趙峻英，董劍，何建春，梅小億，歐國平

(大足區(qū)人民醫(yī)院 檢驗科，重慶 402360)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(multiple-resistant staphylococcus aureus，MRSA)是金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)的一個獨特菌株，對多種抗生素耐藥，可引起嚴(yán)重的社區(qū)獲得性感染和醫(yī)源性感染[1-2]，由于其癥狀與其他細菌感染無明顯差異，臨床難以早期針對該菌感染進行精準(zhǔn)診斷和治療。常規(guī)的細菌培養(yǎng)方法通常需要2～3 d，甚至更久，難以滿足臨床的需求，因此，快速、靈敏、準(zhǔn)確的MRSA檢測手段，是控制其感染和流行的關(guān)鍵[3-4]。本研究擬以環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和實時熒光技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建實時熒光 LAMP(Rea-LAMP)，同時檢測葡萄球菌的mecA耐藥標(biāo)志性基因和SA特有的femA基因，并與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結(jié)果進行比較，初步探討實時熒光 LAMP(Rea-LAMP)方法快速鑒定MRSA在臨床應(yīng)用中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 隨機抽取2015年10月—2019年10月經(jīng)VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定并保存于-80 ℃冰箱的68株SA，其中MRSA 37株、MSSA 31株。本研究選擇的標(biāo)準(zhǔn)菌株為MSSA(ATCC25923)、MRSA(ATCC43300)、表皮葡萄球菌(ATCC49134)、溶血葡萄球菌(CGMCC1.10528)、人葡萄球菌(ATCC27844)、沃氏葡萄球菌(ATCC17917)、頭狀葡萄球菌(ATCC 35661)、科氏葡萄球菌(ATCC29974)、路鄧葡萄球菌(ATCC700328)、腐生葡萄球菌(ATCC49907)、耳狀葡萄球菌(ATCC33753)、產(chǎn)色葡萄球菌(ATCC 43764)、佩氏葡萄球菌(DSM19554)、中間葡萄球菌(ATCC51874)、大腸埃希菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯桿菌(ATCC700603)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、鮑曼不動桿菌(ATCC19606)和糞腸球菌(ATCC29212)標(biāo)準(zhǔn)菌株，由國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心提供。

1.1.2儀器與試劑 DEAOU-308C迪澳恒溫?zé)晒鈾z測儀、VITEK2 Compact全自動微生物分析儀、細菌核酸提取試劑盒購自重慶中元匯吉生物技術(shù)有限公司,Loopamp DNA擴增試劑盒、梅里埃DENSIMAT比濁儀99234。

1.2 方法

1.2.1細菌基因組DNA提取 將-80 ℃保存的19種標(biāo)準(zhǔn)菌株和68株臨床SA菌株接種于血平板上，于37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h,取平板上的菌落于無菌生理鹽水中制成麥?zhǔn)蠞岫葹?.0～4.0的菌懸液1.5 mL，按細菌核酸提取試劑盒說明書操作步驟提取細菌DNA。

1.2.2引物設(shè)計與合成 從美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)網(wǎng)站查找mecA和femA基因序列，并對查找到的基因序列使用Bioedit軟件進行比對，根據(jù)比對結(jié)果選擇保守區(qū)域利用LAMP引物設(shè)計軟件PrimerExplorer V5設(shè)計引物，引物序列由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成。見表1。

表1 SA的Rea-LAMP檢測體系引物

1.2.3Rea-LAMP反應(yīng)體系 將合成的引物序列F3、B3、FIP、BIP、LF、LB按1 ∶1 ∶8 ∶8 ∶4 ∶4混合配制引物混合液，然后取引物混合液1 μL進行Rea-LAMP反應(yīng)，總反應(yīng)體系25 μL：引物1 μL，2X反應(yīng)液12.5 μL，鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)8U，待檢菌株DNA 2 μL，SYBR 0.5 μL，超純水補足至25 μL，在恒溫?zé)晒鈾z測儀中進行反應(yīng)(63 ℃，1 h)。

1.2.4特異性試驗 按1.2.1方法將提取的MRSA和MSSA及其他17種革蘭陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)菌株的全基因組DNA，按照Rea-LAMP的反應(yīng)條件進行擴增，分析檢測信號并觀察熔解曲線，評價該體系引物的特異性。

1.2.5靈敏度試驗 測量提取的MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株全基因組DNA模板濃度，將濃度為1 mg/L的MRSA基因組DNA用超純水進行10倍梯度稀釋4次，得到5個不同濃度的DNA模板(1 000、100、10、1和0.1 μg/L),加入Rea-LAMP反應(yīng)體系中進行反應(yīng)，觀察擴增曲線，確定引物最低檢出限。

1.2.6重復(fù)性試驗 將MRSA和MSSA標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性菌株，其余17種標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性菌株，分別進行3次Rea-LAMP重復(fù)性試驗，所有標(biāo)準(zhǔn)菌株重復(fù)性試驗所用模板為同一模板。

1.2.7臨床菌株的檢測 用Rea-LAMP試驗體系對68株SA進行檢測，并與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1 特異性檢測結(jié)果

MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)femA和mecA基因擴增曲線，MSSA標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)femA基因擴增曲線，其余17種病原菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株未出現(xiàn)femA或mecA基因擴增曲線。擴增過程未出現(xiàn)引物二聚體的干擾，熔解曲線無雜峰。見圖1。

注：A為femA基因熔解曲線，B為mecA基因熔解曲線。

2.2 MRSA靈敏度試驗結(jié)果

本研究體系顯示1 μg/L MRSA基因組DNA約23 min出峰，出現(xiàn)擴增曲線，此濃度為本研究體系的最低檢測限,見圖2。

圖2 MRSA靈敏度檢測

2.3 各菌株重復(fù)性試驗結(jié)果

MRSA和MSSA各自的3個重復(fù)管幾乎同時出峰且擴增曲線幾乎重疊，其余菌株各自的3個重復(fù)管均無擴增曲線。

2.4 臨床菌株檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，對68株臨床菌株檢測結(jié)果與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結(jié)果一致,見表2。

表2 本研究測試結(jié)果與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結(jié)果比較

3 討論

MRSA一直以來是全球引起感染性疾病的重要病原菌之一，其耐藥性嚴(yán)重、耐藥機制復(fù)雜，使得臨床感染死亡率增高，成為當(dāng)今感染醫(yī)學(xué)的一個難題[5-7]。

相關(guān)研究證明，MRSA菌株的耐藥性主要由mecA基因介導(dǎo)[8-9],其編碼產(chǎn)生的青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)使菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力明顯降低，從而使細菌產(chǎn)生耐藥性[10-12]。故SA一旦獲得mecA基因，便可表現(xiàn)為高度和多重耐藥。

femA基因為SA所特有的基因，也是MRSA耐藥性的輔助基因[13-14]，在MRSA中，femA基因啟動子或調(diào)控區(qū)域的插入，可使細菌細胞壁成分或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，協(xié)助mecA基因降低對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，從而導(dǎo)致對甲氧西林耐藥[15-16]。

對于臨床實驗室而言，選擇合適的檢測方法，準(zhǔn)確及時地發(fā)出檢驗報告尤為重要。LAMP是2000 年，由日本學(xué)者Notomi等[17]提出的一種恒溫核酸擴增技術(shù)，其特點是反應(yīng)快、特異性強、靈敏度高、檢測成本低以及操作簡單等，被廣泛應(yīng)用于分子診斷技術(shù)中[18-22]。本研究基于LAMP的基本原理，在mecA和femA基因序列上設(shè)計6條引物：2條外引物(F3、B3)、2條內(nèi)引物(FIP、BIP)和2條環(huán)引物(LF、LB)，特異性識別mecA和femA基因序列上的6個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)。內(nèi)引物雜交在目標(biāo)DNA區(qū)域，啟動互補鏈的合成，再通過外引物在同一鏈上互補序列，這樣周而復(fù)始形成有很多莖-環(huán)DNA混合物。環(huán)引物提高了反應(yīng)靈敏度，縮短了反應(yīng)時間，從而實現(xiàn)對目的DNA序列的快速擴增。同時，在反應(yīng)體系中加入了SYBR熒光染料，反應(yīng)過程在DEAOU-308C迪澳恒溫?zé)晒鈾z測儀中進行，可對整個反應(yīng)過程進行實時動態(tài)檢測。

本研究將LAMP的快速性和實時熒光的敏感性有機結(jié)合起來建立了Rea-LAMP檢測MRSA的新方法，主要特點包括以下5個方面。(1)特異性強，在靶基因mecA和femA的6個不同的區(qū)域設(shè)計了6條不同引物，要使目標(biāo)序列快速擴增，引物必須與靶序列的6個區(qū)域嚴(yán)格識別配對，不受非目標(biāo)DNA的干擾。本實驗選取了MRSA、MSSA和17種其他常見病原菌的全基因組DNA同時作為模板在Rea-LAMP檢測體系中擴增，僅MRSA和MSSA出現(xiàn)相應(yīng)的擴增曲線。(2)檢測靈敏度高，本Rea-LAMP檢測體系的靈敏度達1 μg/L。(3)速度快，1 h以內(nèi)即可完成檢測，大大縮短了檢測周期。常規(guī)的細菌培養(yǎng)的檢測方法通常需要2～3 d，甚至更久，本研究與常規(guī)的細菌培養(yǎng)和鑒定方法相比時間大大縮短，與普通的PCR方法相比省去了PCR模板的高溫變性和低溫退火步驟，節(jié)約了溫度變化導(dǎo)致的時間耗損。(4)穩(wěn)定性好，MRSA和MSSA作為陽性樣品，各自的3個重復(fù)管幾乎同時出峰且擴增曲線幾乎重疊，說明該反應(yīng)體系具有良好的穩(wěn)定性。(5)實時動態(tài)檢測，本研究體系通過收集熒光信號，可對擴增體系進行實時動態(tài)檢測，及時跟蹤檢驗結(jié)果。同時，由于本研究的熒光染料SYBR在反應(yīng)前加入，避免了實驗反應(yīng)結(jié)束后開蓋導(dǎo)致氣溶膠污染。

在臨床菌株檢測中，同時出現(xiàn)mecA和femA擴增曲線的為MRSA，只出現(xiàn)femA擴增曲線的為MSSA。所檢測的臨床68株SA中，檢測出MRSA37株，MSSA31株，與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結(jié)果一致。由于本研究體系所檢測的臨床菌株數(shù)量有限，需增加菌株的數(shù)量做進一步的驗證。本研究只是定性檢測，下一步需要將嘗試設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量檢測。本研究只能檢測mecA和femA基因，對與MRSA耐藥機制有關(guān)的其他基因如mecC基因等[23-25]無法檢出。也無法區(qū)分MRSA和MSSA感染或定植。

綜上所述，雖然本研究的Rea-LAMP檢測MRSA的體系具有一定的局限性，但具有特異性強、穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡單快捷的特點，并且能夠?qū)崟r動態(tài)觀察檢測結(jié)果，可為MRSA提供一種新的的快速檢測方法。