晏燕，陳先卓，秘雙燕，吳增波**

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000；2.珠海拜博口腔醫(yī)院，廣東 珠海 519000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是全球最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而我國(guó)每年新發(fā)病例數(shù)占全球發(fā)病總數(shù)的50.0%，居國(guó)內(nèi)惡性腫瘤死亡率第2位[1]。目前，臨床上對(duì)于OSCC以手術(shù)治療為主，通過(guò)手術(shù)能切除病灶組織，延緩病情發(fā)展，且隨著外科技術(shù)、圍術(shù)期處理水平的提高，OSCC手術(shù)成功率得到提高[2]。但是，OSCC患者預(yù)后較差，5年生存率僅為40%～50%，這可能與患者術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。已有臨床研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)在啟動(dòng)上皮來(lái)源腫瘤中發(fā)揮了重要的作用[4]。在EMT過(guò)程中，E鈣黏蛋白、角蛋白等呈低表達(dá)，N鈣黏蛋白、波形蛋白等呈高表達(dá)，且隨著病情的不斷發(fā)展，細(xì)胞會(huì)脫離細(xì)胞束縛而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5]。人婆羅雙樹(shù)樣基因4(human borne double tree-like gene 4，SALL4)是新發(fā)現(xiàn)的含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在原始生殖細(xì)胞腫瘤中呈特異性表達(dá)，并在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[6]。既往研究表明，SALL4啟動(dòng)子為STAT3結(jié)合區(qū)，具有激活細(xì)胞自我更新、胚胎干細(xì)胞功能調(diào)節(jié)能力，其傳導(dǎo)通路與腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)存在緊密聯(lián)系，但是其具體作用機(jī)制及在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用尚未闡明[7]。因此，本文采取細(xì)胞對(duì)照方法進(jìn)行研究，探討OSCC中SALL4調(diào)控相關(guān)miRNAs的鑒定及其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 OSCC Tca8113細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.1.2主要試劑與儀器 青-鏈霉素胎牛血清、改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco，DMEM)及高糖培養(yǎng)基(美國(guó)hyclone)，β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz)，LipfectmineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen)，SALL4 RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Ambion)、噻唑藍(lán)(methylthiazolydiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)試劑盒(日本同仁)，7500聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基因擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI)，凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一)，細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Gibco)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) OSCC Tca8113細(xì)胞接種于10%胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)基中，置37 ℃的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合80%后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，備用。

1.2.2半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)法測(cè)定SALL4調(diào)控相關(guān)miRNAs表達(dá) 構(gòu)建負(fù)載miRNA前體序列的慢病毒重組體轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，上、下調(diào)Tca8113細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá)豐度，分別設(shè)為上調(diào)組與下調(diào)組，以單純Tca8113細(xì)胞作為對(duì)照；取處理后的細(xì)胞，加 trizol 500 μL充分混合均勻，加氯仿0.2 mL，15 s劇烈震蕩，常溫靜置2～3 min，3 500 r/min離心15 min[8-9]；取RNA沉淀，轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加異丙醇0.5 mL，混合均勻置于-20 ℃冰箱，1 194 g離心10 min；充分洗滌RNA沉淀，加入DEPC 250 μL與乙醇750 μL，4 500 r/min離心5 min，取沉淀置工作臺(tái)干燥20 min；利用紫外分光度儀檢測(cè)RNA濃度并完成RNA提純(以Rnase作為空白對(duì)照)，在A260下測(cè)定吸光度值；采用Dnase酶處理RNA，處理完畢后放入冰箱中；利用RT-PCR完成轉(zhuǎn)染前后SALL4mRNA表達(dá)水平(表2)，設(shè)定PCR反應(yīng)條件為30 ℃、10 min，42 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min，連續(xù)35個(gè)循環(huán)，72 ℃、10 min延長(zhǎng)；選擇獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，放入1.5%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測(cè)定，β-actin為內(nèi)對(duì)照[10]。實(shí)驗(yàn)所用印務(wù)序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物

1.2.3Western blot方法檢測(cè)SALL4蛋白表達(dá) 分別取OSCC Tca8113的細(xì)胞，PBS連續(xù)洗滌3次，加RIPA后置冰上裂解30 min，4 ℃下2 500 r/min離心30 min，收集上清液，采用免疫組織化學(xué)蛋白定量(bicinchoninic acid，BCA)法定量測(cè)定蛋白含量；10.0%SDS-PAGE電泳分離蛋白，對(duì)半干轉(zhuǎn)法，速度1 000 r/min離心20 min，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜封閉2 h；加SALL4蛋白一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBS-T洗膜5次，5 min/次；加SALL4蛋白二抗連續(xù)孵育2 h，過(guò)夜，TBS-T 5次洗膜，5 min/次，加少許ECL增強(qiáng)化學(xué)檢測(cè)試劑，分子成像儀上獲得結(jié)果；利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA對(duì)SALL4的靶向調(diào)控，經(jīng)過(guò)鑒定的miRNA記為miRNA-S[11]。

1.2.4Transwell小室測(cè)定細(xì)胞侵襲能力 miRNA(miRNA-S)的前體序列載體，轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，檢測(cè)SALL4調(diào)控相關(guān)的miRNA對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。將細(xì)胞放置于無(wú)血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108個(gè)/L，備用；常規(guī)消化、離心后調(diào)整細(xì)胞密度為2×108個(gè)/L，取細(xì)胞懸液200 μL輕輕加入Transwell小室，再加10.0%血清DMEM培養(yǎng)液600 μL，待細(xì)胞沉到小室底膜后，小室整體放入培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)12 h；取出Transwell小室，去除室內(nèi)培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min，采用PBS溶液沖洗，采用結(jié)晶紫色染色液染色3 min，醫(yī)用棉棒輕輕擦拭小室膜上表面未穿過(guò)的細(xì)胞，PBS沖洗小室；載玻片上加PBS，置于小室上方，倒置顯微鏡下拍照，隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野下，計(jì)算細(xì)胞穿過(guò)底膜的細(xì)胞數(shù)量，并分析細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)目[12-13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SALL4 mRNA表達(dá)

結(jié)果顯示，上調(diào)組Tca8113細(xì)胞中SALL4 mRNA表達(dá)水平均高于下調(diào)組和對(duì)照組，下調(diào)組則低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組Tca8113細(xì)胞中SALL4 mRNA的表達(dá)

2.2 SALL4蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，上調(diào)組、下調(diào)組Tca8113細(xì)胞中SALL4蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均高于對(duì)照組且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.3 SALL4調(diào)控相關(guān)miRNAs的鑒定

結(jié)果顯示，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA 對(duì)SALL4 的靶向調(diào)控，經(jīng)過(guò)鑒定的miRNA 記為miRNA-S。見(jiàn)圖2。

注：1、2及3分別為對(duì)照、miRNA及miRNA-S泳道。

2.4 細(xì)胞侵襲能力

結(jié)果顯示，上調(diào)組、下調(diào)組Tca8113細(xì)胞干預(yù)后遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但均少于對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組Tca8113細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目的比較

3 討論

OSCC是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，且隨著人們生活方式方式的改變，導(dǎo)致疾病發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，影響患者健康和生活[14]。臨床研究表明，OSCC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素過(guò)程，普遍認(rèn)為與個(gè)體遺傳基因、不良生活習(xí)慣、腫瘤的預(yù)防及篩查有關(guān)，亦與原癌和抑癌基因失衡有關(guān)，導(dǎo)致基因發(fā)生突變或失活，引起惡性腫瘤復(fù)發(fā)率較高[15-16]。目前，臨床上對(duì)于OSCC以手術(shù)切除為主，利用手術(shù)能切除病灶組織，延緩病情發(fā)展，但是患者遠(yuǎn)期治療預(yù)后較差，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[17-18]。SALL4是人體中常見(jiàn)的基因，能伴隨著組織、器官的成熟而成熟，其表達(dá)數(shù)量將呈下降趨勢(shì)[19]。但是，惡性腫瘤患者SALL4基因數(shù)量較高，能直接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[20]。本研究中，上調(diào)組Tca8113細(xì)胞中SALL4 mRNA表達(dá)水平均高于下調(diào)組和對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組SALL4 mRNA表達(dá)水平低于下調(diào)組(P<0.05)，說(shuō)明SALL4在OSCC患者中呈高表達(dá)，能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。

在人體內(nèi)，SALL4基因突變常涉及多個(gè)器官缺陷的常染色體顯性疾病[21]。國(guó)外學(xué)者研究表明，在白血病、胃癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌、肝癌或子宮內(nèi)膜癌患者中SALL4基因多呈高表達(dá)[22-23]；同時(shí)在正常人體血液系統(tǒng)中，SALL4在CD34陽(yáng)性造血干/祖細(xì)胞中均呈高表達(dá)，隨著造血細(xì)胞成熟后，SALL4基因表達(dá)水平結(jié)果處于異常狀態(tài)[24-25]。為了進(jìn)一步確定SALL4調(diào)控相關(guān)miRNAs在OSCC中的作用，本研究中采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA對(duì)SALL4的靶向調(diào)控，經(jīng)過(guò)鑒定的miRNA記為miRNA-S；上調(diào)組或下調(diào)組細(xì)胞干預(yù)后期遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；上調(diào)組或下調(diào)組干預(yù)后細(xì)胞的遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組(P<0.05)，由此看出SALL4調(diào)控相關(guān)miRNAs在OSCC中以miRNA-S表達(dá)為主，能抑制口腔鱗狀細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)，從而能延緩病情發(fā)展。

綜上所述，SALL4調(diào)控相關(guān)miRNAs在OSCC細(xì)胞中呈低表達(dá)，能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，有望成為OSCC治療新靶點(diǎn)。