楊峰山, 殷 城, 楊 靜, 危學(xué)高, 杜田華,楊 鑫, 王少麗, 張友軍*,

(1. 黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，北京 100081)

煙粉虱Bemisia tabaci 是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲，其寄主植物廣泛，以直接取食植物汁液，分泌蜜露誘發(fā)煤污病以及傳播植物病毒等方式危害農(nóng)作物生長(zhǎng)[1-2]。在與環(huán)境協(xié)同進(jìn)化的過程中，煙粉虱被分化出數(shù)十種不同的生物型 (隱種)，其中入侵性最強(qiáng)、危害最為嚴(yán)重的是B 型和Q 型煙粉虱。中國(guó)于20 世紀(jì)90 年代首次發(fā)現(xiàn)B 型煙粉虱，2003 年首次發(fā)現(xiàn)Q 型煙粉虱，隨后Q 型煙粉虱大面積爆發(fā)，導(dǎo)致番茄病毒病大規(guī)模發(fā)生，造成了嚴(yán)重危害[3-6]。

目前煙粉虱的防治主要依賴于化學(xué)防治，盡管觸殺型的殺蟲劑對(duì)其成蟲具有一定殺蟲效果，但是對(duì)隱藏在植物葉片背面的若蟲則防效不佳。噻蟲嗪作為第二代新煙堿類殺蟲劑，具有良好的觸殺及內(nèi)吸性殺蟲效果，在世界范圍內(nèi)被大量用于煙粉虱、桃蚜和褐飛虱等刺吸式害蟲的防治[7]。隨著噻蟲嗪長(zhǎng)時(shí)間的使用，煙粉虱逐漸對(duì)其產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性[8-11]。自2007 年起，在中國(guó)境內(nèi)的田間抗性監(jiān)測(cè)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)煙粉虱對(duì)噻蟲嗪產(chǎn)生了不同程度的抗性[12-13]。

昆蟲對(duì)新煙堿類殺蟲劑的抗性機(jī)制主要包括靶標(biāo)抗性和代謝抗性，其中關(guān)于靶標(biāo)抗性的報(bào)道主要有褐飛虱因乙酰膽堿受體α 亞基突變 (Y151S)[14]和蚜蟲因乙酰膽堿受體β1 亞基突變 (R81T)[15]，最終導(dǎo)致其對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗性。目前尚未見關(guān)于煙粉虱靶標(biāo)抗性機(jī)制的報(bào)道。煙粉虱對(duì)新煙堿類殺蟲劑的抗性主要為代謝抗性，如在煙粉虱對(duì)吡蟲啉的抗性種群中發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)胞色素P450 基因CYP6CM1 過量表達(dá)，使得煙粉虱將吡蟲啉代謝成親水性更強(qiáng)的羥基化吡蟲啉，并且這種抗性機(jī)制在田間種群中也得到了廣泛的驗(yàn)證[16-18]。

前期研究比較了對(duì)噻蟲嗪抗性和敏感的煙粉虱種群間的一系列I 期和II 期解毒酶間的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的差異，其中包括細(xì)胞色素P450、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST) 和幾種ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[19]。在細(xì)胞色素P450酶系數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)噻蟲嗪敏感的煙粉虱種群，細(xì)胞色素P450 基因CYP6DV5 在噻蟲嗪抗性煙粉虱種群中顯著過量表達(dá)，表明其很可能參與了煙粉虱對(duì)噻蟲嗪抗性的形成。本研究對(duì)該基因進(jìn)行克隆，分析了其在噻蟲嗪抗性煙粉虱不同部位和不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量，并通過RNA干擾試驗(yàn)探究了其在煙粉虱對(duì)噻蟲嗪產(chǎn)生抗性中的作用。研究結(jié)果將有助于揭示煙粉虱對(duì)噻蟲嗪的抗性形成機(jī)制，并且為煙粉虱的綜合治理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

昆蟲：Q 型煙粉虱來自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所長(zhǎng)期飼養(yǎng)的種群，寄主植物為棉花，溫室飼養(yǎng)條件為溫度 (25 ± 1) ℃、相對(duì)濕度70% ±5%、光照14 h (光照) : 10 h (黑暗)。其中噻蟲嗪敏感種群長(zhǎng)期無藥劑接觸史；噻蟲嗪抗性種群通過噻蟲嗪汰選獲得，與噻蟲嗪敏感種群相比，其對(duì)噻蟲嗪的抗性倍數(shù)約為58.4 倍[20]。

1.2 供試試劑及儀器

1.2.1 藥劑及試劑 噻蟲嗪 (thiamethoxam) 原藥(上海源葉生物科技有限公司)；RNA 提取試劑Trizol (賽默飛世爾科技有限公司)；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit (REAL TIME)(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；熒光定量PCR 試劑盒SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) (北京天根生化科技有限公司)；dsRNA 合成試劑盒T7 RiboMAX Express RNAi system (普洛麥格生物技術(shù)有限公司)；PCR 引物 (合成自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)；PCR EsTaq with 6 × Loading Buffer MIX(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、pEASY-T1 載體 (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，其他實(shí)驗(yàn)室常用化學(xué)試劑 (分析純) 均為市售。

1.2.2 儀器 ABI7500 熒光定 PCR 儀；Bio-Rad S1000PCR 儀；Thermo Scientific Nanodrop 2000 分光光度計(jì)；Sigma 3K15 高速離心機(jī)；超純水儀(ZMQ55VOTI Mini Q)；分子實(shí)驗(yàn)用移液器(Eppendorf)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 煙粉虱RNA 提取及cDNA 合成 用吸蟲管從煙粉虱養(yǎng)蟲籠中取50 頭成蟲于離心管中，經(jīng)液氮速凍5 min 后使用Trizol 試劑參照試劑使用說明書提取總RNA。每個(gè)離心管內(nèi)加入1 mL Trizol 和兩粒小鋼珠，于勻漿器中充分破碎。向離心管內(nèi)加入200 μL 氯仿，漩渦振蕩1 min，于冰上靜置5 min，于 4 ℃、12 000 r/min 下離心 10～15 min。吸取上層清液400 μL 至新的離心管中，加入400 μL 預(yù)冷的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，于冰上靜置10 min，再在4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min。棄去上清液，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇1 mL 顛倒清洗，于4 ℃、8 000 r/min 下離心5 min。棄去上清液，將管內(nèi)殘余液體吸干，于超凈臺(tái)內(nèi)晾置5 min。加入10 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC) 水溶解，于冰上靜置3 min 后進(jìn)行OD260/OD280值和RNA 質(zhì)量濃度測(cè)定。選擇OD260/OD280值在1.9 以上、質(zhì)量濃度高于200 μg/μL 的 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明書合成cDNA，熒光定量樣品RNA 反轉(zhuǎn)總量為1 μg。

1.3.2 煙粉虱CYP6DV5 基因克隆 通過煙粉虱基因組序列[21]獲得CYP6DV5 基因全長(zhǎng)，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物CYP6DV5-F/R (表1)，由生工生物工程股份有限公司合成。以煙粉虱cDNA為模板，反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μL, Taq 酶 mix 12.5 μL,Primers-F/R 0.5 mL, ddH2O 10.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性 30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切下目的條帶，用DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，將產(chǎn)物連接到pEASY-T1 克隆載體上，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆，送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行比較分析。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.3 煙粉虱CYP6DV5 基因表達(dá)量分析 收集煙粉虱抗性種群的卵、1～4 齡若蟲、成蟲以及成蟲的頭、胸、腹部位，每個(gè)樣品進(jìn)行4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

卵及若蟲收集：顯微鏡下用毛刷刷下煙粉虱產(chǎn)在葉片上的卵，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)約2 000 粒。顯微鏡下用挑針挑取煙粉虱若蟲，1、2 齡若蟲一起收集，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)約200 頭；3、4 齡若蟲一起收集，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)約100 頭。

成蟲收集：用玻璃管抓取單頭煙粉虱成蟲，在顯微鏡下辨別雌雄后分別收集，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)約60 頭。

成蟲各部位收集：用玻璃管抓取單頭煙粉虱成蟲，在顯微鏡下用解剖針分解挑取煙粉虱的頭部、胸部和腹部，立即放入裝有Trizol 的離心管中。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別為2 000、300 和100 頭。

以上樣品取樣放入液氮中冷凍，?80 ℃保存。對(duì)取得的樣品分別提取RNA。取1 μg 總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于研究CYP6DV5 基因在煙粉虱不同發(fā)育階段和部位的表達(dá)量差異。依據(jù)基因克隆得到的CYP6DV5 基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)篩選熒光定量PCR 引物CYP6DV5-qF/qR (表1)，內(nèi)參基因?yàn)闊煼凼由煲蜃?(elongation factors-1α，EF-1α) 和核糖體蛋白L29(ribosomal protein L29,RPL29)。熒光定量PCR (qRT-PCR) 采用SYBR Green I 染料進(jìn)行，20 μL 反應(yīng)體系：2 × SuperReal PreMix Plus 10 μL, 10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL,50 × ROX Refernce Dye 0.4 μL, cDNA 模板 1.0 μL，RNAse-Free ddH2O 7.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 10 min，95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。熒光定量引物擴(kuò)增效率模板采用3 倍梯度稀釋，統(tǒng)計(jì)不同濃度下的Ct值，計(jì)算擴(kuò)增效率，每個(gè)樣品3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)2?ΔΔCt法[22]計(jì)算 CYP6DV5 基因在煙粉虱不同發(fā)育階段和部位、以及在噻蟲嗪抗敏煙粉虱種群中的表達(dá)量。

1.3.4 煙粉虱RNA 干擾 采用飼喂法進(jìn)行煙粉虱RNA 干擾[20]。將雙鏈RNA (dsRNA) 和營(yíng)養(yǎng)液(30%的蔗糖和5%的酵母浸出物溶液) 混合配制成含dsRNA 的飼喂液。取一個(gè)兩端開口的圓柱形玻璃管 (長(zhǎng)5 cm，直徑2 cm)，將培養(yǎng)皿封口膜拉伸至盡可能地透薄，覆蓋在玻璃管開口的一端，取配制好的雙鏈RNA 營(yíng)養(yǎng)液滴加在玻璃管封口端外側(cè)封口膜上，再拉展一層封口膜覆蓋在其上，使?fàn)I養(yǎng)液均勻分布在兩層封口膜中間。將封好營(yíng)養(yǎng)液的玻璃管的另一開口端扣在飼養(yǎng)煙粉虱的葉片上，輕輕拍動(dòng)葉片使煙粉虱自然飛入管內(nèi)，每管取40～50 頭，取完后用封口膜將開口端封住。利用煙粉虱的趨光性，將營(yíng)養(yǎng)液端以外的玻璃管身用黑色塑料殼覆蓋，僅留營(yíng)養(yǎng)液端向光放置在培養(yǎng)箱內(nèi)，讓煙粉虱集中在營(yíng)養(yǎng)液端取食，溫度(25 ± 1) ℃、相對(duì)濕度 70% ± 5%、光照 14 h (光照) :10 h (黑暗)。雙鏈 RNA 飼喂質(zhì)量濃度為 0.5 μg/μL，飼喂量為每個(gè)飼喂小袋100 μL，每個(gè)處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。48 h 后取出煙粉虱，提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR 以測(cè)定目的基因的干擾效率。

1.3.5 煙粉虱噻蟲嗪敏感性測(cè)定 在噻蟲嗪抗性煙粉虱體內(nèi)敲低CYP6DV5 基因后，對(duì)其進(jìn)行噻蟲嗪敏感性測(cè)定。其中煙粉虱成蟲敏感性測(cè)定參考Feng 等[23]的葉片浸藥法。試驗(yàn)分為6 個(gè)質(zhì)量濃度的藥劑處理組以及1 組空白對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，添加曲拉通以便使藥劑在葉片上有更好的附著效果。藥劑處理組使用蒸餾水、二甲基亞砜 (DMSO)、噻蟲嗪原藥和0.01%的曲拉通溶液配制，對(duì)照組使用蒸餾水和0.1‰的曲拉通溶液配制。指形管底部鋪上2%的瓊脂，凝固后待管壁水蒸氣晾干，將預(yù)先打取的棉花葉片浸藥10 s，晾干后輕輕放于玻璃管中瓊脂上，每管接入煙粉虱成蟲20～30 頭，用棉塞封口。整個(gè)裝置倒置于培養(yǎng)箱中，溫度 (25 ± 1) ℃、相對(duì)濕度70% ±5%、光照14 h (光照) : 10 h (黑暗)。統(tǒng)計(jì)測(cè)定結(jié)果時(shí)，輕輕拍打管壁，觀察煙粉虱生存情況，用昆蟲針撥動(dòng)煙粉虱，以無活動(dòng)跡象記為死亡。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同發(fā)育階段，成蟲不同部位以及噻蟲嗪抗性、敏感之間的基因表達(dá)量均采用單因素方差分析，誘導(dǎo)后的基因表達(dá)量變化應(yīng)用Tukey 法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱CYP6DV5 基因的克隆及其序列分析

分別以噻蟲嗪抗性、敏感煙粉虱cDNA 為模板，通過PCR 獲得1 527 bp 的CYP6DV5 基因的全長(zhǎng)ORF 序列 (圖1)，該長(zhǎng)度與基因組序列一致。將對(duì)噻蟲嗪抗性與敏感的煙粉虱CYP6DV5 基因ORF 序列進(jìn)行比對(duì)后，未發(fā)現(xiàn)兩者間存在差異位點(diǎn)。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，煙粉虱CYP6DV5 基因編碼509 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為58.71 kDa，等電點(diǎn)為6.13，具有細(xì)胞色素P450 基因的保守結(jié)構(gòu)域：C-helix (W × × × R) 結(jié)構(gòu)域 (51-55)、Hemebinding 結(jié)構(gòu)域 (369-379)、Oxygen-binding 結(jié)構(gòu)域(176-180) 以及 P × × F × P 結(jié)構(gòu)域 (345-350)，屬于典型的昆蟲P450 基因 (圖2)。

2.2 CYP6DV5 基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱不同發(fā)育階段和部位的表達(dá)量

應(yīng)用熒光定量PCR 分析CYP6DV5 基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱不同齡期的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3A所示，CYP6DV5 基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱卵期表達(dá)量最低，若蟲階段有一定的表達(dá)量，成蟲期的雄性和雌性個(gè)體表達(dá)量最高；不同部位表達(dá)如圖3B 所示，該基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱腹部表達(dá)很少，主要集中在頭部和胸部表達(dá)。

2.3 噻蟲嗪抗性及敏感品系的CYP6DV5 表達(dá)量分析

通過檢測(cè)室內(nèi)飼養(yǎng)的Q 型煙粉虱敏感種群以及相應(yīng)篩選的噻蟲嗪抗性種群，發(fā)現(xiàn)該基因在噻蟲嗪抗性種群中的表達(dá)量為敏感種群的2.95 倍，差異極顯著 (圖4A)。進(jìn)一步用50 mg/L 的噻蟲嗪對(duì)抗性種群進(jìn)行殺蟲劑誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果如圖4B所示，隨著接觸噻蟲嗪時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞色素CYP6DV5 基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。

2.4 RNA 干擾后煙粉虱CYP6DV5 基因的表達(dá)量及其對(duì)噻蟲嗪敏感性變化

CYP6DV5 基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱種群中過量表達(dá)，對(duì)于該基因在煙粉虱對(duì)噻蟲嗪抗性中發(fā)揮的作用需要進(jìn)一步研究。通過RNA 干擾的方法敲低該基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱體內(nèi)的表達(dá)量，對(duì)其飼喂 0.5 μg/μL 的 dsCYP6DV5 營(yíng)養(yǎng)液 48 h后，用熒光定量PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因在煙粉虱成蟲體內(nèi)表達(dá)量減少了39% (圖5 A)。在敲低該基因在噻蟲嗪抗性煙粉虱體內(nèi)的表達(dá)量后，在50 和100 mg/L 的噻蟲嗪處理?xiàng)l件下，測(cè)定RNAi 后的煙粉虱對(duì)噻蟲嗪敏感性變化。結(jié)果顯示，50 和100 mg/L 噻蟲嗪處理組中，dsGFP 組死亡率分別為26.79%和52.17%，dsCYP6DV5 組死亡率分別為56.12%和70.66%，dsCYP6DV5 組死亡率顯著高于 dsGFP 組。(圖 5 B)。

3 討論

噻蟲嗪作為第二代新煙堿類殺蟲劑，于21 世紀(jì)初在中國(guó)推廣使用，由于其良好的殺蟲效果而得以大量推廣，但是靶標(biāo)害蟲的抗藥性問題也隨之而來，其中煙粉虱作為噻蟲嗪重要的靶標(biāo)防治害蟲，也產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，特別是以逐漸取代B 型煙粉虱進(jìn)而在中國(guó)大面積爆發(fā)的Q 型煙粉虱抗藥性最為嚴(yán)重。盡管Q 型煙粉虱在抗藥性能力方面比B 型煙粉虱強(qiáng)[24]，但關(guān)于Q 型煙粉虱對(duì)于主要防治藥劑的抗藥性機(jī)制卻知之甚少。在前期室內(nèi)篩選的噻蟲嗪抗性機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450 基因參與了煙粉虱對(duì)噻蟲嗪抗性的形成[25]，隨后對(duì)噻蟲嗪抗性、敏感品系進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究結(jié)果表明，細(xì)胞色素P450 基因、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 基因等解毒酶基因在噻蟲嗪抗藥性形成機(jī)制中發(fā)揮重要作用[26]，在此基礎(chǔ)上通過定量分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)CYP4-like 基因可能參與了煙粉虱對(duì)噻蟲嗪抗性的形成[25]1，并且進(jìn)一步通過驗(yàn)證GST 基因功能，發(fā)現(xiàn)了GST14 也可能與其對(duì)噻蟲嗪的抗性形成有關(guān)[18]1。

本論文在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過對(duì)噻蟲嗪抗性、敏感品系煙粉虱的定量PCR 分析，發(fā)現(xiàn)P450 基因CYP6DV5 在對(duì)噻蟲嗪產(chǎn)生抗性的煙粉虱成蟲階段具有高表達(dá)，說明該基因可能參與了煙粉虱成蟲階段對(duì)噻蟲嗪抗性的形成；同時(shí)CYP6DV5 基因在煙粉虱成蟲頭部的表達(dá)最為豐富，表明該基因可能在頭部行使功能。另外，隨著煙粉虱接觸噻蟲嗪時(shí)間的增加，其體內(nèi)CYP6DV5基因相對(duì)表達(dá)量也逐漸升高，表明該基因具有對(duì)噻蟲嗪的響應(yīng)機(jī)制，可能與噻蟲嗪的瞬時(shí)解毒代謝相關(guān)，最終的RNA 干擾也表明，該基因被敲低后顯著提高了煙粉虱對(duì)噻蟲嗪的敏感性，本研究證明了CYP6DV5 基因可能與煙粉虱對(duì)噻蟲嗪抗性的形成有關(guān)。

煙粉虱作為寄主廣泛的刺吸式害蟲，在進(jìn)化過程中形成了數(shù)量眾多的細(xì)胞色素P450 基因，對(duì)于這些基因具體的功能以及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制等有待深入研究，特別是田間煙粉虱環(huán)境復(fù)雜，形成抗藥性的機(jī)制也很復(fù)雜，需要通過一系列的研究才能最終揭示煙粉虱對(duì)殺蟲劑的抗藥性及其調(diào)控機(jī)制，為田間煙粉虱抗藥性水平的監(jiān)測(cè)、合理使用殺蟲劑以及高效防治煙粉虱提供技術(shù)支撐。