彭爽，吳旭玲，于云莉,2，董楝,2，徐祖才，葉蘭，馮占輝*

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院 神經(jīng)病學教研室, 貴州 貴陽 550004；3.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

癲癇是雙側(cè)大腦半球神經(jīng)元異常放電所致的一組綜合征，臨床表現(xiàn)為反復癇性發(fā)作，給患者本人及家庭帶來沉重的負擔[1-3]。反復癲癇性發(fā)作會導致神經(jīng)元凋亡、壞死及丟失，以及膠質(zhì)細胞增生等病理變化，隨著病程進展，上述病理變化呈逐漸加重趨勢[4-6]。盡管對癲癇的相關研究較多[7-8]，但其形成的病理生理機制仍不清楚，尚需進一步探索。鈉氫交換體1(Na+/H+exchanger-1，NHE1)屬于已知鈉氫交換體(Na+/H+exchanger，NHE)7個亞型之一[9-10]。有學者對易發(fā)癲癇的沙鼠癲癇發(fā)作后立即取海馬組織進行研究，發(fā)現(xiàn)海馬中NHE1蛋白在癲癇發(fā)作3 h明顯升高，6 h恢復正常，故推測NHE1蛋白表達增高與癲癇發(fā)生密切有關[11]，但不能說明癲癇反復發(fā)作的長期過程中NHE1的表達特點。因此，本研究嘗試應用慢性癲癇動物模型進一步探索癲癇發(fā)作過程中NHE1的表達特點。慢性癲癇動物模型主要包括點燃模型和外傷性模型，點燃模型又包括電點燃模型及化學點燃模型，其中化學點燃模型包括氯化鋰-匹羅卡品和海仁酸點燃模型[12]，氯化鋰-匹羅卡品主要是針對海馬損害的動物模型，可以很好模擬顳葉癲癇的病理學特征[13]，本研究選擇該模型進一步探討NHE1在癲癇模型鼠海馬的表達特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 清潔級Sprague-Dawley(SD)60 d雄性大鼠99只，體質(zhì)量(250±30)g，購自本校實驗中心。實驗均遵守本校動物倫理委員會規(guī)定(NO.1900644)。

1.1.2主要藥物、試劑與儀器 匹羅卡品和氯化鋰(美國Sigma)，4%多聚甲醛(北京雷根生物)，10%水合氯醛(上海新華化工)，地西泮10 mg/2 mL(成都倍特)，親和素-生物素復合液、二氨基苯并胺及山羊抗兔二抗(中杉金橋)，NHE1抗體(美國GeneTex)，β-actin抗體(美國Santa Cruz)，RNAiso Plus和PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara Bio)，化學發(fā)光顯色試劑(electrochemiluminescence，ECL，美國Pierce)，SuperMaza動物行為視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息)，腦立體定向儀(成都泰盟)，PM20自動顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1氯化鋰-匹羅卡品點燃癲癇大鼠模型建立 54只大鼠按文獻[14]進行建模，即在大鼠清醒狀態(tài)腹腔注射氯化鋰127 mg/kg，20 h后腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg，30 min后腹腔注射匹羅卡品50 mg/kg，用藥后觀察大鼠行為學改變。按Racine分級為標準[15]，0級為無抽搐發(fā)作，Ⅰ級為面部和嘴抽動，Ⅱ級為點頭運動，Ⅲ級為單側(cè)前肢陣攣，Ⅳ級為發(fā)作中雙側(cè)前肢抽搐、伴或不伴身體立起，Ⅴ級為全面性強直-陣攣發(fā)作、即身體背曲強直和跌倒。大鼠持續(xù)或者間斷癲癇性發(fā)作(Racine Ⅳ-Ⅴ級)1 h后，腹腔注射地西泮10 mg/kg予以終止癲癇持續(xù)發(fā)作、降低死亡率。大鼠癲癇發(fā)作在Ⅳ級及以上時視為造模成功，造模過程中死亡9只，最終獲得氯化鋰-匹羅卡品點燃癲癇大鼠模型45只作為模型組。另取45只大鼠作為對照組，采用腹腔注射生理鹽水，實驗過程同模型組。

1.2.2蛋白印跡(Western blot) 取模型組和對照組大鼠各36只，依次在自發(fā)性癇性發(fā)作開始第1、3、7、14、30及60天(每一個時間點2組各6只)予大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后斬首處死，快速分離海馬組織，并置于液氮中，-80 ℃下儲存。取模型組和對照組大鼠冰凍的海馬組織，磨碎腦組織，按試劑盒說明書提取大鼠腦組織中的蛋白，用BCA試劑測定所提取的蛋白濃度。從樣品中提取蛋白50 μg于8%SDS-PAGE上電泳，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上；室溫5%BSA孵育PVDF纖維膜1.5 h，兔抗大鼠NHE1(1 ∶4 000)和β-actin(1 ∶1 000)孵育PVDF膜4 ℃過夜；次日室溫下孵育NHE1膜，加山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)孵育2 h。暗室中加ECL顯色試劑對蛋白條帶進行顯影。用Quantity One 4.6.2軟件分析NHE1的相對含量，β-actin作為內(nèi)參[16]。

1.2.3免疫組織化學 在自發(fā)性癲癇性發(fā)作開始第14天，取模型組和對照組大鼠各3只，采用免疫組化分析NHE1蛋白表達分布。海馬的處理方法如下：模型組大鼠和對照組大鼠麻醉后先采用生理鹽水灌流，再用4%多聚甲醛灌注，取海馬組織固定于4%多聚甲醛內(nèi)，蔗糖梯度脫水、液氮冷凍后冰凍切片，厚度10 μm，切片貼于預先處理好的載玻片上，-80 ℃；準備做免疫組織化學分析的標本采用石蠟包埋，切片厚度為5 μm，用于后續(xù)分析[17]。石蠟切片于二甲苯中脫蠟，98 ℃微波爐中于10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH=6)中加熱10 min；37 ℃恒溫浴箱內(nèi)，切片置于0.3%H2O2孵育10 min，0.4%Triton X-100(Sigma)處理15 min，加山羊血清針對非特異性抗原進行封閉，于4 ℃下與兔抗大鼠NHE1抗體(1 ∶100；GeneTex)孵育過夜；PBS洗滌3次，抗兔二級抗體37 ℃孵育30 min，用親和素-生物素復合液孵育30 min，PBS洗滌；用二氨基苯并胺檢測免疫反應性，蘇木精復染，在質(zhì)膜上呈棕色染色的細胞被認為是NHE1表達陽性的細胞[18]。用PBS代替一抗，作為陰性對照。用PM20自動顯微鏡采集圖像[18]。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR) 在自發(fā)性癇性發(fā)作開始第14天，取模型組和對照組大鼠各6只采用RT-PCR方法檢測大鼠海馬NHE1 mRNA的表達。根據(jù)試劑盒說明書，使用RNAiso Plus從組織中提取總RNA，用分光光度法260/280 nm處測定RNA的濃度和純度。采用PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒從1 μg總RNA合成互補DNA(cDNA)。反轉(zhuǎn)錄于37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，反應混合物中加焦碳酸二乙酯80 μL，總體積達100 μL，由Takara Bio設計合成RT-PCR引物。大鼠NHE1：順義鏈5′-GCGGCGAGCAGATCAATAA-3′，反義鏈 5′-ACAGTGACGGCATCGTTGAG-3′。選擇GAPDH為管家基因：順義鏈5′-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3′，反義鏈5′-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′[18-19]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 海馬組織勻漿中NHE1蛋白表達

進入慢性穩(wěn)定期發(fā)作后第1、3、7、14、30及60天時，相同時間點模型組大鼠海馬組織NHE1蛋白表達較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組大鼠海馬組織NHE1蛋白表達從第1天開始增高，第14天時達到高峰，第30天和第60天逐漸下降(P<0.05)。見圖1。

注：A為免疫印跡條帶，B為條帶半定量分析；(1)與同時點對照組比較，P<0.05。

2.2 海馬組織NHE1表達

免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，第14天時模型組大鼠海馬不同亞區(qū)(CA1～CA3區(qū))檢測到強NHE1免疫反應，主要分布在神經(jīng)元的胞體和樹突中，但對照組相應區(qū)域的NHE1染色較輕。見圖2。

注：C、D分別為A、B內(nèi)方框放大圖像，箭頭所示為染色陽性神經(jīng)元。

2.3 NHE1 mRNA的表達

結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠海馬NHE1 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為電泳條帶，B為條帶半定量分析；(1)與對照組比較，P<0.05。

3 討論

NHE1主要表達在細胞膜上，在腦組織表達廣泛[20]。NHE1作為細胞膜蛋白可以結(jié)合多種信號分子，結(jié)合后形成轉(zhuǎn)導復合物，可以對胞內(nèi)外信號做出快速而準確的反應[21-22]。本課題組開展了相關實驗研究，結(jié)果表明癲癇大鼠造模成功后，NHE1蛋白表達隨時間變化呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，于第14天達到高峰，然后逐漸下降，且高于同時點對照組；RT-PCR以及免疫組織化學等方法進一步明確NHE1表達部位及mRNA表達特點，第14天模型組大海馬不同亞區(qū)(CA1～CA3區(qū))檢測到強NHE1免疫反應，主要分布在神經(jīng)元的胞體和樹突中；模型組大鼠海馬NHE1 mRNA水平高于與對照組(P<0.05)。

Kang等[11]研究顯示易發(fā)癲癇的沙鼠在癲癇發(fā)作后NHE1立即升高，并于發(fā)作后6 h恢復正常。然而，該研究沒有進一步探討沙鼠在反復發(fā)作后NHE1蛋白表達的趨勢。本課題組發(fā)現(xiàn)隨著大鼠慢性癲癇模型構(gòu)建成功后，模型組大鼠NHE1表達呈逐漸增高趨勢，且該趨勢提示在第60天時NHE1蛋白表達仍然沒有恢復到正常水平。本課題組分析，本研究采取的是氯化鋰-匹羅卡品點燃誘導的慢性癲癇模型，與易發(fā)癲癇沙鼠動物模型完全不同；其次觀察時間段也差距較大，故認為本課題組研究結(jié)果是之前研究結(jié)果很好的補充，二者并不矛盾。通過動態(tài)觀察NHE1的動態(tài)變化，課題組發(fā)現(xiàn)NHE1隨著慢性癲癇模型的進展，NHE1蛋白仍逐漸升高，且沒有恢復正常，故提示在癇性反復發(fā)作的情況下，NHE1依然處于活躍狀態(tài)。

課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)元凋亡、壞死等病理變化密切相關的μ-calpain和m-calpain蛋白表達增高[18,23]。m-calpain和μ-calpain屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員，神經(jīng)元內(nèi)Ca2+離子濃度變動較大時可激活二者，促發(fā)水解酶對細胞骨架和相關蛋白質(zhì)產(chǎn)生降解作用，從而破壞結(jié)構(gòu)蛋白以及酶的功能，導致神經(jīng)元凋亡或壞死[24-25]。結(jié)合本研究的實驗結(jié)果，可以認為在調(diào)控酸堿平衡的過程中，NHE1可能導致Ca2+過度進入神經(jīng)元促進了鈣信號通路的激活，進一步激活μ-calpain和m-calpain蛋白，從而參與了神經(jīng)元細胞凋亡或壞死的發(fā)生。本實驗僅就NHE1蛋白表達特點進行了探討，但機制研究尚不足，今后研究可通過細胞層面進一步干預NHE1蛋白表達，觀察神經(jīng)元凋亡及壞死的改變。

基于前期研究，課題組推測NHE1過度激活可能參與癲癇的進一步進展，其機制可能如下：既往研究顯示NHE1的主要功能是維持胞內(nèi)酸堿平衡，防止細胞內(nèi)過度的酸化[9]。NHE1激活與神經(jīng)元內(nèi)pH值密切相關，pH值明顯降低時可激活NHE1，NHE1被激活后排除H+、攝入Na+，從而提高神經(jīng)元內(nèi)pH值；當NHE1過度轉(zhuǎn)運Na+到細胞內(nèi)，造成Na+超載，胞內(nèi)Na+超載可激活Na+/K+ATP酶，將細胞內(nèi)排出3個Na+和同時2個K+進入細胞內(nèi)，細胞內(nèi)Na+超載也會刺激Na+/Ca2+交換體(NCX)活性增強，從而增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，最終調(diào)控細胞功能[22]。故有理由推測，在慢性癲癇動物模型反復癇性發(fā)作后，NHE1出現(xiàn)功能活躍狀態(tài)，癇性發(fā)作后進入糾正酸中毒的過程中，從而導致神經(jīng)元內(nèi)鈣超載現(xiàn)象。

綜上所述，本研究結(jié)果表明NHE1過度激活參與了大鼠慢性癲癇的病理生理過程，NHE1表達增高可能是大鼠癲癇發(fā)生和發(fā)展的促發(fā)因素，在癲癇反復發(fā)作過程中，為了維持酸堿平衡，過度激活導致鈣離子激活，促進凋亡發(fā)生可能性較大。未來針對NHE1的干預可能使得對慢性癲癇模型鼠海馬神經(jīng)元的凋亡及壞死的控制成為可能。