吳 迪, 矯 健, 尹 碩, 羅雪婷, 潘洪吉,李秋梅, 黃培鑫, 師迎春

(北京市植物保護(hù)站，北京 100029)

茶樹菇Agrocybe aegerita 由于其生產(chǎn)特點和栽培方式受局限，是目前尚不能進(jìn)行工廠化生產(chǎn)的食用菌品種之一，其生產(chǎn)過程中的病蟲害防治，尤其是對菇蚊菇蠅的防治還存在一定的難度。目前，中國在食用菌上登記的殺蟲劑僅有氯氟·甲維鹽乳油1 種[1]，不能滿足生產(chǎn)實際的需要。滅蠅胺 (cyromazine) 屬三嗪類昆蟲生長調(diào)節(jié)劑[2]，具有強(qiáng)內(nèi)吸傳導(dǎo)作用，可以誘使雙翅目幼蟲和蛹發(fā)生畸變，成蟲羽化不全或被抑制[3]。據(jù)報道，滅蠅胺在雙翅目害蟲防治中具有一定優(yōu)勢[3]，其對潛葉蠅、異型眼蕈蚊和食用菌眼蕈蚊等毒力作用和藥效顯著[3-5]，且對菌絲生長抑制作用較小[6]。目前滅蠅胺在美國、日本等國家在食用菌上均已登記使用[6]。已有研究表明，滅蠅胺在中國的使用尚不會產(chǎn)生不可接受的膳食攝入風(fēng)險[2,7-8]。筆者調(diào)研發(fā)現(xiàn)，滅蠅胺在食用菌生產(chǎn)中使用較廣泛，有必要對其在食用菌中使用后的殘留情況進(jìn)行研究。

中國尚未制定滅蠅胺在食用菌上的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn) (MRL) 和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，CAC (國際食品法典委員會) 規(guī)定，滅蠅胺在蘑菇中的MRL值為7 mg/kg[9]，歐盟規(guī)定其在栽培真菌和野生菌中的MRL 值分別為10 mg/kg 和0.05 mg/kg[10]，美國規(guī)定滅蠅胺在蘑菇中MRL 值為1.0 mg/kg[11]。

關(guān)于滅蠅胺殘留的檢測方法主要有液相色譜法[12-14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]、CdSe/CdS 量子點熒光探針法[17]等，但涉及食用菌基質(zhì)檢測的較少[12]，對茶樹菇中滅蠅胺殘留的研究尚未見報道。雖然有文獻(xiàn)報道三聚氰胺為滅蠅胺的降解產(chǎn)物[2]，但在JMPR 報告中，滅蠅胺的殘留物監(jiān)測定義和風(fēng)險評估定義僅為滅蠅胺，不包括三聚氰胺，認(rèn)為三聚氰胺的毒性比滅蠅胺小，且樣本中的三聚氰胺可能有其他的來源[18-19]。依據(jù)該報告，本研究中不對三聚氰胺進(jìn)行檢測，建立了與相關(guān)文獻(xiàn)方法不同的簡單快速的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 測定食用菌中滅蠅胺殘留的分析方法，并基于生產(chǎn)實際中農(nóng)戶使用滅蠅胺防治菇蚊、蠅的用藥量，對菇棚中滅蠅胺的殘留消解動態(tài)及最終殘留進(jìn)行了研究，旨在為其合理使用和最大殘留限量制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥劑與試劑

Agilent 1260-6460 型三重串聯(lián)四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；Autogizer 701 型全自動多通道樣品勻質(zhì)器，美國TOMTEC公司；TG16 型臺式高速離心機(jī)，長沙英泰儀器有限公司；FP3010 食物調(diào)理機(jī)，德國博朗公司。

99.2%滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品 (cyromazine)，國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心 (沈陽)；50%滅蠅胺可溶性粉劑 (cyromazine SP)，東莞市瑞德豐生物科技有限公司。

甲醇 (質(zhì)譜純)，F(xiàn)isher 公司；氯化鈉 (分析純)，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

1.2 培養(yǎng)基質(zhì) (菌棒)

茶樹菇栽培中，使用棉籽皮90%、麩皮5%、豆粕2%和生石灰3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 作為培養(yǎng)基質(zhì)，裝入塑料袋中形成棒狀，以菌棒形式進(jìn)行生產(chǎn)。

1.3 田間試驗

供試藥劑為50%滅蠅胺可溶性粉劑。

1.3.1 殘留消解動態(tài)試驗 茶樹菇采用菌棒豎放培養(yǎng)，每小區(qū)面積5 m2，每小區(qū)放置400 個菌棒。施藥劑量為滅蠅胺有效成分3 433.5 g/hm2，待出菇后，噴霧施藥1 次，每小區(qū)用藥液量為3 L，重復(fù) 2 次。于藥后 2 h 及 1、2、3、5、7、10、14、21、28 d 取茶樹菇和菌棒樣品。

1.3.2 最終殘留試驗 設(shè)4 個不同施藥劑量和不同施藥次數(shù)的小區(qū)，每小區(qū)面積5 m2，菌棒數(shù)量約550 個，以滅蠅胺有效成分2 289 g/hm2、3 433.5 g/hm2的劑量施藥3、4 次，于田間茶樹菇生產(chǎn)間歇茬口開始施藥，不強(qiáng)調(diào)茶樹菇必須著藥，施藥間隔期為7 d。另設(shè)不施藥對照區(qū)。于末次施藥后3、5、7 和10 d 分別取茶樹菇和菌棒樣品。

1.3.3 取樣方法 茶樹菇樣品按五點法取整株出菇部分，每小區(qū)取不少于12 個點，總質(zhì)量不少于2 kg，用食物調(diào)理機(jī)打碎，混勻，待分析。

菌棒按五點法整袋取樣，每小區(qū)取5 個點。菌棒長度約15 cm，分為上、中、下3 段，每段約5 cm，分別用食物調(diào)理機(jī)打碎，混勻，待分析。

1.4 樣品前處理

稱取10 g 樣品，加入1.0 mL 水和30.0 mL 甲醇，于12 000 r/min 下勻漿2 min；加入7 g 氯化鈉后劇烈振蕩1 min；移取1 mL 上清液至1.5 mL離心管中，于10 000 r/min 下離心10 min；取上清液過0.22 μm 微孔膜，待測定。

試驗過程中，對初步測定后測定溶液濃度高于線性范圍的樣品，用甲醇稀釋后再測定，以確保測定樣品溶液濃度在線性范圍內(nèi)。

1.5 儀器分析條件

色譜條件：使用色譜柱為ZORBAX Eclipse plus C18Rapid Resolution HT 3.0 mm × 100 mm 1.8-Mincron 600Bar，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣體積2 μL。流動相A 相為5 mmol/L 醋酸銨 + 0.1%甲酸水溶液，B 相為甲醇，流速為0.4 mL/min。采用梯度洗脫程序，梯度變化見表1。

表1 液相色譜-質(zhì)譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of LC-MS/MS

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描 (ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測模式 (MRM)；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速7 L/min；霧化氣壓力241.4 kPa；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L /min；毛細(xì)管電壓3 KV；噴嘴電壓0 V。多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)見表2。

1.6 方法學(xué)驗證

稱取滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g (精確至0.000 1 g)，用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲醇水溶液溶解，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于 ?20 ℃下避光保存。用甲醇稀釋滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配成質(zhì)量濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1 和0.2 mg/L 的系列滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，外標(biāo)法定量。以滅蠅胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 滅蠅胺多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 2 Multi-reaction monitoring parameters of cyromazine

向空白茶樹菇和菌棒中分別添加滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.01、0.1 和1 mg/kg，每個水平重復(fù)5 次，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 施藥方式和劑量的選擇

食用菌生產(chǎn)中主要的施藥方式為拌料和噴霧?？紤]到噴霧方式直接接觸食用部位，殘留影響更大，故選擇噴霧作為本研究的施藥方式。

鑒于有關(guān)滅蠅胺殘留的研究報道較少，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對本研究的參考價值不大，故在本試驗開展過程中，通過對常年從事茶樹菇生產(chǎn)的基地和生產(chǎn)者進(jìn)行調(diào)研，參照其日常防治用藥量，確定本研究的施藥劑量為滅蠅胺有效成分2 289 和3 433.5 g/hm2。

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

分別考察了乙腈、甲醇、V (甲醇) : V (水) = 30 :1 作為提取溶劑對滅蠅胺提取效率的影響。結(jié)果表明：當(dāng)以乙腈或甲醇作為提取溶劑時，滅蠅胺的回收率均較低，在30%～60%之間，不能滿足殘留分析的要求。當(dāng)以V (甲醇) : V (水) = 30 : 1 作為提取溶劑時，滅蠅胺的回收率為72%～110%，加入過量的氯化鈉，可在一定程度上降低部分大分子雜質(zhì)在提取液中的溶解度，再高速離心可去除提取液中的懸浮顆粒，達(dá)到有效提取和凈化基質(zhì)中目標(biāo)分析物滅蠅胺的目的。故最終選擇加水輔助甲醇提取，加入氯化鈉后高速離心凈化的前處理方法。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

結(jié)果 (表 3) 表明：在 0.002～0.05 mg/L 和 0.01～0.2 mg/L 范圍內(nèi)，滅蠅胺的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積間均呈良好的線性關(guān)系，R2≥ 0.997。能夠滿足本試驗定量分析的要求。

按照添加回收的最低濃度確定方法的定量限，則滅蠅胺在茶樹菇和菌棒樣品上的定量限(LOQ) 均為0.01 mg/kg；依據(jù)最低濃度的信噪比估算方法檢出限，則滅蠅胺在茶樹菇和菌棒中的檢出限 ((LOD) 均為 0.002 mg/kg。

表3 滅蠅胺的線性范圍、決定系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear range, coefficient of determination, LOD and LOQ of cyromazine

在0.01、0.1 和1 mg/kg 添加水平下，滅蠅胺在茶樹菇和菌棒中的回收率均在72%～110% 之間，RSD 在2%～6%之間 (表4)，均滿足農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則的要求[20]。

表4 滅蠅胺在茶樹菇和菌棒中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recoveries and RSDs of cyromazine in Agrocybe aegerita and its substrates (n = 5)

2.4 滅蠅胺殘留消解動態(tài)

結(jié)果 (表5) 表明，滅蠅胺在茶樹菇中的殘留消解規(guī)律符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型，消解曲線為ct= 0.285e?0.127t(R2= 0.795 7)，半衰期為 5.46 d；菌棒中滅蠅胺殘留集中分布在上段，藥后1～21 d 的殘留量在0.33～0.69 mg/kg 之間，無明顯降低趨勢，且遠(yuǎn)高于中段 (0.022～0.091 mg/kg) 和下段(0.017～0.091 mg/kg) 中滅蠅胺殘留量。

由于滅蠅胺通過自上而下噴霧方式施入，在菌棒中逐漸下滲，故上段農(nóng)藥殘留量明顯高于中、下段，但隨著時間的變化，上、中、下段中滅蠅胺的殘留量比例變化不顯著，這可能與菌棒為半閉體系有關(guān)。藥后21 d 內(nèi)菌棒中的滅蠅胺殘留量無明顯的降低，說明滅蠅胺在菌棒中的殘留時間較長，施藥一次即可滿足茶樹菇一個出菇周期 (約為20 d) 的用藥需求。

2.5 滅蠅胺最終殘留結(jié)果

由表6 可知，噴霧施藥后按照茶樹菇正常生長周期進(jìn)行取樣，滅蠅胺在茶樹菇中的殘留量為0.053～0.18 mg/kg，在菌棒上段殘留量為0.67～1.58 mg/kg，菌棒中段為0.035～0.46 mg/kg，菌棒下段為＜0.010～0.20 mg/kg?？梢姕缦壈窔埩糁饕性诰舻纳隙?。

茶樹菇中滅蠅胺殘留規(guī)律：1) 采樣間隔期越長，殘留量越低。2) 施藥劑量越大，殘留量越高。由于最終殘留試驗中在出菇間歇時施藥，故茶樹菇中的滅蠅胺均為自菌棒中內(nèi)吸傳導(dǎo)所獲得，說明在菌棒中的施藥劑量越大，茶樹菇吸收滅蠅胺的量越大。3) 施藥3 次和4 次處理間的殘留量差異不大，在一定程度上說明視防治需求適當(dāng)增加用藥次數(shù)，可能不會增加茶樹菇中滅蠅胺的殘留風(fēng)險。4) 最終殘留試驗施藥次數(shù)、施藥總量均高于消解動態(tài)試驗，但殘留量卻低于后者，說明直接噴施在食用菌表面殘留的滅蠅胺比從基質(zhì)中吸收的滅蠅胺殘留量高，可以采取在出菇間歇茬口施藥的方式以降低其在食用菌中的殘留量。

表5 滅蠅胺在茶樹菇及菌棒中的消解動態(tài)Table 5 Dissipation dynamics of cyromazine in Agrocybe aegerita and its substrates

表6 滅蠅胺在茶樹菇和菌棒上的最終殘留量Table 6 Terminal residues of cyromazine in Agrocybe aegerita and its substrates

菌棒中滅蠅胺殘留規(guī)律：1) 滅蠅胺殘留主要集中在上段菌棒中。2) 施藥劑量和施藥次數(shù)對菌棒中的殘留量影響不顯著。

3 結(jié)論與討論

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶樹菇及其菌棒中的滅蠅胺殘留量，方法簡單、快捷，檢出限低，其平均回收率為72%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2%～6%。與乙酸銨-乙腈提取、固相萃取凈化等標(biāo)準(zhǔn)方法相比，該方法更加簡便，較相關(guān)文獻(xiàn)中乙腈提取后加氯化鈉分層的方法提取效率更高。

消解動態(tài)試驗結(jié)果表明，滅蠅胺在茶樹菇中的半衰期為5.46 d；滅蠅胺在菌棒中主要分布于上段，且在施藥后21 d 內(nèi)殘留量無明顯的降低，基本可提供茶樹菇一個出菇周期的持續(xù)防效。

最終殘留試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與消解動態(tài)試驗結(jié)果一樣，滅蠅胺殘留主要集中在菌棒上段。最終殘留試驗中茶樹菇上的滅蠅胺殘留量較菌棒中的殘留量低，且比消解動態(tài)試驗中茶樹菇直接著藥的殘留量低。故在實際生產(chǎn)中可將用藥時期控制在未出菇時，既能夠避免茶樹菇直接著藥產(chǎn)生較高殘留，又能對在菌棒中孵化和生長的菇蚊、菇蠅幼蟲進(jìn)行有效防治。

在食用菌生產(chǎn)中，采取培養(yǎng)基質(zhì)用藥，一定程度上既能保障相關(guān)病蟲害的有效防治，又能降低可食部分的農(nóng)藥殘留，對食用菌用藥防治方法的改進(jìn)有實際的意義。

試驗結(jié)果表明，按有效成分2 289～3 433.5 g/hm2施藥3～4 次，3 d 后滅蠅胺在茶樹菇中的殘留量在0.10～0.17 mg/kg 之間。結(jié)合國際農(nóng)藥殘留和本研究結(jié)果，建議我國規(guī)定滅蠅胺在食用菌上的MRL 值為1.0 mg/kg。由于食用菌屬于小宗作物，農(nóng)藥企業(yè)的登記成本較高，雖然用藥需求大，但企業(yè)主動登記的積極性并不高，希望有關(guān)部門能夠引導(dǎo)農(nóng)藥企業(yè)登記，并積極推動限量標(biāo)準(zhǔn)制定工作，以便更好地指導(dǎo)食用菌生產(chǎn)用藥。

本文選擇目前農(nóng)藥殘留風(fēng)險較高的食用菌——茶樹菇作為研究對象，分析其在食用菌上的殘留行為，其栽培方式較為單一，生產(chǎn)主要在棚室內(nèi)進(jìn)行，需要對光照、溫度、濕度進(jìn)行控制，不同試驗點之間的差異性不大。本研究結(jié)果是基于北京一個試驗地點的研究數(shù)據(jù)，雖在一定程度上能夠反映生產(chǎn)實際，但離完全支撐食用菌中農(nóng)藥殘留限量國家標(biāo)準(zhǔn)的制定尚有一定差距。此外，由于不同的食用菌栽培方式和生長情況差異較大，該研究結(jié)果是否在其他食用菌中具有類似的規(guī)律，還有待進(jìn)一步研究證實。在檢測方法方面，本試驗方法雖未能將甲醇提取液與樣本基質(zhì)中的水完全分離，但由于同類基質(zhì)中含水量相近，樣本與提取液的結(jié)合方式相同，故采取此方法開展研究基本能夠滿足要求。為適應(yīng)不同基質(zhì)檢測的需要，其檢測方法有待進(jìn)一步優(yōu)化。