楊吉鵬，邱翔，李琛，楊建凱，劉紅江，焦保華

0 引言

多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM） 是人類膠質(zhì)瘤中最常見、惡性程度最高的一種亞型，盡管目前放化療技術(shù)已取得巨大進展，但目前全世界GBM患者2年生存率仍不超過10%，總體生存時間仍然很短，嚴重威脅人類健康[1]。目前研究對于GBM發(fā)生與進展有關(guān)基因的研究已成為當今熱點。同源異型盒基因家族是與人類腫瘤關(guān)系密切的基因家族之一。HOXA5已被證實在GBM中呈顯著高表達并且可促進GBM細胞的增殖與侵襲[2]，但其在GBM中過表達的原因目前尚不明確，本研究從microRNA角度入手，就HOXA5在GBM中過表達的機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年1月—2019年12月于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院手術(shù)治療的GBM患者腫瘤標本共30例，其中男19例、女11例，年齡42～68歲，平均年齡50.3±2.98歲，每例腫瘤標本均由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師核實并診斷為GBM（根據(jù)WHO 2007年標準），收集同期30例重度顱腦創(chuàng)傷患者去骨瓣減壓術(shù)中的正常腦組織標本作為對照。本研究人體標本及動物實驗均獲本院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 試劑與儀器

實驗選購國產(chǎn)的HyClone DMEM/High-Glucose培養(yǎng)基，10%特級胎牛血清及雙抗購自美國Gibco公司，HOXA5及GAPDH抗體購于英國Abcam公司，miR-128-3p及GAPDH的引物是由北京Invitrogen公司合成，Dual-Luciferase? Reporter試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。主要設備與儀器包括Applied Biosystems 9700實時熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司），BioTek Synergy HT多功能酶標儀（美國伯騰公司），國產(chǎn)DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀（中國北京），SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂Bio-Rad公司），光學顯微鏡和倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司的Thermo Forma 3111），SW-CJ-IFD凈化工作臺（蘇州蘇凈集團安泰空氣技術(shù)公司），精密移液槍（Thermo公司），AP250D-0電子天平（美國Ohaus公司），超純水儀（英國Ultrabioscience公司），MLS-3020CH高壓蒸汽滅菌器（日本SANYO公司）。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法

于冰浴中充分研磨組織或細胞同時加入適量的RIPA蛋白裂解液，取蛋白濃度測定試劑盒（BCA,Pierce）測量樣品蛋白濃度，根據(jù)樣品體積與上樣緩沖液體積的比值（4:1）計算需要加入的5×上樣緩沖液的體積，取封口膜封緊管口，煮沸5 min，分裝放置于-20℃保存。在預先制好的12%的聚丙烯酰胺凝膠板的每個孔內(nèi)加入90 μg的蛋白電泳，按照海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿的順序放好，轉(zhuǎn)膜約1.5 h。取5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，加入兔抗人HOXA5多克隆抗體，密封后4℃冰箱過夜。次日添加二抗，避光室溫孵育2 h。用1×TBST清洗3次，每次15 min，后于雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描進行條帶顯影，最后用Image-Pro Plus 6軟件進行灰度定量分析。檢測miR-128-3p過表達后HOXA5蛋白的表達水平。每組實驗重復3次。取GAPDH作為內(nèi)參照，計算目的基因條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值。

1.4 實時熒光定量PCR

利用qPCR檢測待測樣品的miR-128-3p水平，根據(jù)miRcute Plus miRNA Detection Kit說明書提取標本總RNA，用紫外分光光度計測定其吸光度，其中OD260/OD280的值在1.6～2.0之間的RNA質(zhì)量最好，測定RNA濃度，將上述總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒說明書進行qPCR擴增，取U6作為內(nèi)參照。引物設計如下：miR-128-3p上游引物:5’-GACTGCCGAGCGAGCG-3’，下游引物：5’-GACGCCGAGGCACTCTCTCCT-3’; U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，每組實驗重復3次。

1.5 細胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87購自中國科學院，培養(yǎng)基成分包括10%FBS、100 u/ml青霉素、100 pg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，每日于顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每兩日更換培養(yǎng)基一次，于細胞對數(shù)生長期進行細胞轉(zhuǎn)染與細胞功能學實驗。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

通過生物信息網(wǎng)站TargetScan、miRbase與miRDB，預測miR-128-3p為可能的上游miRNA及靶向結(jié)合序列，構(gòu)建插入熒光素酶的野生型與突變型HOXA5質(zhì)粒，并將上述兩種質(zhì)粒分別與miR-128-3p過表達的質(zhì)粒及對照的空載質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細胞中，24～48 h內(nèi)明確轉(zhuǎn)染效果并于轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書先后測定熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性即為報告基因活性。

1.7 miR-128-3p過表達與低表達慢病毒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

購買由上海吉凱公司構(gòu)建并合成的miR-128-3p過表達與低表達的帶綠色熒光的慢病毒及相應的對照空載慢病毒，當細胞融合率至40%時計算病毒用量，MOI值取4，根據(jù)病毒滴度得出相應病毒體積并將其轉(zhuǎn)染至U87細胞系中，同時添加溴化己二甲銨及轉(zhuǎn)染增效試劑輔助慢病毒的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染16 h更換培養(yǎng)基，72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，后收集細胞利用PCR檢測miR-128-3p水平以驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.8 CCK-8、Transwell及流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡

CCK-8實驗：將轉(zhuǎn)染后的實驗組及對照組細胞種植于96孔板上，每組取4個副孔，細胞密度為4×103/孔，培養(yǎng)基100 μl，放置培養(yǎng)箱孵育，分別于24、36、48、72 h，加入10 μl的CCK-8試劑，加試劑前更換培養(yǎng)基，孵育4 h后利用酶標儀測定吸光度，空白孔內(nèi)添加100 μl培養(yǎng)基與10 μl的CCK-8試劑。Transwell實驗：將轉(zhuǎn)染后細胞種植于24孔板的小室上，細胞密度為每孔1×105，加入100 μl無血清的培養(yǎng)基孵育，小室底部鋪纖維連接蛋白膜，小室外加入600 μl血清濃度為30%的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育24 h后，輕輕擦去小室面膜上的細胞后在膜的室外表面添加甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min后清水洗滌3遍，置于100倍顯微鏡下，隨機選取6個視野并計數(shù)每個視野內(nèi)的細胞量，計算平均值并拍照。細胞周期流式細胞學分析：兩組細胞消化后預冷PBS沖洗后離心，棄上清液后取1 ml的70%酒精固定細胞，添加PI試劑并避光放置10 min后上機檢測。細胞凋亡流式細胞學分析：將兩組細胞胰酶消化后取預冷的PBS緩慢沖洗兩遍，離心后棄上清液，工作液沖懸細胞后依次添加10 μl的7-AAD及5 μl的Annexin V試劑，室溫避光15 min后上機。通過上述實驗完成拯救實驗，驗證miR-128-3p通過抑制HOXA5表達進而調(diào)控GBM的增殖、侵襲與抗凋亡能力。

1.9 裸鼠成瘤實驗

于南京常州卡文斯實驗動物有限公司購進裸鼠（4周雌鼠）20只，分為兩組（每組10只），將miR-128-3p與HOXA5過表達的U87細胞（miR-128-3p+HOXA5）及對照U87細胞（miR-128-3p+Control）分別注射于裸鼠側(cè)背部皮下，每只約注入5×106個細胞，飼養(yǎng)于無菌飼養(yǎng)室，每周測量一次成瘤的長徑與短徑，飼養(yǎng)6周后宰殺裸鼠取出瘤體，稱重并拍照。

1.10 統(tǒng)計學方法

所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗比較兩組計量資料，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 正常腦與GBM組織中HOXA5蛋白與miR-128-3p的表達

miR-128-3p在GBM組織中表達水平明顯低于正常腦組織（t=7.141,P=0.0000），見圖1A，而HOXA5蛋白在GBM組織中表達水平明顯高于正常腦組織（t=12.61,P=0.0000），見圖1B。

圖1 miR-128-3p(A)與HOXA5(B)在正常腦組織與GBM組織中的表達Figure 1 Expression of miR-128-3p(A) and HOXA5 protein(B) in normal brain sample and GBM sample

2.2 miR-128-3p與HOXA5蛋白表達的相關(guān)性

在U87細胞中分別轉(zhuǎn)染miR-128-3p過表達與低表達的慢病毒，再利用Western blot方法檢測HOXA5的表達量，結(jié)果表明miR-128-3p過表達的U87細胞系中HOXA5蛋白的表達水平較對照組可顯著降低（t=9.015,P=0.0008），見圖2A；miR-128-3p低表達的U87細胞系中HOXA5蛋白的表達水平明顯高于對照組（t=8.476,P=0.0011），見圖2B。結(jié)果表明U87細胞中miR-128-3p與HOXA5的表達存在顯著負相關(guān)性。

2.3 miR-128-3p靶向結(jié)合HOXA5的3’UTR區(qū)并抑制HOXA5的表達

通過查閱生物信息網(wǎng)站得到miR-128-3p與HOXA5潛在的靶向結(jié)合位置，并購置HOXA5野生型與突變型的質(zhì)粒，見圖3A。隨后進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒Y(jié)果發(fā)現(xiàn)HOXA5野生型組的熒光素酶活性顯著低于HOXA5突變型組（t=4.214,P=0.0135），見圖3B。結(jié)果表明miR-128-3p可靶向結(jié)合HOXA5的3’UTR區(qū)并抑制HOXA5的表達。

2.4 miR-128-3p靶向抑制HOXA5調(diào)控膠質(zhì)瘤母細胞瘤的增殖、侵襲與凋亡

拯救實驗發(fā)現(xiàn)miR-128-3p+control組比miR-128-3p+HOXA5組細胞增殖能力顯著下降（t=5.17,P=0.0067），兩組細胞450 nm吸光度值變化曲線及第5天吸光度值比較情況，見圖4A、表1。miR-128-3p+control組每視野穿過膜的平均細胞數(shù)為（53.47±5.03）個，miR-128-3p+HOXA5組每視野穿過膜的平均細胞數(shù)為（126.3±8.11）個，結(jié)果顯示miR-128-3p+control組U87細胞侵襲力明顯低于miR-128-3p+HOXA5組（t=7.634,P=0.0016），見圖4B。流式細胞儀結(jié)果顯示：miR-128-3p+control組中G0/G1期的細胞明顯多于miR-128-3p+HOXA5組（t=7.842,P=0.0014），miR-128-3p+control組中處于S期的細胞明顯少于miR-128-3p+HOXA5組（t=6.641,P=0.0027），兩組細胞周期中G1/G0期與S期分布情況，見圖5；miR-128-3p+control組U87細胞凋亡比例（18.73±1.43）%顯著高于miR-128-3p+HOXA5組的（5.2±0.64）%（t=8.615,P=0.0010），見圖6。上述結(jié)果證實：miR-128-3p是通過靶向抑制HOXA5的表達來調(diào)控膠質(zhì)瘤母細胞瘤的增殖、侵襲與凋亡。

圖2 miR-128-3p與HOXA5在U87細胞系中表達的相關(guān)性Figure 2 Correlation of miR-128-3p and HOXA5 expression in U87 cell lines

圖3 miR-128-3p靶向HOXA5的3’UTR區(qū)抑制HOXA5的表達Figure 3 miR-128-3p targeted 3’UTR of HOXA5 and inhibited HOXA5 expression

表1 miR-128-3p+HOXA5過表達質(zhì)粒及相應對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后U87細胞450 nm的吸光度值Table 1 Absorbance at 450 nm after transfection of overexpression plasmids of miR-128-3p+HOXA5 and miR-128-3p+control in U87 cells

圖4 miR-128-3p+Control組與miR-128-3p+HOXA5組細胞增殖(A)與侵襲(B)能力的比較Figure 4 Proliferation(A) and invasion(B) abilities between miR-128-3p+control group and miR-128-3p+HOXA5 group detected by CCK-8 assay and Transwell assay

圖5 拯救實驗中miR-128-3p+control組與miR-128-3p+HOXA5組細胞周期的比較Figure 5 Comparison of cell cycles between miR-128-3p+control group and miR-128-3p+HOXA5 group in rescue experiments

圖6 拯救實驗中miR-128-3p+control組與miR-128-3p+HOXA5組細胞凋亡的比較Figure 6 Comparison of cell apoptosis between miR-128-3p+control group and miR-128-3p+HOXA5 group in rescue experiments

2.5 miR-128-3p在體內(nèi)靶向HOXA5抑制膠質(zhì)瘤母細胞瘤的生長

裸鼠成瘤實驗表明：miR-128-3p+control組裸鼠所成瘤體的體積與重量明顯低于miR-128-3p+HOXA5組（t=6.653,P=0.0000;t=7.975,P=0.0000），見圖7。

3 討論

圖7 拯救實驗中miR-128-3p+control組與miR-128-3p+HOXA5組裸鼠成瘤體積與重量的比較Figure 7 Comparison of tumor volume and weight in nude mice between miR-128-3p+control group and miR-128-3p+HOXA5 group

HOXA5是同源異型盒基因家族的一員，又稱HOX1、HOX1C等，基因位于人類第7號染色體（7p15.2），該基因的異常表達與人類多種腫瘤的發(fā)生與進展密切相關(guān)，如胃癌、食管癌、肺癌等[3-5]。嚴小衛(wèi)等于2012年首次發(fā)現(xiàn)HOXA5在膠質(zhì)瘤細胞中呈顯著高表達，并發(fā)現(xiàn)HOXA5的表達水平與GBM患者的平均生存期呈明顯負相關(guān)[6]。本研究利用蛋白免疫印跡法檢測GBM組織中的HOXA5蛋白表達水平時發(fā)現(xiàn)：相比正常腦組織，HOXA5在GBM組織中表達水平顯著升高，此結(jié)果與文獻報道一致。Li等發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中HOXA5與CD133密切相關(guān)且兩者表達水平相互依賴，在CD133低表達時HOXA5的表達會對膠質(zhì)瘤患者的預后發(fā)揮重要影響[7]。劉鵬等通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等實驗證實HOXA5過表達可顯著提高膠質(zhì)瘤細胞的增殖與侵襲能力[2]。至于HOXA5促進膠質(zhì)瘤發(fā)生與進展的具體機制目前有關(guān)文獻報道較少，Ma等研究發(fā)現(xiàn)HOXA5在膠質(zhì)瘤中的作用與β-catenin/USP1/EZH2軸的調(diào)控和H3K27me3的富集有關(guān)[8]。而HOXA5在惡性膠質(zhì)瘤細胞中呈高表達的原因目前仍不明確。

MicroRNA是人體中與多種生命過程關(guān)系密切的一類RNA，一般由約22～25核苷酸構(gòu)成，可通過與下游基因的3’UTR區(qū)結(jié)合并抑制下游基因的表達，對人類疾病與腫瘤的發(fā)生和進展發(fā)揮重要調(diào)控作用[9-10]。其中miR-128-3p被發(fā)現(xiàn)可抑制人體多種惡性腫瘤細胞的增殖及侵襲，已被公認具有廣泛抑癌作用的一個microRNA，如肝細胞癌、乳腺癌、黑色素瘤等[11-13]。此外，Huo等發(fā)現(xiàn)miR-128-3p在膠質(zhì)瘤中呈顯著低表達并可通過IRS-1/PI3K/AKT信號通路抑制GBM腫瘤細胞的增殖與分化[14]。本研究發(fā)現(xiàn)GBM中miR-128-3p的表達水平明顯低于正常腦組織，此結(jié)果與上述文獻相符。Qu等發(fā)現(xiàn)miR-128-3p可靶向抑制PDK1膠質(zhì)瘤細胞線粒體功能障礙并誘導腫瘤細胞凋亡[15]。通過查詢生物信息網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-128-3p與HOXA5基因3’UTR區(qū)具有潛在靶向結(jié)合可能，考慮在膠質(zhì)母細胞瘤中miR-128-3p也極有可能靶向結(jié)合HOXA5的3’UTR區(qū)進而抑制HOXA5的表達。本研究證實在GBM細胞中miR-128-3p與HOXA5的表達存在負相關(guān)性。隨后進行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒Y(jié)果顯示野生型HOXA5組的熒光素酶活性顯著低于突變型HOXA5組，表明miR-128-3p可靶向結(jié)合HOXA5基因的3’UTR區(qū)并抑制HOXA5的表達。為進一步明確miR-128-3p是否可通過靶向抑制HOXA5來抑制GBM腫瘤細胞的增殖、侵襲與抗凋亡能力，本研究通過拯救實驗和裸鼠體內(nèi)實驗證實，miR-128-3p可在體內(nèi)外經(jīng)靶向抑制HOXA5進而負向調(diào)控GBM細胞的增殖、侵襲并促進腫瘤細胞凋亡。利用流式細胞儀檢測細胞周期實驗發(fā)現(xiàn)miR-128-3p經(jīng)靶向抑制HOXA5表達最終使更多的腫瘤細胞停留至G1期，考慮miR-128-3p、HOXA5可能與具有調(diào)控DNA復制功能的某個因子或信號通路關(guān)系密切。miR-128-3p在膠質(zhì)瘤中低表達的原因已被發(fā)現(xiàn)與LncRNA PVT1的靶向結(jié)合有關(guān)[16]，仍可能存在某些機制引起miR-128-3p的低表達，miR-128-3p的低表達也可能僅是HOXA5在GBM中高表達的原因之一。故miR-128-3p與HOXA5在GBM中的具體作用機制今后仍需進一步研究。

綜上所述，miR-128-3p可靶向抑制HOXA5的表達進而負向調(diào)控GBM細胞的增殖、侵襲與抗凋亡能力。本研究從microRNA的角度部分解釋了HOXA5在GBM中高表達的原因，同時進一步探索miR-128-3p在GBM中的作用機制。今后將從同源異型盒基因與microRNA的角度進一步探索GBM的發(fā)生與進展機制，為GBM基因治療與靶向治療提供新的理論依據(jù)與思路。