郭超，左琪，楊曉峰，張帆

0 引言

乳腺癌是世界上最常見的癌癥之一，也是導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因[1]。研究顯示，早期診斷的乳腺癌患者5年存活率可達(dá)90%以上，比晚期患者提高約50%，早期診斷仍是改善乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵[2]。目前乳腺癌早期篩查手段主要有乳腺X線篩查、乳腺自我檢查（BSE）和臨床乳腺檢查（CBE），雖能在一定程度上提高診斷率，但不能及早發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在分子水平的改變[3]?；谀[瘤靶向肽的光學(xué)分子成像技術(shù)，可將腫瘤識別時(shí)間窗由組織結(jié)構(gòu)病變提前到生物大分子甚至基因水平的改變，為實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期精確診斷提供了可能[4-6]。該診療策略實(shí)施的關(guān)鍵在于研發(fā)能夠特異性靶向腫瘤細(xì)胞及組織的腫瘤靶向肽光學(xué)分子探針。

本課題組前期通過體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選并獲得人乳腺癌Bcap-37細(xì)胞特異性結(jié)合肽CSPLNTRFC，命名為BCSP1。本實(shí)驗(yàn)合成異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate,FITC）標(biāo)記的光學(xué)分子探針FITC-BCSP1，并研究其對乳腺癌細(xì)胞的特異性和靶向性，為乳腺癌的早期診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、澳洲特級胎牛血清、含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液、PBS磷酸鹽緩沖液、雙抗（青-鏈霉素混合液）、二甲基亞砜（DMSO）、牛血清白蛋白（BSA）、4%多聚甲醛、4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）、MTT細(xì)胞毒性檢測試劑盒均購自西安寶森生物科技有限公司。Matrigel基底膜基質(zhì)膠購自美國BD公司。細(xì)胞超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、紫外分光光度儀均購自美國賽默飛世爾科技公司，倒置光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Bioteck公司，BD Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，XSP-BM13C熒光倒置顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠，賽恩思0010AⅠ型小動(dòng)物活體成像儀由四川賽恩思儀器有限公司提供。

1.1.2 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37、MDA-MB-231、MCF7及人膀胱癌細(xì)胞株EJ、人正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A均購自上海斯信生物科技有限公司。5～6周齡的BALB/c系雌性裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證：SCXK（京）2016-0006）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化學(xué)合成光學(xué)分子探針 委托杭州中肽生化有限公司采用固相合成法合成多肽BCSP1（CSPLNTRFC），通過二硫鍵連接半胱氨酸耦合成環(huán)形成環(huán)七肽。為減少熒光基團(tuán)FITC對多肽分子結(jié)構(gòu)的直接影響，將FITC與環(huán)七肽鏈N端之間通過6個(gè)碳原子連接，形成FITC標(biāo)記的光學(xué)分子探針（FITC-BCSP1）。按上述方法合成陰性對照探針FITC-svBCSP1。

FITC-BCSP1序列：FITC-C6-Cys-Ser-Pro-Leu-Asn-Thr-Arg-Phe-Cys(Cys&CysBridge)；FITCsvBCSP1序列：FITC-C6-Cys-Thr-Pro-Ser-Leu-Phe-Asn-Arg-Cys(Cys&CysBridge)。

陰性對照探針FITC-svBCSP1與靶向肽探針FITC-BCSP1相比，結(jié)構(gòu)和氨基酸種類均相同，僅氨基酸組合順序不同。通過高效液相色譜法（HPLC）及質(zhì)譜分析（MS）鑒定所合成探針的純度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37用DMEM培養(yǎng)基，人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A用DMEM/F12培養(yǎng)基，人膀胱癌細(xì)胞EJ及人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF7用RPMI 1640培養(yǎng)基，其中均含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至90%以上時(shí)傳代。

1.2.3 FITC-BCSP1和FITC-svBCSP1探針的細(xì)胞毒性檢測 將Bcap-37細(xì)胞制成1×104/ml的細(xì)胞懸液并接種于96孔板中。用去離子水將FITC-BCSP1和FITC-svBCSP1探針分別稀釋成濃度為50、100、200、300 μmol/L的溶液。待細(xì)胞貼壁后，將96孔板上的細(xì)胞分成兩組，分別對應(yīng)兩種溶液，每種溶液的每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另外留出3孔作空白對照。將兩種溶液分別加入對應(yīng)的細(xì)胞孔位中，每孔200 μl，空白對照加等量PBS，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。PBS清洗3次，每次1 min，每孔細(xì)胞加入20 μl MTT液培養(yǎng)4 h，棄去MTT液，加100 μl DMSO震蕩培養(yǎng)至結(jié)晶物質(zhì)溶解。酶標(biāo)儀檢測490 nm處OD值。相對抑制率（IR%）=[1－（OD490實(shí)驗(yàn)組/OD490空白對照組）]×100%，三個(gè)復(fù)孔取均值作為最終結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：IR%≤30%為耐藥，30%～50%為敏感，50%～70%為中度敏感，IR%＞70%為高度敏感。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測FITC-BCSP1探針與Bcap-37細(xì)胞結(jié)合的特異性 用去離子水分別將FITCBCSP1和FITC-svBCSP1稀釋成濃度為25 μmol/L的溶液。將人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37、MDA-MB-231、MCF7、人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及人膀胱癌細(xì)胞EJ分別制成1×106/ml的細(xì)胞懸液，分裝于無菌EP管中，每種細(xì)胞15管，每管400 μl。實(shí)驗(yàn)組：取每種細(xì)胞5管，每管加入10 μl FITC-BCSP1探針溶液；對照組：取每種細(xì)胞5管，每管加入10 μl FITC-svBCSP1探針溶液；空白組加入等量PBS，室溫避光孵育30 min。800 r/min離心5 min，PBS清洗3次。過濾每管細(xì)胞，置于流式細(xì)胞管中，分別加入200 μl上樣緩沖液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。結(jié)果分析：統(tǒng)計(jì)兩種探針標(biāo)記的陽性細(xì)胞所占百分比，計(jì)算均值（）。

1.2.5 熒光倒置顯微鏡術(shù)鑒定FITC-BCSP1探針與Bcap-37細(xì)胞結(jié)合的特異性 將Bcap-37細(xì)胞懸液以1×104/ml的濃度接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。用去離子水分別將FITC-BCSP1和FITCsvBCSP1稀釋成濃度為25 μmol/L的溶液。次日，棄去培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基孵育1 h，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗，2%PBS-BSA封閉1 h。每兩孔細(xì)胞為一組，共3組。實(shí)驗(yàn)組每孔加入10 μl FITC-BCSP1溶液，對照組加等量FITC-svBCSP1溶液，空白組加等量PBS，室溫、避光孵育15 min。PBS清洗3次，每次1 min，加入DAPI染液，室溫、避光孵育10 min，用熒光倒置顯微鏡觀察。計(jì)數(shù)：在200倍顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞并計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比=（熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)/100個(gè)細(xì)胞）×100。

1.2.6 FITC-BCSP1探針的濃度（C）與吸光度（A）值相關(guān)性分析 將FITC-BCSP1探針分別稀釋成濃度為50、100、150、200、250、280、310、340、370、400 μmol/L的溶液各400 μl。用紫外-可見分光光度計(jì)在200～800 nm范圍內(nèi)測定不同濃度溶液的紫外吸收光譜（高純水作為參比溶液），每個(gè)濃度測試3次。

1.2.7 FITC-BCSP1探針的光照穩(wěn)定性分析 將FITC-BCSP1探針稀釋成最適濃度的溶液裝滿1.5 ml EP管，置于36℃～38℃的恒溫孵育箱中，從多光譜內(nèi)鏡光源輸出白光照射EP管。用熒光分子成像儀觀察24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)溶液熒光信號強(qiáng)度的變化，并用Image-Pro Plus7.0測量各時(shí)間點(diǎn)圖像平均灰度值。

1.2.8 Bcap-37細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的制備 選擇生長狀態(tài)良好的Bcap-37細(xì)胞，制成濃度為1×107/ml的PBS細(xì)胞懸液。4℃環(huán)境下，取40 μl細(xì)胞懸液混合于160 μl Matrigel基底膜基質(zhì)膠中，用預(yù)冷的1 ml注射器抽取，接種于生長狀態(tài)良好的裸鼠前肢腋窩部位，每天觀察并記錄腫瘤長徑。

1.2.9 光學(xué)分子成像鑒定FITC-BCSP1探針在荷瘤裸鼠模型體內(nèi)的分布 取狀態(tài)良好、瘤體大小接近的Bcap-37細(xì)胞荷瘤裸鼠20只，分成在體實(shí)驗(yàn)組和離體實(shí)驗(yàn)組。用4%水合氯醛麻醉。通過尾靜脈分別注入200 μl上述最適濃度的FITC-BCSP1探針。在體實(shí)驗(yàn)組5只：用賽恩思0010AⅠ型小動(dòng)物活體成像儀，分別對探針注入前及注入后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、12 h的腫瘤區(qū)進(jìn)行熒光分子成像，確定熒光信號強(qiáng)度最強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)。離體實(shí)驗(yàn)組15只：分別在探針注入后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、10、12 h，將其中1只處死，分離心、肝、脾、雙腎及腫瘤組織并置于背景熒光低不容易反光的黑紙上，用同樣的方法對各組織器官進(jìn)行熒光分子成像，并用儀器自帶的Image-Pro Plus7.0測量各圖像的平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 合成光學(xué)分子探針

光學(xué)分子探針合成后的質(zhì)量檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC-BCSP1和FITC-svBCSP1探針分子式為C70H89N15O19S3，分子量1540.8，均可溶于水；通過質(zhì)譜（MS）和高效液相色譜法（HPLC）鑒定所合成探針的純度≥98%。

2.2 熒光探針對Bcap-37細(xì)胞毒性鑒定結(jié)果

MTT結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為50、100、200、300 μmol/L時(shí)，F(xiàn)ITC-BCSP1及FITC-svBCSP1組細(xì)胞的相對抑制率均低于30%，表明二者在50～300 μmol/L濃度內(nèi)對Bcap-37細(xì)胞的增殖及活性無影響，見表1。

表1 不同濃度的FITC-BCSP1和FITC-svBCSP1探針對Bcap-37細(xì)胞的相對抑制率Table 1 Inhibition rates of Bcap-37 cells by different concentrations of optical molecular probes FITC-BCSP1 and FITC-svBCSP1

2.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定熒光探針與Bcap-37細(xì)胞結(jié)合特異性

PBS空白對照組陽性細(xì)胞百分比為（0.16±0.02）%，將陰性閾值設(shè)置為0.18%。同等條件下，Bcap-37細(xì)胞中FITC-BCSP1探針標(biāo)記的細(xì)胞百分比明顯高于其他細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。同等條件的Bcap-37細(xì)胞中，F(xiàn)ITC-BCSP1探針標(biāo)記的細(xì)胞百分比為（94.53±2.26）%，明顯高于對照組FITC-svBCSP1探針的（3.89±0.36）%（P=0.000）。說明FITC-BCSP1能與人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37特異性結(jié)合，見表2、圖1。

2.4 熒光倒置顯微鏡鑒定FITC-BCSP1探針與Bcap-37細(xì)胞結(jié)合特異性

結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC-BCSP1組能觀察到大量熒光標(biāo)記的細(xì)胞，陽性率為100%，而FITC-svBCSP1組陽性率僅為1%，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），F(xiàn)ITC-BCSP1探針與乳腺癌Bcap-37細(xì)胞結(jié)合具有特異性，見圖2。

表2 光學(xué)分子探針標(biāo)記的各類細(xì)胞百分比()Table 2 Percentage of cells labeled by optical molecular probe ()

Notes:*:all P＜0.001,compared with other cells; Δ:P＜0.001,compared with Bcap-37 cells labeled by FITC-svBCSP1 in control group.

2.5 FITC-BCSP1探針濃度與吸光度值相關(guān)性分析

圖1 FITC-BCSP1探針與多種細(xì)胞結(jié)合的流式細(xì)胞圖Figure 1 Flow cytometry analysis of combination of FITC-BCSP1 probe and different cells

圖2 光學(xué)分子探針與Bcap-37細(xì)胞結(jié)合的熒光倒置顯微鏡成像圖Figure 2 Fluorescence inverted microscope images of combination of optical molecular probes and Bcap-37 cells

FITC-BCSP1探針在50～280 μmol/L內(nèi)，A值隨濃度的增加而升高，濃度為320～440 μmol/L時(shí)，探針的A值基本在0.92±0.03內(nèi)發(fā)生微小變化。探針濃度為280 μmol/L時(shí)的A值（1.16±0.02）均高于其他濃度（均P＜0.05），見圖3A。

2.6 FITC-BCSP1探針光照穩(wěn)定性

溫度恒定為37±1℃時(shí)，白光照射下，濃度為280 μmol/L的FITC-BCSP1探針在24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)熒光分子成像的灰度值始終在66.7±1.0附近變化，說明在37℃下，光照對280 μmol/L的FITC-BCSP1探針穩(wěn)定性無影響，見圖3B。

圖3 FITC-BCSP1探針吸光度值與濃度的對應(yīng)關(guān)系(A)和最適濃度的光照穩(wěn)定性(B)Figure 3 Correspondence between absorbance and concentration of FITC-BCSP1 probe(A) and light stability of the optimum concentration(B)

2.7 成功建立人乳腺癌Bcap-37細(xì)胞荷瘤裸鼠模型

致瘤3周后，裸鼠前肢腋窩部逐漸隆起長徑0.3～0.5 cm腫瘤，4～5周后瘤體長徑可達(dá)2～2.5 cm，形狀規(guī)則近似球形，觸之質(zhì)地均一，無化膿和破損。

2.8 FITC-BCSP1探針在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布的熒光分子成像

離體實(shí)驗(yàn)組：FITC-BCSP1探針注入后，隨著時(shí)間的延長，離體腫瘤組織熒光信號強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，3 h時(shí)最強(qiáng)（灰度值89.2±1.3），之后開始衰減。3 h時(shí)正常組織除膽囊外幾乎觀察不到熒光信號，肝臟、腎臟、脾臟、心臟熒光成像的灰度值分別為23.6±0.1、32.1±0.1、14.3±0.2、11.8±0.1，而膽囊的灰度值最高98.20，腫瘤組織與正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3、圖4。

在體實(shí)驗(yàn)組：FITC-BCSP1探針注入后，最先觀察到尾部注射點(diǎn)附近發(fā)出較強(qiáng)熒光。30 min后，移植瘤隆起部位開始發(fā)出微弱的熒光。隨著時(shí)間的延長，尾部熒光信號逐漸減弱，移植瘤區(qū)熒光信號逐漸增強(qiáng)，3 h達(dá)到峰值（灰度值78.68）。隨后出現(xiàn)不同程度的衰減，見圖5。

3 討論

光學(xué)分子成像技術(shù)（optical molecular imaging,OMI）的基本原理是通過一定波長的光波照射生物體內(nèi)被熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞從而產(chǎn)生光學(xué)分子影像。OMT近年來的發(fā)展對腫瘤的早期診斷治療有極大的幫助，因?yàn)樗哂懈叨忍禺愋院挽`敏度，可早期從分子層面對腫瘤細(xì)胞的改變進(jìn)行觀察檢測。OMI診療策略實(shí)施的關(guān)鍵在于研發(fā)與腫瘤細(xì)胞及組織具有較高結(jié)合特異性和敏感度的靶向分子，進(jìn)而展開分子探針及靶向化療藥物載體的開發(fā)。Cai等[7]在荷人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠中注射了RGD標(biāo)記的QD（QD705-RGD），顯示了良好的靶向腫瘤血管和血管光學(xué)成像。隨著新型成像儀器的開發(fā)，光學(xué)分子探針介導(dǎo)內(nèi)窺鏡檢查有望成為腫瘤早期診斷和治療的新技術(shù)。

腫瘤靶向肽能攜帶熒光素特異性富集在腫瘤組織、細(xì)胞，是腫瘤光學(xué)分子靶向診斷的重要載體。腫瘤靶向多肽介導(dǎo)的光學(xué)分子成像技術(shù)對于早期檢測腫瘤病灶、提高腫瘤早期診斷率具有重要價(jià)值。目前針對黑色素瘤、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤有特異親和力的肽已被篩選出。Feng等[8]利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得乳腺癌靶向肽CLKADKAKC（CK3），其受體是在乳腺腫瘤中過表達(dá)的Neuropilin-1（NRP-1）。以CK3肽為靶向配體的光學(xué)分子探針已被證實(shí)對乳腺腫瘤的SPECT和NIRF成像有效。研究表明靶向腫瘤新生血管整合素αvβ3受體的RGD靶向肽，與放射性核素或熒光素偶聯(lián)后可實(shí)現(xiàn)對腫瘤組織的特異性光學(xué)分子成像[9]。由此發(fā)展起來的RGD光學(xué)分子影像技術(shù)已被應(yīng)用于乳腺腫瘤的早期診斷研究中[10]。

表3 腫瘤組織12 h內(nèi)在不同時(shí)間熒光分子成像的灰度值Table 3 Gray value of fluorescence molecular imaging of tumor tissues at different time within 12 h

圖4 FITC-BCSP1探針注入荷瘤裸鼠模型體內(nèi)3h時(shí)離體器官及腫瘤組織的熒光分子成像Figure 4 Fluorescence molecular imaging of in vitro organs and tumor tissues after FITC-BCSP1 probe was injected into tumor-bearing nude mice for 3h

圖5 FITC-BCSP1探針注入后3h腫瘤區(qū)熒光分子成像Figure 5 Fluorescence molecular imaging of tumor region after FITC-BCSP1 probe was injected into tumor-bearing nude mice for 3h

本研究進(jìn)行了一系列體外和體內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn)，為鑒定基于靶向肽BCSP1的光學(xué)分子探針對乳腺癌細(xì)胞Bcap-37的特異性和靶向性。首先化學(xué)合成靶向肽光學(xué)分子探針，選擇異硫氰酸熒光素（FITC）作熒光指示基團(tuán)，通過縮合反應(yīng)與BCSP1分子末端的游離氨基結(jié)合成FITC-BCSP1熒光分子探針。同時(shí)合成了FITC標(biāo)記的隨機(jī)探針FITC-svBCSP1作為陰性對照，其中svBCSP1的結(jié)構(gòu)和氨基酸種類與BCSP1相同，僅氨基酸組合順序不同。通過體外流式細(xì)胞術(shù)及熒光倒置顯微鏡檢測，結(jié)果顯示靶向肽熒光探針FITC-BCSP1能特異性地結(jié)合到Bcap-37細(xì)胞，而陰性對照探針FITC-svBCSP1與Bcap-37細(xì)胞基本不結(jié)合。

在荷瘤裸鼠模型體內(nèi)驗(yàn)證FITC-BCSP1探針的特異性和靶向性，首先要明確熒光探針FITCBCSP1的最適濃度及穩(wěn)定性。通過實(shí)驗(yàn)探索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC-BCSP1在濃度為280 μmol/L時(shí)所發(fā)出熒光強(qiáng)度最大，且在24 h內(nèi)穩(wěn)定性不受光照影響。將FITC-BCSP1探針以280 μmol/L的濃度注入Bcap-37細(xì)胞荷瘤裸鼠模型體內(nèi)后，連續(xù)監(jiān)測離體腫瘤組織的熒光信號強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在探針注入后3 h時(shí)，離體的腫瘤組織熒光信號強(qiáng)度最高，而同時(shí)期的正常組織（肝臟、腎臟、脾臟、心臟）除膽囊外幾乎觀察不到熒光信號，表明FITC-BCSP1能明顯富集在移植瘤組織，說明FITC-BCSP1探針能特異性靶向人乳腺癌Bcap-37細(xì)胞異體移植瘤。類似研究表明[11]，F(xiàn)ITC標(biāo)記的環(huán)七肽主要通過肝臟、膽囊和腎臟代謝，所以膽囊可非特異性富集熒光探針，顯示出較強(qiáng)熒光信號。

綜上所述，靶向肽光學(xué)分子探針FITC-CSPLNTRFC具有良好的乳腺癌細(xì)胞特異性和靶向性，為其應(yīng)用于乳腺癌早期診斷提供了一定理論依據(jù)。我們將在后續(xù)工作中進(jìn)一步探索FITC-CSPLNTRFC探針與Bcap-37細(xì)胞特異性結(jié)合的分子機(jī)制，爭取早日實(shí)現(xiàn)FITC-CSPLNTRFC探針的臨床轉(zhuǎn)化，使其真正應(yīng)用到乳腺癌的早期診斷中。