羅語思，肖美蘭，陳妍，張科

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 急診科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點實驗室 & 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室 & 藥學(xué)院天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

多數(shù)細胞內(nèi)新合成的蛋白需要由胞內(nèi)各馬達蛋白經(jīng)細胞骨架微絲或微管定向運輸?shù)桨麅?nèi)各處，以履行其功能[1]；神經(jīng)細胞、上皮細胞及大部分血管內(nèi)皮細胞作為具有極性的細胞，均由馬達蛋白調(diào)控胞內(nèi)新合成蛋白的運輸[1]。馬達蛋白主要由驅(qū)動蛋白超家族(kinesins，Kifs)、動力蛋白超家族(dyneins)和肌球蛋白超家族(myosins)組成，其中Kifs由4個結(jié)構(gòu)域組成，分別是馬達結(jié)構(gòu)域、超螺旋部分的二聚化結(jié)構(gòu)域、連接馬達結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域的頸部及兩條重鏈(kinesin heavy chain，KHC)和輕鏈(kinesin light chain，KLC)共同構(gòu)成的尾部[1-2]。運輸?shù)鞍讜r主要通過水解三磷酸腺苷獲能供馬達結(jié)構(gòu)域在細胞微管上做定向運動，其運輸?shù)牡鞍装ň€粒體蛋白[3]、溶酶體蛋白(lysosome-associated membrane protein 2，LAMP2)[4]、神經(jīng)細胞突觸素(synaptophysin)[5]、神經(jīng)細胞突觸膜前體蛋白1(syntaxin 1)[6]以及載脂蛋白E受體2(apolipoprotein E receptor 2，ApoEr2)[7]等，上述蛋白通過與Kifs尾部結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合或通過與Kifs頸部和輕鏈間接作用而結(jié)合后以細胞微管為軌道做定向運動。目前已在哺乳動物基因組中發(fā)現(xiàn)45個Kifs基因，依據(jù)馬達結(jié)構(gòu)域的位置不同而劃分為N-Kifs，M-Kifs和C-Kifs。Kinesin1基因家族屬于N-Kifs，Kif5b是Kinesin1基因家族重要成員，其蛋白廣泛表達在各組織細胞[1,8]。研究表明Kif5b參與了腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[9]，如在1例非小細胞肺癌患者的轉(zhuǎn)移灶中首次發(fā)現(xiàn)Kif5b-Ret融合基因[10]。Ret表達產(chǎn)物Ret蛋白為酪氨酸激酶受體，Kif5b-Ret融合基因表達的融合蛋白由Kif5b的馬達結(jié)構(gòu)域和超螺旋結(jié)構(gòu)域和Ret編碼的酪氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域組成，該融合蛋白通過超螺旋結(jié)構(gòu)域形成同源二聚體，激活細胞內(nèi)酪氨酸激酶蛋白，透過數(shù)條信號通路導(dǎo)致細胞癌變，因此被認為是非小細胞肺癌的下一個重要酪氨酸激酶抑制劑作用靶點[8]。同時，Kif5b亦被發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控溶酶體、線粒體和金屬基質(zhì)蛋白酶-1等的運輸參與乳腺腫瘤發(fā)生[11-12]。腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié)是新生血管生成，在腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中發(fā)揮重要作用[13-14]。Kif5b是否參與調(diào)控新生血管生成尚未見報道，本研究以驅(qū)動蛋白Kif5b為研究對象，通過慢病毒系統(tǒng)感染HUVECs下調(diào)其表達，獲取驅(qū)動蛋白Kif5b影響HUVECs血管形成的實驗依據(jù)，為進一步開展細胞驅(qū)動蛋白通過影響血管內(nèi)皮細胞形成從而參與腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程的科學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞和質(zhì)粒 HUVECs為Angiogenesis Starter試劑盒內(nèi)容物之一，HEK293T和慢病毒載體pLL3.7及其助手質(zhì)粒(pVSVG、pGag和pRev)均由本?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點實驗室保存。

1.1.2主要試劑及儀器 Angiogenesis Starter試劑盒、細胞染料Calcein AM、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、Geltrex? LDEV-無低生長因子的基底膜基質(zhì)(Geltrex? Matrix)及Pierce BCA Protein Assay Kit均購自美國Thermo Fisher公司(批號A14609-01、C3099、L3000-015、A14132-02和23225)，嘌呤霉素和Tubulin單抗購自美國Sigma-Aldrich公司(批號61-385-RA和T6199)，QIAquick Gel Extraction Kit和Qiagen Plasmid Maxi Kit購自德國Qiagen公司(批號28706和12163)，Lenti-XTMp24 Rapid Titer Kit購自Takara公司(批號632200)，HEK293T細胞培養(yǎng)所需培養(yǎng)基及HUVECs培養(yǎng)所需左旋谷氨酰胺和青鏈雙抗購自美國Gibco公司；Gene Pulser Xcell電轉(zhuǎn)儀購自美國Bio-Rad公司，Nikon Eclipse TE2000-s倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司，MME-250金屬鹵化物光源購自日本Moritex公司，Neo sCMOS照相機購自英國牛津儀器公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HUVECs培養(yǎng)于含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、1%青鏈雙抗和血管內(nèi)皮細胞生長因子的M200培養(yǎng)基；HEK293T培養(yǎng)于含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、100 μmol/L MEM非必須氨基酸、10%胎牛血清、500 mg/L G418和1%青鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 實驗分為Kif5b實驗組和Kif5b對照組2組，Kif5b實驗組是基于pLL3.7質(zhì)粒和靶向降解Kif5b基因mRNA的小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)為基礎(chǔ)構(gòu)建的Kif5b敲減HUVECs組，Kif5b對照組是基于pLL3.7質(zhì)粒和陰性對照shRNA為基礎(chǔ)構(gòu)建的HUVECs陰性對照組。Kif5b實驗組質(zhì)粒構(gòu)建，首先以人Kif5b編碼區(qū)基因序列(GenBank序列號為NM_004521.2)為模板設(shè)計shRNA以及陰性對照shRNA(表1，斜體示shRNA序列)。分別以pLL3.7空質(zhì)粒為模板，表1序列為引物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)，純化PCR產(chǎn)物和pLL3.7空質(zhì)粒進行酶切連接，電轉(zhuǎn)E.coliDH5α感受態(tài)細胞后37 ℃過夜培養(yǎng)，獲得的陽性克隆經(jīng)PCR驗證后分別命名為Kif5b實驗組質(zhì)粒和Kif5b對照組質(zhì)粒分別用于Kif5b敲減和對照。隨后分別提取Kif5b實驗組質(zhì)粒、Kif5b對照組質(zhì)粒和pLL3.7載體慢病毒系統(tǒng)助手質(zhì)粒(pVSVG、pGag和pRev)。

表1 Kif5b實驗組和Kif5b對照組質(zhì)粒構(gòu)建引物(5′-3′)

1.2.3質(zhì)粒重組慢病毒包裝及滴度測定 分別取Kif5b實驗組質(zhì)?；騅if5b對照組質(zhì)粒 6 μg、pVSVG 2 μg、pGag 6 μg和pRev 6 μg，按轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000操作手冊操作后加入HEK293T細胞中，培養(yǎng)8 h吸棄上清，加含2%胎牛血清的Opti-MEM繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集上清并過濾，-80 ℃保存?zhèn)溆?。Kif5b實驗組重組慢病毒和Kif5b對照組重組慢病毒滴度按照Lenti-XTMp24 Rapid Titer Kit手冊操作測定。

1.2.4重組慢病毒感染HUVECs及篩選 將等量Kif5b實驗組和Kif5b對照組重組慢病毒與M200培養(yǎng)基等體積混合加入HUVECs中，于37 ℃和5%CO2無菌細胞培養(yǎng)箱中感染48 h，以2 g/L嘌呤霉素篩選被慢病毒感染的細胞，經(jīng)篩選獲得的Kif5b實驗組HUVECs即代表Kif5b實驗組，Kif5b對照組HUVECs即代表Kif5b對照組。

1.2.5Kif5b表達 首先裂解Kif5b實驗組和Kif5b對照組細胞，隨后按照Pierce BCA Protein Assay Kit操作手冊定量細胞總蛋白；取等量蛋白變性后進行Western blot實驗檢測Kif5b表達，同時以Tubulin單抗檢測內(nèi)參Tubulin，按照Image J軟件操作手冊比較Kif5b實驗組和Kif5b對照組的Kif5b表達情況，實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.6HUVECs細胞成管實驗 參考文獻[15]方法將Geltrex? Matrix按0.1 mL/孔加入預(yù)冷24孔板，37 ℃靜置30 min，將培養(yǎng)好的Kif5b實驗組和Kif5b對照組HUVECs按1×105細胞/250 μL培養(yǎng)基/孔接種入Geltrex?Matrix涂層的24孔板中，培養(yǎng)10 h；DPBS清洗細胞，含2 g/L Calcein AM的DPBS緩沖液于黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)30 min，485 nm波長激發(fā)光Nikon Eclipse TE2000-s倒置熒光顯微鏡觀察記錄，每組細胞選取3孔計算細胞成管率，實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.7HUVECs細胞劃痕實驗 參考文獻[16]方法將100 mg/L多聚賴氨酸過夜包被細胞培養(yǎng)皿，次日2 g/L牛血清白蛋白封閉，加M200培養(yǎng)基浸泡培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)好的Kif5b實驗組和Kif5b對照組HUVECs消化后接種于培養(yǎng)皿，6 h后以無菌p200吸管尖將單層細胞輕柔劃開，吸棄原培養(yǎng)基和細胞碎片，加新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。使用軟件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)通過比較劃痕實驗后0 h和9 h的圖像，計算HUVECs細胞遷移速度，實驗獨立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Kif5b表達

Western blot實驗結(jié)果顯示，在蛋白上樣量相當(dāng)?shù)那闆r下，Kif5b實驗組HUVECs的Kif5b表達較Kif5b對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明Kif5b實驗組重組慢病毒構(gòu)建成功，能夠為后續(xù)實驗結(jié)果可靠性提供保證。見圖1。

注：A為Western blot實驗結(jié)果，B為Kif5b的定量表達結(jié)果；(1)與Kif5b對照組比較，P<0.05。

2.2 細胞成管率

細胞成管實驗結(jié)果顯示，Kif5b實驗組HUVECs幾乎不能形成毛細管狀結(jié)構(gòu)，但Kif5b對照組細胞能夠形成該結(jié)構(gòu)；Kif5b實驗組HUVECs細胞成管率明顯低于對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)，說明敲降Kif5b的HUVECs細胞成管能力明顯下降。見圖2。

注：A為細胞成管實驗熒光圖(100×)，B為細胞成管率的定量表達；(1)與Kif5b對照組比較，P<0.000 1。

2.3 細胞遷移速度

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與0 h比較，9 h時Kif5b實驗組和對照組細胞HUVECs均能向劃痕中心遷移，且Kif5b實驗組HUVECs細胞遷移速度明顯低于Kif5b對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。見圖3。

注：A為細胞劃痕實驗白光圖(100×)，紅色直線示劃痕中心位置，兩側(cè)紅色虛線示劃痕邊緣位置；B為細胞遷移速度的定量結(jié)果；(1)與Kif5b對照組比較，P<0.000 1。

3 討論

本研究以了解驅(qū)動蛋白Kif5b對HUVECs血管形成的作用為目的，探討Kif5b可能通過影響HUVECs血管形成從而參與瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程，以pLL3.7慢病毒系統(tǒng)將Kif5b為目的蛋白的shRNA導(dǎo)入HUVECs中，下調(diào)Kif5b表達，隨后通過細胞成管實驗和細胞劃痕實驗觀察發(fā)現(xiàn)Kif5b對HUVECs細胞形成管狀結(jié)構(gòu)和促進細胞遷移具有重要作用。

內(nèi)皮細胞高表達的CD151和內(nèi)皮細胞特異性分子-1(Endocan)等蛋白已被報道與血管生成密切相關(guān)，Endocan還被特別指出與腫瘤血管生成密切相關(guān)[17-18]。腫瘤血管生成是腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的基石，近年來已有一系列關(guān)于Kif5b參與肺腫瘤和乳腺腫瘤的報道[8-12]，但有研究發(fā)現(xiàn)Kif5b可通過對線粒體的運輸參與Myc癌基因在轉(zhuǎn)錄階段對線粒體轉(zhuǎn)運的一系列基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[19]，這提示Kif5b可能通過Myc對于腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用，應(yīng)考慮Kif5b在腫瘤中的作用，可能不只局限于肺腫瘤和乳腺腫瘤，在多數(shù)實體腫瘤的發(fā)生和進展中也可能具有重要作用。本研究中，通過下調(diào)Kif5b表達分析出該驅(qū)動蛋白對HUVECs細胞管狀結(jié)構(gòu)形成和細胞遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)下調(diào)Kif5b的表達能夠明顯抑制細胞形成管狀結(jié)構(gòu)和促進細胞遷移的能力，這些證據(jù)提示驅(qū)動蛋白Kif5b很可能參與了以HUVECs為代表的人血管內(nèi)皮細胞形成新生血管，進而對Kif5b在實體腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用提供了實驗依據(jù)。同時在胃部腫瘤相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路關(guān)鍵效應(yīng)因子含有WW 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1(WW domain-containing transcription regulator protein 1，WWTR1)與Wnt 通路效應(yīng)分子β-catenin高度正相關(guān)，且WWTR1與β-catenin的表達水平與HUVECs增殖和管道形成能力呈正相關(guān)[20]；已有報道顯示與WWTR1介導(dǎo)胞核轉(zhuǎn)運的14-3-3γ蛋白與Kif5b-KLC1高度關(guān)聯(lián)[21]。此外，還有研究使用了和本課題類似的技術(shù)下調(diào)Kif5b表達，分析了該驅(qū)動蛋白對MDCK細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Kif5b沉默后誘導(dǎo)MDCK細胞經(jīng)歷了上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，去分化為間充質(zhì)干細胞樣細胞[22]。上述報道為進一步拓展本研究的結(jié)論提供了方向。

綜上，本研究下調(diào)了HUVECs細胞中Kif5b的表達后，通過細胞成管實驗和細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)Kif5b對人血管內(nèi)皮細胞形成管狀結(jié)構(gòu)和細胞遷移均具有正向調(diào)節(jié)作用。下一步還需通過構(gòu)建Kif5b過表達系統(tǒng)，開展類似實驗，以及一系列如WWTR1、14-3-3γ與Kif5b互作的機制研究，同時也展開動物實驗，為進一步揭示肌動蛋白Kif5b參與血管形成的作用機制，以及其在腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中參與新生血管形成的機制奠定更加堅實基礎(chǔ)。