張強(qiáng)，吳邵雅，張靖

0 引言

抑制程序性細(xì)胞死亡受體蛋白1（PD-1）、程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA4）免疫檢查點(diǎn)是腫瘤免疫治療的主要手段。盡管部分患者表現(xiàn)出明顯的反應(yīng)性和潛在的持久響應(yīng)，但大多數(shù)腫瘤患者并沒(méi)有從中受益。因此，目前很多臨床前研究和臨床試驗(yàn)的關(guān)注點(diǎn)是將現(xiàn)有的治療手段與免疫治療相結(jié)合從而改善療效。臨床上約50%的癌癥患者接受放療作為治療的一部分。在過(guò)去的一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，放療成為眾多實(shí)體瘤的一線治療手段。早在1979年，Stone等報(bào)道在免疫缺陷小鼠中減少50%移植瘤體積（TCD50）所需的放療劑量是在免疫正常小鼠中的兩倍[1]。目前，已知放療可以發(fā)揮顯著的免疫刺激作用，因此，放療與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）免疫治療相結(jié)合越來(lái)越被視為有前途的潛在腫瘤聯(lián)合治療方法[2-3]。

放療不僅具有介導(dǎo)DNA損傷從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡的作用，還可以通過(guò)觸發(fā)促炎介質(zhì)的釋放調(diào)節(jié)產(chǎn)生免疫原性和佐劑性，增加免疫刺激抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)并增強(qiáng)新抗原的表達(dá)[4-5]。總的來(lái)說(shuō)，放療所顯示出的積極的免疫刺激作用，一定程度上能被免疫學(xué)上稱(chēng)作的“冷”腫瘤變?yōu)椤盁帷蹦[瘤。通過(guò)驅(qū)動(dòng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和增強(qiáng)免疫原性，放療有可能增加腫瘤的免疫反應(yīng)。有研究表明，放療后腫瘤細(xì)胞DNA損傷這一內(nèi)在事件是驅(qū)動(dòng)免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵[4]。因此腫瘤細(xì)胞的自主效應(yīng)及其如何指導(dǎo)未來(lái)聯(lián)合治療是本綜述的重點(diǎn)。

本文總結(jié)了放射療法誘發(fā)的腫瘤基因組片段化激活細(xì)胞質(zhì)核酸傳感器（DNA sensors）的反應(yīng)從而引發(fā)細(xì)胞1型干擾素（Type 1 interferon,T1IFN）等細(xì)胞因子的表達(dá)，還將討論放療引起的DNA損傷和基因轉(zhuǎn)錄的改變對(duì)腫瘤新抗原表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。這些事件可以引起固有性和（或）適應(yīng)性抗腫瘤免疫程序的啟動(dòng)，為放療、DNA損傷修復(fù)（DNA damage response,DDR）抑制劑以及ICIs的聯(lián)合使用提供理論依據(jù)。

1 細(xì)胞質(zhì)核酸傳感器

1.1 放療通過(guò)cGAS-STING信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)DNA感應(yīng)

細(xì)胞質(zhì)核酸傳感器最初是細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors,PRRs）啟動(dòng)對(duì)DNA病毒的天然免疫反應(yīng)[6]。有研究證明，在放療抗癌的機(jī)制中一個(gè)關(guān)鍵因素是放療能夠引起增殖的腫瘤細(xì)胞DNA損傷并釋放至細(xì)胞質(zhì)從而激活細(xì)胞內(nèi)傳感器。其中細(xì)胞質(zhì)DNA傳感器環(huán)GMPAMP合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,cGAS）-干擾素誘導(dǎo)基因（stimulator of interferon genes，STING）途徑似乎在表型上占據(jù)了主導(dǎo)地位[7-8]。初步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)B型DNA與cGAS的結(jié)合觸發(fā)了第二信使（或稱(chēng)作免疫遞質(zhì)）cGAMP（cyclic GMP-AMP）的合成，cGAMP結(jié)合下游STING蛋白并激活TBK1（TANK binding kinase 1）蛋白激酶和IRF3（interferon regulatory factor 3）轉(zhuǎn)錄因子，最終誘導(dǎo)T1IFN的表達(dá)，而IFN-α/β能夠與干擾素α/β受體1（interferon alpha and beta receptor subunit 1,IFNAR1）結(jié)合在放療引起的抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]，見(jiàn)圖1。在小鼠模型中，外源性cGAMP和合成STING激動(dòng)劑亦可增強(qiáng)放射的效應(yīng)[7,11]。2017年Demaria團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脫氧核糖核酸酶TREX1（three prime repair exonuclease 1）能夠降解細(xì)胞質(zhì)中雙鏈DNA（doublestranded DNA，dsDNA），因此可以降低由cGAS產(chǎn)生cGAMP的水平，從而抑制放療的抗腫瘤免疫效應(yīng)。當(dāng)高劑量的放療（12～18 Gy）處理小鼠移植瘤時(shí)，TREX1蛋白能夠被誘導(dǎo)表達(dá)，而采用多次低劑量放療即連續(xù)3天8 Gy可以避免TREX1被誘導(dǎo)表達(dá)，最終使放療抑制腫瘤的效果顯著增加[12]。

目前，有報(bào)道顯示非腫瘤細(xì)胞中STING的激活是免疫激活的關(guān)鍵因素[7,11,13]。但在某些體內(nèi)模型中，腫瘤細(xì)胞固有的STING激活是必要的。在這種情況下，臨床前數(shù)據(jù)表明腫瘤細(xì)胞衍生的DNA和（或）源自cGAS催化產(chǎn)生的cGAMP可通過(guò)細(xì)胞間和外泌體傳遞到非腫瘤細(xì)胞中（如樹(shù)突狀細(xì)胞），從而擴(kuò)大T1IFN信號(hào)，有助于增加放射治療的抗腫瘤免疫效應(yīng)[12,14-16]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中cGAMP可以被細(xì)胞膜外以及基質(zhì)中的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1,ENPP1）降解，降低ENPP1的表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)放療產(chǎn)生的抗腫瘤免疫效應(yīng)[17]。此外，最近的研究表明跨膜蛋白SLC19A1（solute carrier family 19 member 1）是第一個(gè)被人們所認(rèn)知的cGAMP通道蛋白[18-19]。

1.2 其他細(xì)胞質(zhì)DNA傳感器及其與RNA傳感器的串?dāng)_

cGAS-STING途徑同時(shí)受到其他核酸傳感器的正串?dāng)_。除cGAS以外，還有類(lèi)似含CARD結(jié)構(gòu)域的NOD囊樣受體家族3（NLR family CARD domain containing 3,NLRC3）、IFNγ誘導(dǎo)蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)域16（interferon gamma inducible protein 16,IFI16）和DEAD-box解旋酶41（DEAD-box helicase 41,DDX41）等，它們都能夠結(jié)合dsDNA對(duì)STING介導(dǎo)的T1IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有積極影響，見(jiàn)圖1。NLRC3通過(guò)與STING相互作用從而阻止其功能，而且NLRC3與dsDNA結(jié)合后能夠有助于STING的釋放[20]。IFI16可以通過(guò)兩個(gè)HIN結(jié)構(gòu)域結(jié)合dsDNA，隨后通過(guò)吡啶結(jié)構(gòu)域與STING相互作用[21]。雖然有研究發(fā)現(xiàn)IFI16在IFNβ表達(dá)中沒(méi)有起到直接作用[22]，但總體而言，IFI16-STING相互作用增強(qiáng)STING依賴(lài)性IFNβ的產(chǎn)生[23-24]。DDX41同樣也可以結(jié)合dsDNA，并且與STING結(jié)合增強(qiáng)下游T1IFN的表達(dá)[25-26]。

小鼠腫瘤細(xì)胞在放射處理后還有許多RNA核酸傳感器上調(diào)，包括模式識(shí)別受體視黃酸誘導(dǎo)型基因Ⅰ（RIG-Ⅰ，也稱(chēng)為DDX58）和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5（MDA5，也稱(chēng)為IFIH1）[27]。在DNA感應(yīng)途徑和細(xì)胞質(zhì)RNA感應(yīng)途徑之間已經(jīng)確定了一定程度的串?dāng)_。雙鏈RNA（dsRNA）與細(xì)胞質(zhì)中RIG-1或MDA5的結(jié)合通過(guò)銜接蛋白MAVS來(lái)誘導(dǎo)T1IFN的表達(dá)。已有研究證明，放療誘導(dǎo)產(chǎn)生最大1型干擾素這一過(guò)程中，MAVS和RIG-Ⅰ的參與是必不可少的[28-29]。放射產(chǎn)生的具有5'-三磷酸并富含AT的dsDNA能夠被RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄形成dsRNA，也可以激活RNA感應(yīng)途徑中的MDA5和RIG-I途徑，見(jiàn)圖1。

1.3 cGAS對(duì)微核的監(jiān)測(cè)

最初人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)DNA是通過(guò)cGAS-STING途徑誘導(dǎo)T1IFN產(chǎn)生，但如何將這一過(guò)程與放療相結(jié)合并不十分清楚。最近有研究揭示了cGAS通過(guò)監(jiān)測(cè)放射處理所產(chǎn)生的微核和（或）小片段DNA，從而建立腫瘤細(xì)胞中放射處理與免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系。

放療在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)微核是一個(gè)公認(rèn)的現(xiàn)象。Harding等發(fā)現(xiàn)放射處理后腫瘤細(xì)胞中能夠產(chǎn)生微核，表明細(xì)胞分裂導(dǎo)致微核的產(chǎn)生。當(dāng)敲除非同源末端連接（non-homologous end joining,NHEJ）通路中的關(guān)鍵分子或利用DNA-PK抑制劑時(shí)，微核的產(chǎn)生受到抑制。重要的是，cGAS蛋白能夠與核膜破裂的微核中DNA相結(jié)合，激活下游STING以及誘導(dǎo)T1IFN的表達(dá)[4],見(jiàn)圖1。在具有微核的細(xì)胞中，干擾素刺激基因（interferon-stimulated gene,ISG）依賴(lài)于cGAS和STING方式的轉(zhuǎn)錄顯著增強(qiáng)[4-5,30]。此外，cGAS能夠被募集到DNA損傷位點(diǎn)并直接抑制DNA修復(fù)，從而可能進(jìn)一步促進(jìn)微核的形成，開(kāi)啟一個(gè)正反饋模式[31-32]。上述這些重要發(fā)現(xiàn)彌補(bǔ)了關(guān)于放療如何通過(guò)細(xì)胞質(zhì)微核衍生的DNA傳播炎性T1IFN反應(yīng)的知識(shí)空白。

2 放射誘導(dǎo)的抗原呈遞

2.1 放射誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)新抗原的呈遞

圖1 放療誘發(fā)腫瘤基因片段化與微核形成，從而激活細(xì)胞質(zhì)DNA/RNA核酸感受器，上調(diào)1型干擾素及促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)Figure 1 Radiation can induce tumor gene fragmentation and micronuclei formation,which then activates cytoplasmic DNA/RNA nucleic acid receptor and subsequently up-regulates the expression of type 1 interferon and proinflammatory cytokines

細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞清除腫瘤細(xì)胞需要識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ（MHC-Ⅰ）上呈遞的抗原。在這方面，放療顯示出較大的優(yōu)勢(shì)，既增加腫瘤細(xì)胞表面MHC-Ⅰ的表達(dá)，同時(shí)又調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞上的抗原呈遞。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)放射能夠上調(diào)現(xiàn)有和新型抗原在腫瘤細(xì)胞表面的呈遞。放療引起的DNA損傷能夠觸發(fā)一系列轉(zhuǎn)錄的改變，可以使得某些平時(shí)表達(dá)水平很低以及發(fā)生突變的多肽大量表達(dá)，觸發(fā)抗腫瘤免疫。在化療抵抗的轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者中利用CTLA4阻滯與放療聯(lián)合使用時(shí)，在具有完全反應(yīng)的患者中可以檢測(cè)到新抗原KPNA2（karyopherin subunit alpha 2）突變蛋白，且放療上調(diào)了KPNA2基因的表達(dá)。突變型KPNA2產(chǎn)生的抗原可促進(jìn)患者CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFNγ[2]。

2.2 放射產(chǎn)生的新抗原和T細(xì)胞受體庫(kù)

目前認(rèn)為突變負(fù)荷和腫瘤新抗原負(fù)荷通常可預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)ICIs的臨床反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞可能由于暴露于誘變劑（例如紫外線和吸煙）、DNA修飾和復(fù)制錯(cuò)誤（APOBEC3B表達(dá)或POLE突變），以及遺傳的或獲得性的DNA修復(fù)缺陷而產(chǎn)生高突變負(fù)荷。在許多癌癥類(lèi)型中，DDR途徑中基因的體細(xì)胞變異和表觀遺傳沉默普遍存在，這些患者的腫瘤可能同時(shí)具有高突變和新抗原負(fù)荷，以及細(xì)胞質(zhì)DNA驅(qū)動(dòng)的炎性反應(yīng)信號(hào)[33]。

放射治療也增加了T細(xì)胞中特異性TCR的表達(dá)和T細(xì)胞克隆的數(shù)量，再加上抗PD-1治療，能夠?qū)⑦@種增加的多樣性擴(kuò)展到放射之外的腫瘤部位，這一作用被稱(chēng)作遠(yuǎn)隔效應(yīng)（abscopal effect）。在對(duì)小鼠的放療和抗CTLA4阻斷反應(yīng)的TCR記憶庫(kù)研究中，放療增加了腫瘤內(nèi)T細(xì)胞TCR記憶庫(kù)的多樣性，并與抗CTLA4結(jié)合使用增強(qiáng)了對(duì)腫瘤的抑制作用[34-35]。目前尚不清楚在臨床上針對(duì)新的放射治療產(chǎn)生的腫瘤抗原的免疫應(yīng)答是否比增強(qiáng)既有腫瘤抗原的活性更重要，這也可以成為未來(lái)的一個(gè)研究方向。

3 放射引起腫瘤微環(huán)境的重塑

3.1 放療對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的影響

放療除了可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞表面MHC-Ⅰ的呈遞作用外，還可以顯著提高腫瘤抗原的交叉呈遞。在OT-1小鼠模型中，放射能夠增加淋巴結(jié)中被表達(dá)有MHC-I-SIINFEKL的樹(shù)突狀細(xì)胞和所激活的特異性效應(yīng)記憶的CD8+T細(xì)胞[36]。免疫原性所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與損傷相關(guān)分子模式（damageassociated molecular patterns,DAMP）的釋放，被人們了解較多的是Calreticulin、HMGB1（high mobility group box 1）和ATP，而放射能夠明顯增加Calreticulin、HMGB1和ATP的釋放[37]。此外，樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)于放射的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。CD11c+CD8α+BATF3系的樹(shù)突狀細(xì)胞是放療和抗CTLA4反應(yīng)的抗腫瘤效應(yīng)產(chǎn)生的關(guān)鍵[12]，而在小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞中缺少I(mǎi)FNAR1受體的表達(dá)則會(huì)逆轉(zhuǎn)這一抗腫瘤效應(yīng)[7]。

3.2 T細(xì)胞浸潤(rùn)

放療可促進(jìn)T細(xì)胞浸潤(rùn)所必需的細(xì)胞因子分泌。放射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性CXCL16（C-X-C motif chemokine ligand 16）的分泌，CXCL16能與Th1（T helper 1）細(xì)胞上的C-X-C趨化因子受體6（CX-C motif chemokine receptor 6,CXCR6）結(jié)合并激活CD8+T細(xì)胞[38]。放射可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞中T細(xì)胞趨化因子CXCL9和CXCL10的表達(dá)，而CXCL9和CXCL10則能夠與T細(xì)胞上的CXCR3結(jié)合，促進(jìn)T細(xì)胞的浸潤(rùn)。放射治療后，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞還可以被誘導(dǎo)表達(dá)ICAM1（intercellular adhesion molecule 1）和NKG2D配體RAE-1γ（由Raet1g編碼）。在T細(xì)胞浸潤(rùn)后，MHC-Ⅰ、ICAM1、RAE-1γ和NKG2D導(dǎo)致小鼠的T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中停滯，腫瘤細(xì)胞表達(dá)在放療和抗CTLA4的抗腫瘤效應(yīng)起到重要的作用[39]。但另一方面，放射在促進(jìn)抗原呈遞、樹(shù)突狀細(xì)胞功能和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)等方面的積極作用也會(huì)被上調(diào)的抑制性信號(hào)部分抵消。放射治療后，小鼠腫瘤中的調(diào)節(jié)性CD4+FOXP3+T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）也同時(shí)增加[27]。Treg細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生CTLA4信號(hào)、TGFβ而表現(xiàn)出免疫抑制作用[40-41]。因此，靶向Treg細(xì)胞聯(lián)合放療可能是有益的[34-35,42]。

3.3 抑制性髓樣細(xì)胞群（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）

經(jīng)典的炎性單核細(xì)胞在炎性反應(yīng)過(guò)程中被募集到組織中，它們可以分化為巨噬細(xì)胞或DCs，這些巨噬細(xì)胞或DCs可以表現(xiàn)出促炎或抗炎特性。同時(shí)，在腫瘤微環(huán)境某些細(xì)胞因子的作用下，炎性單核細(xì)胞還可以分化為MDSCs[40]。放射在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的CCL2-CCR2信號(hào)上調(diào)能夠誘導(dǎo)小鼠MDSCs的分化，從而增加放射治療后的免疫抑制作用[43-45]。小鼠中敲除Ccr2（C-C motif chemokine receptor 2）或Ccl2（C-C motif chemokine ligand 2）可以降低腫瘤微環(huán)境中MDSCs細(xì)胞的水平并增加放療的抗腫瘤效應(yīng)[41]。此外，在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，放射治療還能夠增加腫瘤微環(huán)境中MDSCs細(xì)胞PD-L1的表達(dá)[46-47]。因此這一現(xiàn)象也支持靶向PD-1或PD-L1聯(lián)合放療是有益的[48-49]。

4 結(jié)論

綜上所述，放射治療后腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的內(nèi)在信號(hào)在重塑炎性腫瘤微環(huán)境中具有舉足輕重的作用。放射引起的腫瘤細(xì)胞DNA損傷顯著增加了細(xì)胞質(zhì)微核和小片段DNA的水平，從而激活細(xì)胞質(zhì)核酸傳感器，尤其是cGAS及其下游STING蛋白信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中特定細(xì)胞表達(dá)1型干擾素。同時(shí)，放射治療能夠引起腫瘤細(xì)胞原有及特異新抗原的表達(dá)和遞呈，增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性。上述生物學(xué)效應(yīng)將促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞等具有抗腫瘤作用的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，降低MDSCs的免疫抑制作用。因此，以抑制免疫檢查點(diǎn)為手段的免疫治療與放療聯(lián)用具有潛在協(xié)同抗腫瘤作用。

放療引起的DNA損傷促使腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)DNA修復(fù)及應(yīng)激，從而修復(fù)損傷的DNA并產(chǎn)生放療抵抗（radioresistance）。因此，DNA修復(fù)及應(yīng)激中關(guān)鍵激酶的小分子抑制劑不僅能夠抑制DNA修復(fù)，增加放療的敏感度，同時(shí)也能夠增加放療引起的腫瘤細(xì)胞中微核和（或）小片段DNA的數(shù)量，進(jìn)一步激活cGAS-STING通路和1型干擾素的表達(dá)。在臨床前細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，多個(gè)DNA修復(fù)及應(yīng)激關(guān)鍵激酶的小分子抑制劑與放射治療和免疫治療聯(lián)用取得了令人振奮的結(jié)果。譬如，ATM蛋白激酶抑制劑KU60019、ATR激酶抑制劑AZD6738、PARP抑制劑olaparib和WEE1激酶抑制劑AZD1775[40,50-54]。更為重要的是，這些研究將有助于相關(guān)臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和開(kāi)展，使其在未來(lái)可能成為一種非常有希望的聯(lián)合治療方法。然而，如何安全有效地增強(qiáng)抗腫瘤免疫的效果，同時(shí)又減少免疫抑制作用，以及聯(lián)用中藥和放療的劑量與時(shí)間順序方面，仍需開(kāi)展相應(yīng)的工作以探索最佳的聯(lián)合效應(yīng)。我們期待利用放療及DNA修復(fù)與應(yīng)激關(guān)鍵激酶的小分子抑制劑增加免疫治療的有效率和持久性，為腫瘤治療提供新的思路，讓更多的腫瘤患者獲益。