier單因素生存分析顯示MIG-7的陽性表達與OS和MFS顯著相關(guān)。Log rank成對比較顯示，MIG-7（+）組的OS和MFS均明顯短于MIG-7（-）組（P＜0.001）。VM（-）組平均OS為92.8月，平均MFS為79.5月；VM（+）組平均OS為52.3月，平均MFS為41.2月。Kaplan-Meier單因素生存分析顯示VM（+）組OS和MFS均明顯短于VM（-）組（P＜0.001），見圖2。

圖1 骨肉瘤組織中MIG-7的表達以及血管生成擬態(tài)CD31/PAS雙重染色情況(×400)Figure 1 Representative images of immunohistochemical staining for MIG-7 expression and CD31/PAS double staining for vasculogenic mimicry in osteosarcoma tissues (×400)

表1 AJCC分期Ⅱ期的四肢骨肉瘤患者MIG-7表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 (n(%))Table 1 Association between clinicopathological features and MIG-7 expression levels in AJCC stage Ⅱ extremity osteosarcoma patients (n(%))

Kaplan-Meier單因素分析還顯示，術(shù)前化療效果對患者的OS和MFS亦有顯著影響，見圖2，但其他臨床病理特征與患者生存期及轉(zhuǎn)移均無關(guān)，見表2。

將上述單因素生存分析得出的三個危險因素（MIG-7表達情況、VM水平和術(shù)前化療效果）作為多因素生存分析的自變量直接納入全變量Cox比例風險回歸方程，或者經(jīng)基于最大偏似然估計的向后逐步回歸法篩選之后再納入Cox比例風險回歸方程，均得出同樣結(jié)論：MIG-7表達情況、VM水平和術(shù)前化療效果是預測四肢骨肉瘤患者生存時間和轉(zhuǎn)移時間的獨立預后因素，見表3。

2.3 風險預測模型構(gòu)建

2.3.1 預測列線圖解釋與表達 根據(jù)Cox比例風險回歸模型結(jié)果，建立基于MIG-7表達情況、VM水平和術(shù)前化療效果的列線圖模型，用于預測3年和5年總體生存概率及無轉(zhuǎn)移生存概率。各變量不同取值對應的評分，將各變量評分相加得到總評分，總評分投射在3年和5年生存概率軸上的點即為個體患者對應的生存概率，見圖3。

2.3.2 生存概率預測列線圖效果評價 一致性指數(shù)（C指數(shù)）本質(zhì)上是估計預測結(jié)果與實際觀察結(jié)果相一致的概率。我們得到OS的C指數(shù)為0.716±0.047，MFS的C指數(shù)為0.707±0.041，提示該模型準確度尚可。

圖2 MIG-7表達情況、VM水平及術(shù)前化療效果不同的各組患者總生存時間和無轉(zhuǎn)移生存時間的Kaplan-Meier單因素分析Figure 2 Kaplan-Meier analysis of overall survival and metastasis-free survival of osteosarcoma patients with different levels of MIG-7 expression,VM and histological responses to pre-operative chemotherapy

表2 四肢骨肉瘤患者OS和MFS的單因素生存分析Table 2 Univariate analysis of OS and MFS of extremity osteosarcoma patients

進一步繪制校準曲線，進行一致性測試?；颊?年和5年的總生存率和無轉(zhuǎn)移生存率的校準曲線均比較靠近對角線，顯示預測列線圖與實際觀察的生存概率有較好的一致性，見圖4。

圖3 預測AJCCⅡ期四肢骨肉瘤患者總生存期和無轉(zhuǎn)移生存期的列線圖Figure 3 Prognostic nomogram for prediction of AJCC stage Ⅱ extremity osteosarcoma patients

3 討論

長期以來，骨肉瘤缺乏有效的預后指標和治療靶點，而VM的發(fā)現(xiàn)為腫瘤精準診療提供了一類潛在的觀察指標和治療靶點[2-3]。MIG-7是腫瘤細胞膜和細胞質(zhì)中一種富含半胱氨酸的蛋白，可促進腫瘤細胞的遷移和重排，在多種惡性腫瘤的VM活動中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4,7]?；蚯贸蛱禺愋钥贵w抑制MIG-7功能后，腫瘤細胞的趨化和侵襲能力明顯減弱[5]。因此我們認為MIG-7是腫瘤細胞侵襲性表型的重要標志，并可能作為腫瘤治療的潛在特異靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中MIG-7染色主要位于細胞質(zhì)和細胞膜，與其他腫瘤相似；約60%的AJCCⅡ期患者表達MIG-7，而正常骨組織則不表達。單因素生存分析顯示，MIG-7表達水平與四肢骨肉瘤患者的總生存時間和無轉(zhuǎn)移生存時間密切相關(guān)，MIG-7陽性者生存時間短，轉(zhuǎn)移發(fā)生早。提示MIG-7在骨肉瘤的病程進展中發(fā)揮重要作用。而且，Cox比例風險模型進一步顯示MIG-7表達水平是獨立預后因素之一。因此，考慮MIG-7表達水平可能具備鑒別高危骨肉瘤患者的潛在價值。

表3 四肢骨肉瘤患者OS和MFS的多因素生存分析Table 3 Multivariate analysis of OS and MFS of extremity osteosarcoma patients

圖4 列線圖模型預測患者累積生存率的校準曲線Figure 4 Calibration curves for assessing consistency between predicted and actual postoperative survival rates

實體腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移依賴于新生血供，新生脈管為腫瘤提供新陳代謝所需的氧氣和營養(yǎng)，也為腫瘤遠處轉(zhuǎn)移提供了通路[8]，而VM僅有腫瘤細胞圍成管腔，不含內(nèi)皮細胞，其管腔結(jié)構(gòu)的不完善使腫瘤細胞更易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移[7]。EphA2、COX-2和FAK等分子都介導VM形成[9]，但這些分子也在內(nèi)皮細胞、上皮細胞及炎性細胞中表達，參與胚胎發(fā)育、傷口愈合及炎性反應等多種生理過程[10]。相比之下，MIG-7不僅促進多種腫瘤VM形成，而且除胚胎滋養(yǎng)層之外的正常組織細胞均不表達MIG-7，所以其VM靶向特異性可能更好[3-5]。研究顯示，MIG-7經(jīng)半胱氨酸開關(guān)機制促進了（MT1）-MMP和MMP-2表達。MMP-2通過降解細胞外基質(zhì)成分促進瘤細胞遷移和侵襲，進而形成VM[11]。另外，（MT1）-MMP和MMP-2通過PI3-K/MMPs/Ln-5γ2通路促發(fā)Ln-5γ2鏈裂解，增加Ln-5γ2鏈domainⅢ促遷移片段（D Ⅲ fragment）的釋放，而該片段中的EGF樣重復區(qū)域可激活EGF受體及其下游信號通路，降低腫瘤細胞與層粘連蛋白附著的能力并導致血管樣結(jié)構(gòu)的生成[4,12]。MIG-7與上述VM介導分子也密切相關(guān)。如，EphA2與MIG-7相似，也通過上調(diào)腫瘤細胞MT1-MMP增加Ln-5γ2鏈domain Ⅲ促遷移片段（D Ⅲ fragment）釋放，促進VM形成[13]。COX-2/PGE2則經(jīng)Akt/GSK-3β途徑提高MIG-7表達水平，進而上調(diào)MT1-MMP和MMP-2表達量，促進腫瘤細胞EMT及遷移、侵襲，最終形成VM[12-13]。所以MIG-7不僅是腫瘤VM的標志分子，還可能作為臨床抗VM靶向治療的潛在靶點。

本研究結(jié)果顯示，MIG-7陽性的骨肉瘤細胞可以排列成內(nèi)含紅細胞的管腔，且管壁細胞染色稍深于其他區(qū)域的腫瘤細胞，CD31/PAS雙重染色則證實這些管道屬于VM。統(tǒng)計分析顯示，MIG-7表達與VM之間存在顯著相關(guān)關(guān)系，而VM水平本身也是骨肉瘤生存時間和轉(zhuǎn)移時間的一個獨立預后因素。因此，我們認為MIG-7在人骨肉瘤VM形成中發(fā)揮重要作用，并可能由此促進病程進展；同時VM與MIG-7之間也通過相互獨立的機制分別促進骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移，兩者對骨肉瘤的預后都有顯著影響。

MIG-7與VM的相關(guān)關(guān)系會引起共線性問題，這可能導致估計值與客觀實際不一致，造成單因素分析和多因素分析結(jié)果矛盾。主成分分析可以克服共線性干擾，但提取的主成分對原始變量解釋能力較弱，求解出的獨立因素往往不具有臨床意義[14]。另外，該樣本不屬于高維度、小樣本、強相關(guān)的生存資料分析，所以也未采用基于LASSO算法的自變量篩選消除共線性，而是選用逐步回歸法解決共線性問題[15]。又因為基于Walds統(tǒng)計量的檢驗未充分考慮各因素的綜合作用，所以選用更可靠的基于最大偏似然估計的向后逐步回歸篩選方法。逐步回歸分析后，再行全變量的Cox比例風險回歸分析，兩次得出的獨立預后因素相同，提示逐步回歸未將有意義的變量排除在模型之外。另外，MIG-7與VM分別成為一個獨立預后因素，也提示MIG-7還通過VM之外的其他機制促使骨肉瘤進展。

骨肉瘤預后具有異質(zhì)性，建立精準的個體預后預測模型頗具臨床價值。國外學者在Cox回歸模型基礎(chǔ)上建立了多種腫瘤的生存概率列線圖，但國內(nèi)將列線圖用于測算亞洲人種骨肉瘤的生存概率還鮮有報道。我們基于多因素分析結(jié)果，選取MIG-7表達情況、VM水平和術(shù)前化療效果三個獨立預后因素構(gòu)建列線圖模型，一致性指數(shù)在0.7以上，校準曲線顯示預測風險與理想預測值接近，表明該列線圖預測模型具有較好的區(qū)分度與準確性，可以準確快捷的對骨肉瘤預后進行個體化評估預測，也便于針對預后較差的患者進行更積極的隨訪和輔助治療。另外，列線圖特有的可視化效果還直觀顯示了各預后因素及其各水平對生存時間的貢獻權(quán)重[16]。本研究中，三個獨立預后因素均為二分類變量，列線圖直觀顯示三個獨立預后因素對生存時間的貢獻相差不大；相比之下，術(shù)前化療效果對無轉(zhuǎn)移生存期的影響較MIG-7稍大一些。

綜上所述，VM及其相關(guān)分子MIG-7均與四肢骨肉瘤病情進展密切相關(guān)，兩者均為骨肉瘤的獨立預后因素，可為判斷生存期及轉(zhuǎn)移時間提供一定參考。MIG-7可能通過促進VM形成加速病情進展，并可能還通過其他機制影響骨肉瘤預后。使用列線圖可以快速精確地對患者預后作出判斷，對于制定骨肉瘤個體化診療策略頗有意義。又因為骨肉瘤的傳統(tǒng)化療已進入平臺期，所以對MIG-7和VM的深入研究不僅有助于揭示骨肉瘤發(fā)病機制，也可能為骨肉瘤的精準治療提供潛在靶點。