廖春香，安媛媛，車啟元，陳亮，龍世棋，王念雪，楊薇，趙星*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細胞實驗中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；3.安順市人民醫(yī)院 胸甲乳外科，貴州 安順 561000；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 腫瘤學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

自然殺傷細胞(natural killer，NK)是機體固有免疫的組成細胞之一，主要分布于外周血和脾臟[1-2]。在正常情況下，NK細胞通過識別細胞表面的人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)Ⅰ類分子區(qū)分“自我”與“非我”以殺傷或誘導(dǎo)凋亡來清除腫瘤細胞或病毒感染細胞[3-4]?；罨腘K細胞可以通過分泌干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、穿孔素(perforin)、趨化因子等調(diào)節(jié)機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[5]。IFN-γ可通過促進Th1應(yīng)答、抑制病毒復(fù)制、抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞表達主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ類分子(major histicompatibility complex，MHC-Ⅰ)等發(fā)揮重要的抗腫瘤作用[6-7]。NK細胞釋放的perforin是一種具有成孔作用的溶細胞蛋白，在NK細胞脫顆粒時，perforin可以結(jié)合到靶細胞的質(zhì)膜上，并以鈣離子依賴的方式聚集，在靶細胞上形成孔并允許顆粒酶擴散到靶細胞中，使靶細胞發(fā)生裂解，perforin被認為是T細胞和NK細胞介導(dǎo)的溶細胞作用的關(guān)鍵效應(yīng)分子[8]。目前，NK細胞已被廣泛用于腫瘤的過繼免疫治療中。由于NK細胞僅占外周血淋巴細胞的5%～15%[9]，因而可以通過體外擴增以滿足臨床治療的需求。實驗研究已表明，體外擴增的NK細胞在肝癌[10]、膠質(zhì)母細胞瘤[9]、白血病[11]等多種腫瘤中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效應(yīng)。本研究探討TLR3激動劑 Poly(I ∶C)轉(zhuǎn)染對體外擴增的人NK細胞抗腫瘤活性的影響及可能機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑

1.1.1細胞(株) 人結(jié)直腸癌細胞株DLD-1細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China center for type culture collection, CCT-CC)，人NK細胞根據(jù)本課題組前期已建立的方案進行體外擴增[12]并凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑 RPMI 1640、MEM、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基及青霉素、鏈霉素、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司，高分子量Poly(I ∶C，HMW)購自美國InvivoGen公司，Lipo3000購自賽默飛公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，流式檢測所用的抗人FITC-CD69抗體、抗人PE-CD56抗體及相關(guān)試劑購自BioLegend公司，人perforin及人TNF-α的ELISA檢測試劑盒均購自美國Abcam公司，人IFN-γ的ELISA檢測試劑盒購自BD公司，TLR3/dsRNA complex inhibitor購自德國Merck公司，TBK1/IKKε抑制劑BX795購于Abcam公司，DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)購自 Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1Poly-NKelect.組及Poly-NK組細胞對DLD-1細胞的殺傷率 液氮罐中復(fù)蘇一支人NK細胞，細胞量約為2×108個，復(fù)蘇后加入完全培養(yǎng)基100 mL將細胞濃度調(diào)整為2×106個/mL，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中放置2 h備用。Poly-NKelect.組細胞是將5×106個NK細胞用250 μL減血清Opti-MEM培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯內(nèi)(避免產(chǎn)生氣泡)，放入Celetric電轉(zhuǎn)儀中，電轉(zhuǎn)條件為380 mV、30 ms，電轉(zhuǎn)結(jié)束后加入完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2×106個/mL，置于溫箱中備用(Poly-NKelect.組)。在1.5 mL離心管中加入培養(yǎng)基500 μL，再加入脂質(zhì)體2 μL，再加入等體積Poly(I ∶C)，充分混勻后室溫靜置30 min后與濃度為2×106個/mL的NK細胞共孵育過夜(Poly-NK組)，Poly(I ∶C)終濃度為10 mg/L，設(shè)置單獨NK細胞作為對照組(NK組)。次日將3組細胞輕輕混勻，準備3支15 mL離心管并標記，用200目細胞過濾網(wǎng)過濾后于離心機中950 rpm，離心10min，臺盼藍染色計算細胞存活率后將細胞濃度調(diào)整為3×106個/mL備用。以DLD-1細胞為靶細胞，Poly-NKelect.細胞、Poly-NK及單獨NK細胞作為效應(yīng)細胞，先在96孔U型反應(yīng)板中加入濃度為6×105個/mL的DLD-1細胞，100 μL/孔，于操作臺中靜置約5 min，按照5 ∶1的效靶比加入濃度為3×106個/mL 的3中不同處理方式的NK細胞，100 μL/孔，用培養(yǎng)基補至終體積為200 μL，每組3個復(fù)孔，同時設(shè)置單獨培養(yǎng)基為空白對照組，置于溫箱內(nèi)作用5 h后加入20 μL/孔的CCK-8溶液，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)2.5 h后，用酶標儀檢測各孔光密度(optical density，OD)值，NK細胞殺傷效應(yīng)用死亡率(%)表示，細胞死亡率(%)=[1-(效靶細胞孔OD值-效應(yīng)細胞孔OD值)/靶細胞孔OD值]×100%。

1.2.2Poly-NK組及Poly-NK+BX組細胞對DLD-1細胞的殺傷 根據(jù)“1.2.1”項下選擇Poly-NK進行后續(xù)實驗。根據(jù)文獻查閱及前期實驗摸索，選擇BX795抑制劑的濃度為10 μmol/L[13]。為驗證在BX795的推薦濃度下DMSO對實驗的安全性，設(shè)置了相同體積的DMSO作為溶劑對照組(NK+DMSO組)，將抑制劑先加入單獨的NK細胞中孵育30 min，再加入Poly(I ∶C)置于37 ℃含5% CO2的溫箱中孵育過夜。次日接板及計算方法同1.2.1。

1.2.3Poly-NK及Poly-NK+BX細胞的表面活化標志物CD69的表達 調(diào)整Poly-NK及Poly-NK+BX組細胞濃度為1×106個/mL，設(shè)單獨NK細胞組作為對照，按每管1 mL分裝到1.5 mL離心管內(nèi)，離心去上清后用PBS重懸，每管加入Fc封閉液5 μL，室溫封閉20 min后加入抗人FITC-CD69、抗人PE-CD56流式抗體3 μL，25 ℃下避光孵育30 min，離心，用1×PBS清洗2遍，200目細胞篩過濾，用貝克曼FC500流式細胞儀進行檢測，用Flowjo VX軟件進行分析。

1.2.4Poly-NK組、Poly-NK+BX、Poly-NKinhib.組細胞perforin、IFN-γ以及TNF-α的分泌水平 將perforin、IFN-γ、TNF-α的ELISA試劑盒提前30 min恢復(fù)至室溫，按說明書配制洗滌液、抗體稀釋液、標準品稀釋液等，將收集的NK細胞對照組、Poly-NK組、Poly-NK+BX、Poly-NKinhib.組細胞培養(yǎng)上清液1 500 r/min，離心10 min，每孔加入100 μL上清液，每組設(shè)3個復(fù)孔和3個標準品孔，按照說明書進行操作，最后用酶標儀檢測標準品的OD值，并根據(jù)標準品的濃度與OD值關(guān)系作出擬合曲線，根據(jù)回歸方程計算出各組樣本中perforin、IFN-γ及TNF-α的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Poly-NKelect.和Poly-NK組細胞對DLD-1細胞的殺傷率

Poly-NKelect.及Poly-NK組細胞的存活率比較[(70±3.12)%vs(71±1.4)%]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與Poly-NKelect.組比較，Poly-NK組細胞對DLD-1細胞的殺傷率更高[(41±2.03)%vs(63±1.1)%，P<0.01]，因此后續(xù)Poly(I ∶C)活化NK細胞的實驗中均采用Poly-NK組進行實驗(圖1)。

注：(1)與NK組相比，P<0.01；(2)與NK組相比，P<0.05。

2.2 Poly-NK和Poly-NK+BX組對DLD-1細胞殺傷率

與Poly-NK組比較，Poly-NK+BX組對DLD-1細胞的殺傷率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[(75±2.22)%vs(61±3.58)%，P<0.01]；與NK組比較，NK+DMSO組細胞存活率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(47.58±0.91)%vs(46.43±1.02)%,P>0.05]。見圖2。 提示TBK1/IKKε抑制劑能降低Poly(I ∶C)轉(zhuǎn)染人NK細胞的抗腫瘤活性。

注：與NK組相比，(1)P<0.05;(2)與Poly-NK組比較，P<0.01。

2.3 Poly-NK和Poly-NK+BX組NK細胞表面CD69的表達

與NK組比較，Poly-NK組CD69表達上升[(58.3%vs70.5%)，P<0.05]，且平均熒光強度增強[(5 000±25.12)%vs(6 789±32.11)%)，P<0.01]；與Poly-NK組相比，Poly-NK+BX組CD69的表達降低[(60%vs70.5%)，P<0.05]，且平均熒光強度減弱[(6 789±32.11)%vs(5 025±18.43)%，P<0.05]。見圖3，提示TBK1/IKKε抑制劑BX795能降低Poly(I ∶C)轉(zhuǎn)染的NK細胞CD69的表達。

注：A為NK細胞CD69分子陽性率的檢測，B為對應(yīng)的平均熒光強度；(1)與NK組比較，P<0.01;(2)與Poly-NK組相比，P<0.05。

2.4 Poly-NK組及Poly-NK+BX組細胞perforin及IFN-γ的表達

與NK組比較，Poly-NK組perforin和IFN-γ表達增加[(815±4.38)%vs(886±5.33)%，(32±1.31)%vs(142±1.22)%，P<0.05]；與Poly-NK組比較，Poly-NK+BX組perforin、IFN-γ表達降低[(691±4.28)%vs(886±5.33)%，(56±2.33)%vs(142±1.22)%，P<0.05]。見圖4，提示Poly(I ∶C)活化的NK細胞抗腫瘤作用與TBK1/IKKε抑制劑相關(guān)。

注：(1)與NK組比較，P<0.05;(2)與Poly-NK組比較，P<0.05。

2.5 Poly-NK組及Poly-NKinhib.組細胞中TNF-α及IFN-γ的表達

與NK組比較，Poly-NK組TNF-α、IFN-γ表達增加[(192±1.22)%vs(252±1.35)%，(27±1.57)%vs(82±1.29)%，P<0.05]；與Poly-NK組比較，Poly-NKinhib.組TNF-α、IFN-γ表達降低[(252±1.35)%vs(187±1.33)%，(82±1.29)%vs(37±2.11)%，P<0.05]。見圖5，提示Poly(I ∶C)活化的NK細胞抗腫瘤作用與TLR3/dsRNA復(fù)合物抑制劑相關(guān)。

注：(1)與NK組比較，P<0.05；(2)與Poly-NK組比較，P<0.05。

3 討論

模式識別受體(pattern-recognition recap-tors，PRRs)是機體識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattern，DAMPS)的一類受體，可識別dsRNA的PRRs包括黑色素瘤分化相關(guān)基因-5(melanoma different-tiation-associated gene-5，MDA-5)、視黃酸誘導(dǎo)基因-1(retinoic-acid inducible gene-1,RIG-1)以及Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)等[13-16]。TLR3作為一種可以識別病毒dsRNA的受體，在識別病毒dsRNA后可引起Ⅰ型干擾素(type I interferon，IFN-Ⅰ)的分泌，誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子-3(Interferon regulatory factor-3，IRF-3)和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子的激活，TANK結(jié)合激酶-1(TANK binding kinase 1,TBK1)及NF-κB抑制蛋白激酶-ε(nuclear factor kappa B inhibits protein kinase，IKKε)作為TLR3信號通路下游的信號分子，在dsRNA激活 TLR3通路后被活化并參與IFN的產(chǎn)生，誘導(dǎo)機體的抗病毒、抗腫瘤免疫[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR3的激活可抑制黑色素瘤荷瘤鼠的腫瘤肺轉(zhuǎn)移[19]，抑制膀胱癌荷瘤鼠的腫瘤生長[20]。dsRNA類似物聚肌胞苷Poly(I ∶C)是一種人工合成的TLR3激動劑，被認為是TLR3的配體而被TLR3識別，可以活化樹突狀細胞[13, 21]，現(xiàn)已作為治療性疫苗佐劑用于黑色素瘤和乳腺癌的治療進入了Ⅱ期臨床試驗[22-25]。

在此次研究中，探討了Poly(I ∶C)對NK細胞的活化作用及可能的機制。結(jié)果顯示，TLR3激動劑Poly(I ∶C)轉(zhuǎn)染人NK細胞后促進了NK細胞的細胞毒作用，在抗腫瘤活性增強的同時伴隨IFN-γ、perforin及TNF-α分泌增加、NK細胞活化標志物CD69的上調(diào)。而在TLR3/dsRNA復(fù)合物抑制劑或TBK1/IKKε抑制劑BX795的作用下，NK細胞抗腫瘤活性降低，IFN-γ、perforin及TNF-α分泌減少，NK細胞活化標志物CD69表達下調(diào)，即Poly(I ∶C)以TLR3及TBK1/IKKε依賴的方式促進NK細胞的殺傷能力并促進分泌perforin、IFN-γ及TNF-α。以上結(jié)果提示Poly(I ∶C)活化的NK細胞抗腫瘤作用可能與TLR3信號通路的活化有關(guān)。本研究雖然證實TLR3通路在NK細胞抗腫瘤中發(fā)揮重要的作用，但NK細胞還可以通過MDA-5和RIG-1等PRRs來識別dsRNA發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，因而還需深入探討Poly(I ∶C)促進NK的抗腫瘤活性的相關(guān)機制，從而為探索在腫瘤的免疫治療中如何通過Poly(I ∶C)等PRRs激動劑來增強NK細胞抗腫瘤活性奠定理論及實驗基礎(chǔ)。