夏萬(wàn)松，夏英，韋四喜，周春歡，杜洪，袁婷，金泳，黃海*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 貴陽(yáng) 550001；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，貴州 貴陽(yáng) 550004；4.貴航貴陽(yáng)醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 貴陽(yáng) 550009)

人類基因組中超過(guò)90%的基因轉(zhuǎn)錄后發(fā)生可變剪接[1-3]。在可變剪接的過(guò)程中，剪接復(fù)合體選擇不同的5′ 端或3′ 端剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致外顯子的包含或跳躍[4-5]，同一基因產(chǎn)生多種成熟的RNA變異體[6-7]，并翻譯出多種蛋白質(zhì)亞型[8-9]，導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)亞型的功能差異甚至完全相反[10-11]，例如人類線粒體核糖體蛋白L33(mitochondrial ribosomal protein L33，MRPL33)基因在胃癌中通過(guò)可變剪接產(chǎn)生MRPL33-L和MRPL33-S兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，MRPL33-S通過(guò)抑制PI3K/AKT/CREB信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而MRPL33-L功能則相反[12]。由此可見(jiàn)，可變剪接在機(jī)體生理病理的過(guò)程中都發(fā)揮非常重要的作用。人類乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)是19種乙醛脫氫酶同工酶之一，在催化有毒醛方面起著關(guān)鍵的作用[13-15]。ALDH2對(duì)乙醛的Km值約為0.2 μmol，是19 種同工酶中最低的，是對(duì)醛類親和力最高的同工酶[16-17]。因此，在人類不同的ALDH同工酶中，ALDH2是清除體內(nèi)有毒醛最為有效的酶[18-19]。在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息(national center for biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中，ALDH2被報(bào)道位于染色體12q24.12，存在兩個(gè)變異體(variant，V)，ALDH2 V1共13個(gè)外顯子，編碼的蛋白質(zhì)為517氨基酸(amino acid，aa)；ALDH2 V2共12 個(gè)外顯子，編碼的蛋白質(zhì)為470 aa。與ALDH2 V1相比，ALDH2 V2缺少外顯子3，長(zhǎng)度為141核苷酸(nucleotide，nt)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/217)，見(jiàn)圖1。然而，ALDH2在可變剪接方面的研究未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究采用胃癌細(xì)胞作為模型研究ALDH2基因發(fā)生可變剪接的現(xiàn)象。為了確定人類ALDH2基因發(fā)生可變剪接的情況，本研究在正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞(AGS、HGC-27、MKN45)及正常人外周血中，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)ALDH2基因發(fā)生可變剪接的情況，以期為ALDH2基因在可變剪接方面的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中ALDH2存在兩個(gè)變異體

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料 GES-1、AGS、HGC-27、MKN45細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院，正常人外周抗凝全血收集于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，于-80 ℃冰箱保存。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑及儀器 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)于烏拉圭Lonsera公司，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，總RNA提取試劑盒、TRIZOL reagent、T載體PCR產(chǎn)物快速連接試劑盒、DNA純化試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，克隆質(zhì)粒測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，RT試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司，Taq DNA聚合酶購(gòu)于美國(guó)Vazyme公司，ABI Pro FlexTM梯度PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)、瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、GeneGnome凝膠成像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) GES-1、AGS、HGC-27細(xì)胞在含有10% FBS的1 640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MKN45細(xì)胞在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所有細(xì)胞在37 ℃，5% CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合率為80%左右時(shí)收獲細(xì)胞。

1.2.2引物設(shè)計(jì) 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載ALDH2基因的基本信息。設(shè)計(jì)正向引物F46(位于外顯子1)、正向引物F80(位于外顯子1)、反向引物R441(位于外顯子3)、反向引物R493(位于外顯子4)用于ALDH2基因的可變剪接分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 ALDH2引物序列

1.2.3外周血白細(xì)胞(WBC)、細(xì)胞總RNA提取及RT為互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA) 根據(jù)索萊寶紅細(xì)胞裂解液產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)裂解人外周抗凝全血紅細(xì)胞，用于提取WBC總RNA。根據(jù)生工總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取WBC和細(xì)胞總RNA用于RT為cDNA。取5 μg總RNA按照TaKaRa RT試劑盒制造說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT反應(yīng)獲得第一鏈cDNA。

1.2.4PCR擴(kuò)增及測(cè)序 以WBC和細(xì)胞的cDNA為模板，用表1相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析ALDH2基因發(fā)生可變剪接的情況。PCR體系(25 μL)：2×Green Taq Mix 12.5 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸4 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠分離，根據(jù)生工DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的DNA片段。目的DNA片段根據(jù)生工T載體PCR產(chǎn)物快速連接試劑盒說(shuō)明書(shū)連接至T載體，然后進(jìn)行TA克隆后送生工測(cè)序。

1.2.5生物信息學(xué)分析 使用BLAST工具進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)分析。使用DNAStar軟件分析ALDH2變異體的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)ALDH2基因發(fā)生可變剪接情況

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中ALDH2基因mRNA的示意圖見(jiàn)圖2A。在外顯子1設(shè)計(jì)兩個(gè)正向引物，在外顯子3和4各設(shè)計(jì)1個(gè)反向引物，引物示意圖見(jiàn)圖2A。用正向引物F80和反向引物R493進(jìn)行PCR擴(kuò)增WBC的cDNA，在瓊脂糖凝膠中意外地發(fā)現(xiàn)3個(gè)條帶，見(jiàn)圖2B。位于頂部分子量最大的帶經(jīng)TA克隆測(cè)序證實(shí)為V1。最底部的帶經(jīng)TA克隆測(cè)序證實(shí)為一個(gè)新的變異體(命名為V1-1)，與V1相比缺少191 nt。通過(guò)TA克隆測(cè)序證實(shí)中間的帶為V1和V1-1形成的異二聚體(heterodimer，HD)。用正向引物F46和反向引物R441進(jìn)行PCR擴(kuò)增人類胃癌細(xì)胞(AGS、HGC-27、MKN45)、人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和WBC的cDNA，在瓊脂糖凝膠中發(fā)現(xiàn)4個(gè)條帶，見(jiàn)圖2C。位于頂部的帶經(jīng)TA克隆測(cè)序證實(shí)為V1。底部的3條帶通過(guò)TA克隆測(cè)序證實(shí)為3個(gè)新的變異體(分別命名為V1-2、V1-3、V1-4)，這3個(gè)新的變異體都缺少V1的部分序列，分別是226 nt、240 nt及289 nt。利用圖解展示V1與新發(fā)現(xiàn)的變異體之間的差異。見(jiàn)圖2D。

注：A為ALDH2基因mRNA及引物示意圖(僅展示V1和V2的5′端的幾個(gè)外顯子)，B為RT-PCR擴(kuò)增WBC的瓊脂糖凝膠結(jié)果，C為RT-PCR擴(kuò)增胃癌細(xì)胞(AGS、HGC-27、MKN45)、GES-1、WBC的瓊脂糖凝膠結(jié)果，D為ALDH2 mRNA變異體示意圖。

2.2 ALDH2變異體生物信息學(xué)

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，V1(NM_000690.4)僅1個(gè)翻譯起始密碼子ATG(mRNA為AUG)，位于51～53位核苷酸，V1的翻譯終止密碼子TAA(mRNA為UAA)位于1 602～1 604位核苷酸。使用DNAStar軟件分析V1的ORF，確定了V1總共存在8個(gè)ORF，每個(gè)ORF長(zhǎng)度都超過(guò)100個(gè)氨基酸，但是末端翻譯終止密碼子TAA都在1 602～1 604位核苷酸，見(jiàn)圖3A。使用DNAStar軟件分析出V1-1最長(zhǎng)的ORF，其翻譯起始密碼子ATG位于外顯子2。這是由于V1-1缺少的核苷酸數(shù)目非3的倍數(shù)，相當(dāng)于導(dǎo)致移碼突變。因此，V1-1的蛋白質(zhì)N末端的20氨基酸與其他所有蛋白質(zhì)都不同，而C末端的391氨基酸與V1是相同的，見(jiàn)圖3B。使用DNAStar軟件分析出V1-2、V1-4最長(zhǎng)的ORF是相同的。與V1相比，V1-2和V1-4的蛋白質(zhì)氨基酸缺少N端的95氨基酸，示意圖見(jiàn)圖2B。使用DNAStar軟件分析出V1-3最長(zhǎng)的ORF，其翻譯起始密碼子ATG與V1一致，翻譯終止密碼子TAA在1 362-1 364位核苷酸。因此V1-3的蛋白質(zhì)氨基酸與V1相比，缺少7～86位氨基酸，見(jiàn)圖2B。

注：A示對(duì)ALDH2變異體1的ORF進(jìn)行生物信息學(xué)分析，“start nt”表示ATG的核苷酸“A”在cDNA序列中的位置(僅展示長(zhǎng)度超過(guò)100氨基酸的ORF)，B示對(duì)ALDH2變異體蛋白質(zhì)氨基酸進(jìn)行生物信息學(xué)分析(垂直對(duì)齊在同一位置的方框表示相同的氨基酸序列，黑色方框表示的氨基酸序列不存在于其他任何蛋白質(zhì)中，方框中的數(shù)字表示蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目)。

3 討論

真核生物的生命活動(dòng)是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，需要依賴機(jī)體內(nèi)的各種蛋白質(zhì)在正確的時(shí)間或者空間發(fā)揮正確的生理功能，如此才能保證機(jī)體生命活動(dòng)的完成；真核生物復(fù)雜的生命活動(dòng)最終還是靠蛋白質(zhì)精細(xì)的完成[20]。組成一個(gè)哺乳動(dòng)物大約需要10萬(wàn)個(gè)基因，而實(shí)際數(shù)字不到這個(gè)數(shù)字的四分之一[21]?，F(xiàn)在的研究已證實(shí)，由于Pre-mRNA轉(zhuǎn)錄后發(fā)生可變剪接，通過(guò)這一過(guò)程，可以從單個(gè)基因產(chǎn)生多種不同功能的mRNA，從而翻譯出功能不同的蛋白質(zhì)[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)ALDH2的4個(gè)變異體都是V1通過(guò)可變剪接形成的。V1-3缺少的核苷酸數(shù)目是3的倍數(shù)，并且位于V1的翻譯起始密碼子ATG之后。V1-3以V1對(duì)應(yīng)的翻譯起始密碼子ATG作為其翻譯起始密碼子，翻譯出蛋白質(zhì)的N末端會(huì)缺少V1的部分氨基酸序列。本研究認(rèn)為V1-3表達(dá)出蛋白質(zhì)的可能較大。相反的是，V1-1、V1-2、V1-4缺少的核苷酸數(shù)目均不是3的倍數(shù)。V1-1和V1-2缺少的核苷酸位于V1的翻譯起始密碼子ATG之后，V1-1和V1-2以V1對(duì)應(yīng)的翻譯起始密碼子ATG作為其翻譯起始密碼子，翻譯出的蛋白質(zhì)除N末端很小部分與V1相同外，C末端與V1完全不一致。因?yàn)閂1-1和V1-2被翻譯出的蛋白質(zhì)相當(dāng)于移碼突變，大部分氨基酸序列與V1不一致，這也許可當(dāng)作一種新的蛋白質(zhì)。因此，V1-1和V1-2是否真正被翻譯出蛋白質(zhì)，本研究并不明確，并未做進(jìn)一步的研究。有趣的是，V1-4缺少的核苷酸包含了V1對(duì)應(yīng)的翻譯起始密碼子ATG。如果V1-4翻譯出蛋白質(zhì)，顯然，其翻譯起始密碼子ATG將不再是V1對(duì)應(yīng)的翻譯起始密碼子ATG，將會(huì)是靠近3′末端的ATG。無(wú)論V1-4以3′末端的任何ATG作為翻譯起始密碼子，翻譯出的蛋白質(zhì)始終缺少V1 N末端的部分氨基酸。然而，V1編碼的蛋白質(zhì)N末端的17 個(gè)氨基酸是它進(jìn)入線粒體基質(zhì)發(fā)揮功能的信號(hào)肽[25]。V1-4翻譯出的蛋白質(zhì)在沒(méi)有N末端信號(hào)肽存在的情況下，其是否還能進(jìn)入線粒體發(fā)揮催化乙醛的功能，這是未知的。

綜上，ALDH2通過(guò)可變剪接可以產(chǎn)生多個(gè)mRNA變異體，并很可能產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列可能與V1相同，也可能不相同。提示ALDH2存在復(fù)雜的蛋白表達(dá)功能，在機(jī)體內(nèi)扮演非常重要的角色，也為ALDH2在不同個(gè)體酶活力不同，在可變剪接方面的研究奠定了基礎(chǔ)。