魏艷玲，李志強(qiáng)，畢勝利，王琳冬，楊娜，胡亞欣

(1.河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院 病理科, 河北 張家口 075100; 2.順義婦兒醫(yī)院, 北京 101300；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心, 貴州 貴陽 520004)

妊娠期高血壓是由多種誘發(fā)因素引起的綜合性疾病，主要表現(xiàn)高血壓、蛋白尿、浮腫等臨床癥狀，嚴(yán)重的威脅孕婦和胎兒的健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期高血壓主要引起胎盤組織缺血、缺氧，導(dǎo)致機(jī)體的炎癥和血管內(nèi)皮功能障[2]，血管內(nèi)皮損傷或功能障礙是妊娠期高血壓疾病發(fā)生的重要影響因素[3]。鈣超敏是指血管平滑肌細(xì)胞收縮蛋白對(duì)鈣的敏感性升高，是誘發(fā)妊娠期高血壓的重要原因[4]。因此，通過調(diào)控血管鈣敏感性對(duì)改善妊娠期高血壓具有重要的意義。鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)是屬于G蛋白偶聯(lián)受體C家族成員，可通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放和Ca2+內(nèi)流而達(dá)到調(diào)控Ca2+濃度的目的，CaSR廣泛分布于血管及血管內(nèi)皮細(xì)胞中[5]。有研究證實(shí)，CaSR參與了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)Ca2+內(nèi)流和一氧化氮(NO)的合成[6]。在鼠的腸系膜動(dòng)脈和豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，采用CaSR激動(dòng)劑可以激活CaSR而引起中電導(dǎo)系數(shù)鈣敏感K+通道開放，并介導(dǎo)細(xì)胞膜超極化[7]，證實(shí)CaSR在細(xì)胞鈣敏感性中發(fā)揮重要作用。外泌體是一類直徑大小為40～100 nm的細(xì)胞膜性囊泡，可通過遞送源細(xì)胞中的生物學(xué)物質(zhì)，如核酸，蛋白質(zhì)以及微小RNA等影響周圍細(xì)胞或自體細(xì)胞的功能[8-9]，能夠促進(jìn)血管生成，是胎盤血管系統(tǒng)生成，胎兒合適的循環(huán)和免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵[10]。研究表明，胎盤來源外泌體與妊娠及其并發(fā)癥存在密切關(guān)聯(lián)[11-12]，但是有關(guān)胎盤外泌體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣敏感性的作用尚不清楚。本研究分別采用分離得到的妊娠期高血壓孕婦或正常孕婦胎盤外泌體與HUVECs共培養(yǎng)48 h，采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)CaSR蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)，TUNEL染色檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，探討高血壓孕婦胎盤外泌體對(duì)血管鈣敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)樣本 選取婦產(chǎn)科分娩的足月妊娠孕婦及妊娠期高血壓孕婦作為研究對(duì)象，于清晨采集空腹肘外周靜脈血3 mL，放置于抗凝管內(nèi)，靜置30 min，2 000 r/min離心10 min分離血漿，放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要試劑 HUVECs細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫中心提供，胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)基購買于gibco公司，小鼠抗人Bcl-2和Bax單克隆抗體購買于Cell Signaling Technology公司，兔抗人CaSR購買于SantaCruz公司，兔抗人腫瘤易感基因101蛋白(tumor susceptibility gene 101 protein，TSG101)和溶酶體相關(guān)膜蛋白3(CD63)購買于Abcam公司，兔抗人β-actin單克隆抗體購買于Proteintech公司，TUNEL染色試劑盒購買于碧云天公司，實(shí)驗(yàn)涉及的耗材購買于中杉金橋公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)主要儀器和設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)，-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán))，4 ℃及-20 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)，PCR儀器(賽默飛ABI公司)，Western Blot檢測(cè)裝置(美國(guó)Bio-Rad伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1胎盤外泌體提取 取儲(chǔ)存在-80 ℃的血漿并按照SBI提供的ExoQuick試劑盒進(jìn)行外泌體提取。首先將培養(yǎng)完成的細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿，并與等體積ExoQuick Exosome precipitation solution(SBI)充分混合，將混合液4 ℃靜置20 h，3 000 r/min離心20 min，丟棄上清，再1 500 r/min離心10 min，收集得到外泌體沉淀物。

1.2.2外泌體檢測(cè) (1)電鏡觀察Exosomes：2%戊二醛重懸并固定Exosomes，PBS清洗2次，1%的餓酸固定1 h，PBS清洗2次，乙醇脫水10 min，環(huán)氧丙烷浸泡10 min，最后將所取標(biāo)本浸透、干燥、包埋、聚合、切片、染色，電鏡下觀察外Exosomes形態(tài)學(xué)特征；(2)Western blot檢測(cè)Exosomes標(biāo)志性蛋白CD63和TSG101表達(dá)：Exosomes樣品定量，并將提取的Exosomes采用細(xì)胞裂解液充分裂解，蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、孵育一抗、孵育二抗、顯影，使用膠片曝光，圖片掃描后用 Image J 軟件計(jì)算各條帶的灰度值，以各目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)與處理 取復(fù)蘇后的HUVECs細(xì)胞按照1×108/L接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中后置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h后可見細(xì)胞貼壁，此時(shí)首次換液，然后每2 d換液1次；約3 d細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，此時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代用0.25%胰蛋白酶(含 0.02%乙二胺四乙酸)消化2 min，胎牛血清終止消化，按此法反復(fù)傳代培養(yǎng)增殖。將HUVECs細(xì)胞分為3組，正常對(duì)照組(Control組)為單獨(dú)HUVECs細(xì)胞，與妊娠期高血壓孕婦胎盤來源外泌體共培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞作為處理組(Exosome組)，與正常孕婦胎盤來源外泌體共培養(yǎng)的的HUVECs細(xì)胞作為陰性對(duì)照組(negative control，NC組)。將提取得到的外泌體與HUVECs共培養(yǎng)48 h，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.4HUVECs 細(xì)胞CaSR、Bax及Bcl-2表達(dá) 采用Western blot法檢測(cè)，將處理完成的HUVECs放置于1.5 mL的組織研磨管內(nèi)，按照1 ∶4比例加入細(xì)胞裂解液，在已預(yù)冷后的細(xì)胞組織勻漿儀中進(jìn)行研磨；4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞上清液，并進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量檢測(cè)；每孔上樣量為40 μg進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白分子量大小以及蛋白marker指示進(jìn)行切膠，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，孵育對(duì)應(yīng)CaSR(1 ∶500)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)及內(nèi)參照β-actin(1 ∶5 000)，4 ℃過夜，加入相應(yīng)二抗(1 ∶5 000)1～2 h，于搖床搖晃洗膜，含吐溫磷酸鹽緩沖液(TPBS)洗滌后加入ECL，使用膠片曝光，圖片掃描后用 Image J 軟件計(jì)算各條帶的灰度值，以各目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5HUVECs 細(xì)胞凋亡 采用TUNEL染色法，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，在對(duì)應(yīng)的96孔板內(nèi)加入50 μL的TUNEL染色液，37 ℃避光孵育1 h，傾去細(xì)胞染色液PBS洗滌3次，DAPI染核3 min，PBS洗滌2次，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胎盤來源外泌體提取與鑒定

如圖1所示，透射電鏡觀察胎盤來源外泌體呈橢圓形或部分圓形形狀，直徑大小為40～100 nm，Western blot結(jié)果顯示本研究提取的外泌體高表達(dá)CD63和TSG101。提示本研究成功提取到胎盤來源外泌體。

注：A為透射電鏡結(jié)果，B為Western blot結(jié)果。

2.2 CaSR蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，Exosome組HUVECs細(xì)胞CaSR表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與NC組比較，Exosome組HUVECs細(xì)胞CaSR表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與Control組相比，P<0.01。

2.3 HUVECs細(xì)胞的凋亡率

TUNEL染色結(jié)果顯示，與Control組比較，Exosome組HUVECs細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.01)；與NC組比較，Exosome組HUVECs細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖3。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組和NC組比較，Exosome組HUVECs細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平明顯降低、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Bax表達(dá)升高、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Control組與NC組Bax、Bcl-2表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

注：(1)與Control組相比，P<0.01；(2)與NC組相比，P<0.05。

注：(1)與NC組相比，P<0.05；(2)與Control組相比，P<0.01。

3 討論

CaSR在維持全身鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，研究已經(jīng)證實(shí)，CaSR可以通過感受細(xì)胞外Ca2+濃度改變進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞功能[13]。CaSR包含N-端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和C-端結(jié)構(gòu)域，傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[14]。其中CaSR能夠通過作用NOS活性調(diào)控NO生成進(jìn)而參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能的調(diào)節(jié)[15]。因此，通過調(diào)控CaSR表達(dá)對(duì)維持內(nèi)皮細(xì)胞的鈣敏感性至關(guān)重要。

妊娠期高血壓是孕婦孕期中常發(fā)的一種血管性疾病。其中內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常是妊娠期高血壓多種血管并發(fā)癥的病理學(xué)基礎(chǔ)[16-17]。研究已證實(shí)妊娠期高血壓患者血管內(nèi)皮功能會(huì)發(fā)生明顯的病變，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張和收縮功能的異常[18]。胎盤血管的異常是妊娠期高血壓患者的主要病變之一。胎盤血管形成有利于維持孕婦宮內(nèi)胎兒的發(fā)育，在妊娠期間胎盤可以通過釋放外泌體到達(dá)全身的循環(huán)系統(tǒng)，參與妊娠期間母胎界面的免疫調(diào)節(jié)、胎盤血管屏障的形成等重要事件調(diào)控[19]。妊娠期并發(fā)癥，如子癇前期等胎盤功能紊亂相關(guān)疾病的發(fā)生，可能與胎盤來源外泌體異常密切相關(guān)[20]。但是目前有關(guān)胎盤來源外泌體與妊娠期高血壓孕婦血管的關(guān)系及其對(duì)血管鈣敏感性的作用尚不清楚。因此，本研究前期通過分離并提取了正常孕婦和妊娠期高血壓孕婦胎盤來源外泌體并鑒定。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，妊娠期高血壓孕婦胎盤來源外泌體含量顯著升高，高表達(dá)TSG101和CD63，電鏡觀察外泌體直徑大小在40～100 nm，具有細(xì)胞膜性囊泡，提示外泌體分離成功。在成功提取得到胎盤來源外泌體后，將外泌體與HUVECs共孵育48 h檢測(cè)CaSR蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與Control組相比，Exosome組內(nèi)皮細(xì)胞CaSR表達(dá)明顯升高，NC組對(duì)CaSR表達(dá)無顯著性影響。上述結(jié)果初步證實(shí)，妊娠期高血壓孕婦胎盤來源外泌體可能通過促進(jìn)CaSR表達(dá)增加血管內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的鈣敏感性進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。在大鼠急性心肌梗死模型中，大鼠心肌組織CaSRmRNA和蛋白表達(dá)均顯著性升高，細(xì)胞數(shù)顯著增加，表明CaSR參與心肌梗死的發(fā)展，其機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)[21]。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是血管內(nèi)皮損傷和功能障礙的重要因素。在妊娠期高血壓大鼠胎盤組織中凋亡相關(guān)蛋白如Bax，Caspase-3表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低。表明細(xì)胞凋亡與妊娠期高血壓胎盤血管病變密切相關(guān)[22-23]。本研究再進(jìn)一步通過TUNEL染色檢測(cè)外泌體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。與Control組相比，Exosome組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率明顯升高；NC組無顯著性差異，Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax表達(dá)的結(jié)果顯示：相比Control組，Exosome組血管內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯降低，Bax表達(dá)明顯升高；NC組無顯著性影響。有研究證實(shí)，活化CaSR的蛋白，通過一系列的G蛋白，能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣和MAPK信號(hào)途徑進(jìn)而激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24-25]。但是本研究結(jié)果顯示在妊娠期高血壓患者發(fā)生發(fā)展過程中，胎盤來源外泌體能夠促進(jìn)HUVECs細(xì)胞CaSR表達(dá)增加，但是是否也通過MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如Bax，Bcl-2的表達(dá)，從而調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，將在下一步研究中進(jìn)行探討。

綜上所述，胎盤來源外泌體與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育能夠促進(jìn)CaSR誘導(dǎo)血管敏感性增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并最終加重妊娠期高血壓孕婦胎盤血管損傷。