廖春香，龍世棋，安媛媛1，，車啟元1，，王念雪1，，陳亮，楊薇，趙星*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；3.安順市人民醫(yī)院 胸甲乳外科，貴州 安順 561000；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 腫瘤學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

雙特異性抗體是由人工構(gòu)建的在同一抗體分子上可同時(shí)特異性結(jié)合兩個(gè)不同抗原分子的一類抗體，抗體一端可通過與自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的FcγRIII結(jié)合，另一端可與靶細(xì)胞結(jié)合后促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用[1-4]。CD30/CD16A作為一種4價(jià)的BsAbs，含有2個(gè)CD16A結(jié)合位點(diǎn)及2個(gè)CD30結(jié)合位點(diǎn)，使其在特異性連接CD30分子陽性的腫瘤細(xì)胞的同時(shí)又能特異性連接CD16A陽性的NK細(xì)胞，從而通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)殺傷CD30分子陽性的腫瘤細(xì)胞[5]。正常情況下，CD30分子低表達(dá)于激活的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，長期被認(rèn)為是經(jīng)典霍奇金淋巴瘤(hodgkins lymphoma，HL)的表面分子標(biāo)志[6]，但近期研究發(fā)現(xiàn)非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)如間變性大細(xì)胞瘤中也有表達(dá)，且已成為CD30分子陽性的淋巴瘤患者抗體治療的理想靶點(diǎn)[6]。由于BsAbs的功能發(fā)揮主要依賴于NK細(xì)胞的抗腫瘤活性，因而目前很多研究都是圍繞如何增強(qiáng)NK細(xì)胞功能來促進(jìn)BsAbs的療效[7]。本課題組前期研究工作中已發(fā)現(xiàn)，溶瘤呼腸孤病毒(reovirus)不僅可以促進(jìn)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性[8]，在聯(lián)合西妥昔單抗后進(jìn)一步增強(qiáng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC作用，進(jìn)而抑制裸鼠腫瘤的生長[9]。因此，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)檢測reovirus聯(lián)合(CD30/CD16A)BsAbs對(duì)于NK細(xì)胞抗腫瘤活性的影響，從而為探索NHL等淋巴瘤的治療新策略奠定理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株和病毒 高表達(dá)CD30分子的人間變性大細(xì)胞瘤KARPAS-299細(xì)胞株、高表達(dá)CD20分子的人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株、人結(jié)直腸癌DLD-1細(xì)胞株及reovirus 3型(Type 3 dearing，T3D)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑和儀器 人NK細(xì)胞分離試劑盒(德國Miltenyi Biotec)，人外周淋巴細(xì)胞Ficoll分離液(英國GE)，DNaseⅠ(中國 Solarbio)，流式抗體抗人FITC-anti CD3、抗人PE-anti CD56、抗人APC-anti CD69及抗人APC-anti CD107a抗體(美國Biolegend)，抗人FITC-anti CD30抗體(美國BD)，熒光二抗FITC-IgG(美國Jackson Immuno Research)，CD30/CD16A BsAbs(美國斯坦福大學(xué)Holbrook Kohrt教授惠贈(zèng))，PRMI1640培養(yǎng)基、低限量Eagle培養(yǎng)基(minimum Eagle’s medium，MEM)培養(yǎng)基、青霉素及鏈霉素、胰酶(美國Sigma-Aldrich)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；美國Gibco)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒(美國Biovision)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；美國Sigma-Aldrich)；多功能酶標(biāo)儀SYNERGY H1(美國Bio Tek)，F(xiàn)C500分析型流式細(xì)胞儀(美國Beckman)，CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher)，倒置顯微鏡(日本Nikon)，5810低溫離心機(jī)(德國Eppendorf)，-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Fisher)，生物安全柜(山東Biobase生物)。

1.2 方法

1.2.1人NK細(xì)胞的分離、純化及鑒定 采集健康獻(xiàn)血者肝素抗凝靜脈血30 mL，按1 ∶1的體積比加入生理鹽水稀釋血液，混勻備用；50 mL離心管內(nèi)加入淋巴細(xì)胞分離液25 mL，各管分別加入稀釋后的血液20 mL，2 500 r/min離心10 min，取中間白膜層即為分離出的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，生理鹽水清洗2次，去除上清，加磁珠分選緩沖液(magnetic-activated cell sorting buffer，MACS buffer)500 μL重懸，按每1×107個(gè)NK細(xì)胞加Biotin-antibody 10 μL的比例將二者混勻，4 ℃孵育5 min，加MACS buffer 30 μL及NK細(xì)胞MicroBead 20 μL，4 ℃孵育10 min，MACS buffer將體積調(diào)整為500 μL后用200目過濾器除去細(xì)胞團(tuán)塊，將過濾后的細(xì)胞經(jīng)免疫磁珠篩選，分離獲得的NK細(xì)胞立即使用或于液氮中保存，1個(gè)月內(nèi)使用。

1.2.2LDH釋放法檢測reovirus活化的NK細(xì)胞抗腫瘤活性 從液氮罐中復(fù)蘇NK細(xì)胞，分別與10及100 感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的reovirus于37 ℃的5%CO2溫箱中孵育過夜(Reo-NK組)；次日取出細(xì)胞調(diào)整濃度至3×103個(gè)/L，以Reo-NK或未經(jīng)reovirus處理的NK為效應(yīng)細(xì)胞、DLD-1為靶細(xì)胞，按效靶比為5 ∶1的比例加Reo-NK/NK及DLD-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)孔(效靶細(xì)胞各100 μL)、靶細(xì)胞自然釋放孔(靶細(xì)胞及培養(yǎng)基各100 μL)、靶細(xì)胞最大釋放孔(靶細(xì)胞100 μL及Triton液各100 μL)及效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔(靶細(xì)胞及培養(yǎng)基各100 μL)；細(xì)胞培養(yǎng)板置于溫箱中孵育3.5 h，孵育結(jié)束前30 min在靶細(xì)胞最大釋放孔中加入裂解液10 μL充分混勻；多孔板離心機(jī)1 200 r/min離心5 min，取上清液，加到標(biāo)記好的新96孔板中，每孔加LDH工作液50 μL，混勻置于室溫避光孵育30 min；用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測光密度值(optical density，OD)，并計(jì)算DLD-1細(xì)胞的死亡率(killing rate)[死亡率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-靶細(xì)胞自然釋放孔OD值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔OD值)/(靶細(xì)胞最大釋放孔OD值-靶細(xì)胞自然釋放孔OD值)×100%]。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測KARPAS-299細(xì)胞膜表面CD30分子的表達(dá) 取1×106個(gè)KARPAS-299細(xì)胞，900 r/min離心5 min，去除上清；加入流式緩沖液1 mL重懸洗滌，1 200 r/min離心5 min，棄上清；加入Fc封閉液5 μL室溫孵育20 min，分別對(duì)應(yīng)加入抗人APC-CD30及同型對(duì)照抗體IgG1各5 μL，避光孵育30 min，加1×PBS重懸后1 500 r/min離心8 min，去除上清液；加1×PBS約500 μL重懸細(xì)胞，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾后用貝克曼FC500流式細(xì)胞儀檢測KARPAS-299細(xì)胞膜表面CD30分子的陽性率，結(jié)果用Flowjo 10軟件進(jìn)行分析。

1.2.4Reo-NK聯(lián)合CD30/CD16A對(duì)KARPAS-299細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 將NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞用1 MOI的reovirus預(yù)處理(Reo-NK)，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h；KARPAS-299細(xì)胞作為靶細(xì)胞，將同型對(duì)照抗體IgG1或CD30/CD16A按不同濃度[(0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00及1 000.00)×10-12mol/L]與靶細(xì)胞共孵育2 h，靶細(xì)胞按6×104個(gè)/孔接于U型96孔反應(yīng)板，NK/Reo-NK與KARPAS-299細(xì)胞及Raji細(xì)胞的效靶比均為1 ∶1，組別設(shè)置為NK+IgG1組、NK+CD30/CD16A組、Reo-NK+IgG1組及Reo-NK+CD30/CD16A組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔(RPMI1640 100 μL)、靶細(xì)胞自然釋放孔(靶細(xì)胞50 μL+RPMI1640 50 μL)、靶細(xì)胞最大釋放孔(靶細(xì)胞50 μL+RPMI1640 50 μL+裂解液10 μL)、效應(yīng)細(xì)胞孔(效應(yīng)細(xì)胞50 μL+RPMI1640 50 μL)、效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔(效應(yīng)細(xì)胞50 μL+RPMI1640 50 μL)等對(duì)照組，置溫箱中孵育4 h；孵育結(jié)束前30 min在靶細(xì)胞最大釋放孔中加裂解液10 μL充分混勻；1 200 r/min離心5 min，收集上清液至新的96孔板中，加LDH工作液50 μL，充分混勻，置于室溫避光孵育30 min；酶標(biāo)儀于490 nm處檢測OD，并計(jì)算死亡率。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞表面分子的表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同滴度reovirus(0.0、0.1、0.5、1.0、10.0、100.0 PFU)及人結(jié)直腸癌DLD-1細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞活化標(biāo)志物CD69分子、細(xì)胞毒性標(biāo)志物CD107a分子表達(dá)的影響。具體操作：取1×107個(gè)NK細(xì)胞，設(shè)置為Reo-NK組和Reo-NK+DLD-1組，同時(shí)加不同滴度的reovirus過夜；次日Reo-NK+DLD-1組加入按5 ∶1的效靶比加入靶細(xì)胞DLD-1，孵育5 h；Reo-NK組及Reo-NK+DLD-1組均以900 r/min離心5 min，去除上清；加流式緩沖液1 mL重懸洗滌，1 200 r/min離心5 min，棄上清；加Fc封閉液5 μL室溫孵育20 min，分別對(duì)應(yīng)加抗人APC-CD69、抗人APC-CD107a、抗人PE-CD56及抗人FITC-CD3流式抗體各5 μL，避光孵育30 min，加1×PBS重懸后1 500 r/min離心8 min，去除上清液；加緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾后用貝克曼FC500流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測CD69及CD107a的陽性率，并用Flowjo 10軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.6Reo-NK聯(lián)合CD30/CD16A對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 將NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞用1 MOI的reovirus預(yù)處理(Reo-NK)，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h；Raji細(xì)胞作為靶細(xì)胞與不同濃度[(0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00及1 000.00)×10-12mol/L]的CD30/CD16A 共同孵育2 h后，按6×104個(gè)/孔接于U型96孔反應(yīng)板，按照1 ∶1的效靶比加入NK及Reo-NK細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置為NK+CD30/CD16A組和Reo-NK+CD30/CD16A組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(RPMI1640 100 μL)、靶細(xì)胞自然釋放組(靶細(xì)胞50 μL+RPMI1640 50 μL)、靶細(xì)胞最大釋放組(靶細(xì)胞50 μL+RPMI1640 50 μL+裂解液10 μL)、效應(yīng)細(xì)胞組(效應(yīng)細(xì)胞50 μL+RPMI1640 50 μL)及效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組(效應(yīng)細(xì)胞50 μL+RPMI1640 50 μL)，置溫箱孵育4 h；孵育結(jié)束前30 min在靶細(xì)胞最大釋放孔中加裂解液10 μL充分混勻；1 200 r/min離心5 min，收集上清液至新的96孔板中，加LDH工作液50 μL，充分混勻，置于室溫避光孵育30 min；用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測OD，并計(jì)算死亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞表型

流式檢測結(jié)果顯示，體外新鮮分離的NK細(xì)胞純度及CD3-CD56+的細(xì)胞群可達(dá)70%以上。見圖1。

圖1 新鮮分離的NK細(xì)胞純度

2.2 Reovirus促進(jìn)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性

LDH檢測結(jié)果顯示，與單獨(dú)NK組相比，Reo-NK對(duì)DLD-1細(xì)胞的殺傷率明顯增強(qiáng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與NK組比較，P<0.01。

2.3 Reovirus、DLD-1細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞活化標(biāo)注物CD69和細(xì)胞毒性分子CD107a表達(dá)的影響

流式檢測結(jié)果顯示，隨著reovirus滴度的上升，NK細(xì)胞活化標(biāo)志物CD69與其細(xì)胞毒性分子CD107a的表達(dá)呈上升趨勢，且在同reovirus滴度下(100 PFU)經(jīng)DLD-1處理的NK細(xì)胞表面的CD69及CD107a分子的陽性率相對(duì)未經(jīng)DLD-1處理的NK細(xì)胞增加更為明顯(P<0.05)。見圖3。

注：與0.0 PFU組相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；A為流式細(xì)胞儀檢測十字門結(jié)果，B為流式檢測的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.4 KARPAS-299表面VD30分子的檢測及reovirus聯(lián)合(CD30/CD16A)BsAb對(duì)NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)的影響

LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，NK+CD30/CD16A組與NK+IgG1組相比，對(duì)KARPAS-299細(xì)胞殺傷能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Reo-NK+IgG1組與NK+IgG1組相比，對(duì)KARPAS-299細(xì)胞殺傷能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Reo-NK+CD30/CD16A組與Reo-NK+IgG1組相比，對(duì)KARPAS-299細(xì)胞殺傷能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為KARPAS-299細(xì)胞表面CD30分子檢測，B為reovirus聯(lián)合不同濃度的(CD30/CD16A)BsAb對(duì)KARPAS-299細(xì)胞的殺傷作用檢測結(jié)果；(1)與同濃度NK+IgG1組相比，P<0.05;(2)與同濃度Reo-NK+IgG1組相比，P<0.05。

2.5 NK細(xì)胞聯(lián)合(CD30/CD16A)BsAb對(duì)Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

在未經(jīng)reovirus處理的NK+CD30/CD16A組的抗腫瘤效應(yīng)中，各濃度(CD30/CD16A)BsAb均未顯著促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，而經(jīng)reovirus活化的NK+CD30/CD16A組對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷效應(yīng)顯著(P<0.05)。見圖5。

注：(1)與NK+CD30/CD16A組比較，P<0.05。

3 討論

NK細(xì)胞是機(jī)體具有細(xì)胞毒性的免疫細(xì)胞之一，在體外可以通過白細(xì)胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)、IL-15、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等多種細(xì)胞因子活化[10-17]。NK細(xì)胞在腫瘤的免疫治療中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的重要機(jī)制之一是ADCC作用[16, 18-20]。而CD16分子是NK細(xì)胞啟動(dòng)ADCC效應(yīng)過程中是不可或缺的條件，在許多基于抗CD16抗體的腫瘤治療中，由于只能特異性連接1個(gè)抗原靶點(diǎn)，其特異性相對(duì)較低且分子量小，易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)[21-24]。與之相比，由于雙特異性抗體具有可同時(shí)特異性連接2種抗原靶點(diǎn)、連接穩(wěn)定不易脫靶等優(yōu)勢，目前已成為治療性抗體研究的熱點(diǎn)[25-26]。據(jù)報(bào)道，目前已有80余種雙特異性抗體正處于臨床研究各階段，其中包括世界首例批準(zhǔn)上市的用于治療惡性腹水的卡妥索單抗、后續(xù)上市的用于治療腫瘤性腹水的EpCAM/CD3及用于治療B型淋巴細(xì)胞白血病的CD19/CD3[4,24]等，在臨床實(shí)驗(yàn)中，這些抗體均呈現(xiàn)出較好的靶向性和特異性。

本研究探討了reovirus在NK細(xì)胞活化中的作用以及聯(lián)合雙特異性抗體(CD30/CD16A)BsAb對(duì)CD30分子陽性腫瘤細(xì)胞的作用。通過流式檢測及殺傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)reovirus可以活化NK細(xì)胞，促進(jìn)NK細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD69、CD107a分子的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果可見，KARPAS-299細(xì)胞CD30分子的陽性率為90%以上，呈高表達(dá)狀態(tài)。同時(shí)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證(CD30/CD16A)BsAb對(duì)CD30高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞KARPAS-299細(xì)胞的特異性，本研究將CD20+CD30-的Raji細(xì)胞作為對(duì)照，用reovirus預(yù)處理的NK細(xì)胞聯(lián)合(CD30/CD16A)BsAbs后殺傷Raji細(xì)胞，通過LDH釋放試驗(yàn)檢測殺傷效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)人結(jié)直腸癌DLD-1細(xì)胞株、人間變性大細(xì)胞瘤KARPAS-299細(xì)胞株及人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株等多種腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。在LDH釋放試驗(yàn)檢測KARPAS-299細(xì)胞死亡率實(shí)驗(yàn)中觀察到：reovirus可以增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，而(CD30/CD16A)BsAbs可以進(jìn)一步促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)KARPAS-299細(xì)胞的殺傷效應(yīng)且與(CD30/CD16A)BsAbs呈濃度依賴性，但在同型對(duì)照IgG1組則未觀察到NK細(xì)胞殺傷能力與抗體有關(guān)，如當(dāng)CD30/CD16A及IgG1濃度同為1.00×10-12mol/L時(shí)，Reo-NK+CD30/CD16A組對(duì)KARPAS-299細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較Reo-NK+IgG組顯著；當(dāng)CD30/CD16A及IgG1濃度均上升為10.00×10-12mol/L時(shí)，Reo-NK+CD30/CD16A組對(duì)KARPAS-299細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較Reo-NK+IgG組顯著，同樣，當(dāng)CD30/CD16A及IgG1濃度進(jìn)一步上升至100.00×10-12mol/L時(shí)，Reo-NK+CD30/CD16A組對(duì)KARPAS-299細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較Reo-NK+IgG組提高更為顯著。此外，本研究結(jié)果顯示，reovirus活化的NK細(xì)胞降低了NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)所需的抗體量，如在細(xì)胞死亡率同為5%時(shí)，經(jīng)reovirus活化的NK細(xì)胞僅需聯(lián)合1.00×10-12mol/L的CD30/CD16A，而未經(jīng)reovirus活化的NK細(xì)胞需聯(lián)合100.00×10-12mol/L的CD30/CD16A才能達(dá)到相同殺傷效應(yīng)。在(CD30/CD16A)BsAbs存在條件下，無論是NK細(xì)胞還是經(jīng)reovirus活化的Reo-NK細(xì)胞，其殺傷效應(yīng)均能隨著(CD30/CD16A)BsAbs濃度的升高有不同程度的增強(qiáng)，特別是Reo-NK的抗腫瘤效應(yīng)增加更顯著，該結(jié)果表明reovirus不僅能促進(jìn)NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，還能聯(lián)合(CD30/CD16A)BsAb通過NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)進(jìn)一步殺傷CD30陽性的KARPAS-299細(xì)胞且殺傷能力呈抗體濃度依賴性。在CD20+CD30-的Raji細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中可以觀察到：隨著(CD30/CD16A)BsAbs濃度增加，NK細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷效應(yīng)無顯著增強(qiáng)，在reovirus活化的NK細(xì)胞中雖然殺傷效應(yīng)顯著上升，但未呈現(xiàn)出濃度依賴性，表明(CD30/CD16A)BsAbs在靶向分子CD30缺失情況下，不能促進(jìn)NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，該結(jié)果證明了(CD30/CD16A)BsAbs對(duì)CD30+的腫瘤細(xì)胞的殺傷具有特異性。

綜上所述，reovirus不僅可以促進(jìn)體外新鮮分離的NK細(xì)胞活化，增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)，而且在聯(lián)合雙特異性抗體(CD30/CD16A)BsAbs后還能進(jìn)一步促進(jìn)NK細(xì)胞特異性識(shí)別高表達(dá)CD30分子的靶細(xì)胞，進(jìn)一步增加NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC作用。本研究結(jié)果僅顯示體外實(shí)驗(yàn)研究的部分結(jié)果，雙特異性抗體聯(lián)合NK細(xì)胞抗腫瘤的具體機(jī)制研究尚未完成，在抗腫瘤中的安全性及有效性有待進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步的研究，且體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)比體外實(shí)驗(yàn)所能研究的復(fù)雜得多，還有很多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有待完成。通過本次研究可為后續(xù)深入探索reovirus聯(lián)合(CD30/CD16A)BsAbs抗腫瘤機(jī)制研究以及臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。