雷潔 龍敏 肖硯微 林曉文 張靜

(深圳市南山區(qū)婦幼保健院檢驗科，廣東 深圳 518067)

脆性X綜合征(FXS)是常見的遺傳性智力低下疾病之一[1]，也是引起孤獨癥譜系障礙最主要的單基因遺傳疾病[2]。超過99%的FXS是由于Xq27.3的脆性X智力低下基因1 (FMR1) 5’端非編碼區(qū)(CGG)n三核苷酸重復(fù)序列的異常擴增及CpG島的異常甲基化引起脆性X智力低下蛋白(FMRP)的表達下降或缺失所導(dǎo)致[3-4]，目前尚無有效的治療方法。因此，開展廣泛的篩查工作，對攜帶者和患者予以必要的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷以降低患兒的出生率是防治此病的關(guān)鍵。本研究中，我們對不明原因智力低下和孤獨癥譜系障礙兒童脆性X綜合征FMR1基因篩查情況及表型進行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年11月至2019年11月就診于我院的不明原因智力低下和孤獨譜系障礙患兒35例。其中男31例，女4例；年齡1～10歲，平均4.7歲。

1.2方法

1.2.1染色體核型分析 采用常規(guī)外周血淋巴細胞培養(yǎng)法，培養(yǎng)68～72 h，收獲前1 h用秋水仙素處理，制片，進行G顯帶核型分析，每例隨機計數(shù)30個分裂相，嵌合體病例計數(shù)100個分裂相。分析3～5個核型，異常者加倍計數(shù)與分析并根據(jù)人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制命名(ISCN2016)。

1.2.2全基因組拷貝數(shù)變異檢測(CNV-seq) 收集脆性X綜合征篩查患者外周血，結(jié)合低通量測序基因組拷貝數(shù)分析(CNV-seq)和生物信息學(xué)分析技術(shù)，利用BGISEQ500測序平臺進行全基因組范圍內(nèi)染色體拷貝數(shù)異常檢測。具體包括基因組DNA的提取、酶切、連接接頭、PCR富集、純化、獲得DNA文庫、測序和分析等步驟。將測序讀長與已知人類參考基因組進行匹配比對，統(tǒng)計完全匹配的讀長數(shù)，計算樣本間的Log2比值，并采用特定算法判讀待測樣本的染色體情況。針對大小為100 kb以上的片段進行致病性分析。CNVs的臨床意義參照最新版美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(ACMG)遺傳變異分類標準與指南[5]通過檢索DECIPHER、DGV、OMIM數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合表型及CNV-seq比對結(jié)果綜合判定。

1.2.3脆性X綜合征篩查實驗 采集患者外周血2 mL，利用外周血基因組提取試劑盒提取基因組DNA。采用閱微基因脆性X綜合征檢測試劑盒、PCR儀及基因分析儀(ABI 3500 DX Genetic Analyzer)，利用熒光定量PCR擴增結(jié)合毛細管電泳檢測法對FMR1基因5’端非編碼區(qū)CGG重復(fù)次數(shù)進行檢測。CGG重復(fù)數(shù)量小于45 次為正常型，45～54 次為中間型，55～200 次為前突變型，大于200次為全突變型。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料及結(jié)果 在35例患兒中，智力低下者14例，占40%；孤獨系譜障礙7例，占20%；另外還包括語言發(fā)育遲緩等臨床表型。35例患兒中31例外周血染色體核型正常，染色體多態(tài)性2例，另外2例染色體核型異?；純悍謩e為47,XY,+mar和46,XY,inv(8)(p11.2q21.2)。CNV分析結(jié)果顯示31例正常，4例異常患兒分別為del(20)(q13.13) chr20:g.49317261_49608453del，dup(18p11.1p11.32)chr18:g.67662_150410898×4，dup(22)(q11.23) chr22:g.23674079_25063169dup以及dup(16)(p13.3) chr16:g.59995_156550dup。脆性X基因篩查結(jié)果顯示，F(xiàn)MR1基因(CGG)n重復(fù)數(shù)小于40的有32例，占91.43%；(CGG)n重復(fù)數(shù)40～45之間的有2例，占5.71%；此外有1例患者FMR1基因(CGG)n重復(fù)數(shù)大于200，占2.86%。見表1。

表1 35例不明原因智力低下及孤獨系譜障礙患兒核型、CNVs及脆性X基因篩查結(jié)果分析

(續(xù)表) 表1

2.2脆性X綜合征陽性病例表型及家系分析 35例患兒中檢出1例患者的FMR1基因(CGG)n重復(fù)數(shù)大于200，患者男性，受檢時2歲10個月，臨床表現(xiàn)語言發(fā)育遲滯，只會叫“媽媽”，大耳，陰莖較同齡兒童大，另身高明顯高于同齡兒童。患兒母親表現(xiàn)為長臉，身高較高，余無明顯異常，父親無明顯異常表征，對患兒父母進行脆性X綜合征篩查發(fā)現(xiàn)其母親FMR1基因(CGG)n重復(fù)數(shù)為128，為前突變型，父親正常。同時，患兒的CNV測試未檢測出有臨床意義的染色體拷貝數(shù)異常。見圖1。

圖1 脆性X綜合征陽性病例的FMR1基因(CGG)n重復(fù)數(shù)和CNVs分析

3 討 論

脆性X綜合征是僅次于唐氏綜合征的引起智力低下的疾病[6]。由于X染色體連鎖遺傳特征，男性患病率約為1/7 000，明顯高于女性患病率1/11 000[7]。本研究中的篩查對象也以男性患者為主。同時，脆性X綜合征常表現(xiàn)孤獨癥樣的癥狀，如社會交往能力差、非言語及言語交流障礙以及重復(fù)的機械刻板行為，是孤獨癥譜系障礙最常見的共患病[8]。脆性X綜合征在不同人群中的患病率有所差異，在高加索男性智力低下人群中的發(fā)病率為2.6%～8.7%[9]，亞洲人群中臺灣地區(qū)發(fā)病率約為1.9%[10]，日本男性智力低下患者中脆性X綜合征的發(fā)生率約為0.8%～2.4%[11]。本研究中通過檢測發(fā)現(xiàn)1例患兒的FMR1基因(CGG)n重復(fù)數(shù)大于200，為全突變型，占2.86%，與前述研究發(fā)病率基本符合。而我國其它學(xué)者報道的脆性X綜合征在智力低下患兒中的發(fā)病率有較大差異，如N.Zhong等[12]在1 127例智力低下患者中發(fā)現(xiàn)脆性X綜合征的發(fā)病率為2.8%，與本研究相仿；李薇等[13]對2 300例智力低下患者篩查發(fā)現(xiàn)90例脆性X綜合征，占3.9%，略高于本研究；而趙蓓等[14]的研究則在3 844例智力低下患者中篩查發(fā)現(xiàn)了343例脆性X綜合征，占8.9%。由此可見，針對脆性X綜合征開展大規(guī)模的篩查工作，對于明確其在我國智力低下人群中準確的發(fā)病率具有重要意義。

針對脆性X綜合征的篩查主要依賴于臨床特征和實驗室檢查。臨床特征主要包括智力低下及相關(guān)家族史、大耳、巨睪癥、孤獨癥樣癥狀等[15]，本研究中發(fā)現(xiàn)的脆性X綜合征患兒呈現(xiàn)典型的語言發(fā)育滯后，智力低下，陰莖發(fā)育異常等臨床癥狀，對于臨床篩查具有重要的提示價值。然而，由于個體表型差異較大，表型復(fù)雜，且不易與其它導(dǎo)致智力低下和孤獨癥樣癥狀相區(qū)別。攜帶前突變基因的女性有50%的概率將突變傳遞給下一代，在子代中轉(zhuǎn)變成全突變的概率與母親前突變(CGG)n重復(fù)次數(shù)的大小有關(guān)，(CGG)n重復(fù)達100次以上時轉(zhuǎn)變成全突變的概率接近100%，該患兒母親FMR1基因(CGG)n重復(fù)數(shù)為128，再生育男孩患病風險接近100%。目前，脆性X綜合征FMR1基因的分子遺傳學(xué)檢測是確診的唯一手段，也是進行產(chǎn)前診斷的必備技術(shù)。CMA、CNV-seq等染色體拷貝數(shù)檢測技術(shù)和FMR1基因檢測已被推薦為不明原因智力低下遺傳學(xué)病因診斷的一線篩查手段[16]。值得關(guān)注的是，由于脆性X綜合征的檢測涉及FMR1基因非編碼區(qū)CGG重復(fù)數(shù)的檢測，目前常用分子遺傳方法如二代測序，CMA，CNV-seq等均不能檢出脆性X綜合征的動態(tài)突變。因此，針對FMR1基因動態(tài)突變的檢測是對不明原因智力低下及孤獨癥譜系障礙病因?qū)W分析重要的補充分析方法。依據(jù)FMR1基因突變的特點，現(xiàn)行已建立了多種有效的實驗室診斷方法，諸如Southern雜交、甲基化特異性PCR、免疫細胞化學(xué)方法等[17]。Southern雜交法是主要確診方法，但對CGG重復(fù)數(shù)較少的攜帶者或嵌合體可能漏診，酶解不完全時則可能誤診。而且該法費用昂貴，費時費力，需要大量DNA，有放射性危害，不適合基層大范圍篩查。常規(guī)PCR檢測可診斷正常和CGG重復(fù)數(shù)較少的攜帶者，但無法診斷CGG重復(fù)數(shù)較多的攜帶者和全突變者。本研究中采用的基于三引物熒光定量PCR結(jié)合毛細管電泳技術(shù)[18]，不僅具有靈敏度高、可重復(fù)性強的特征，更重要的是可準確計算出CGG重復(fù)數(shù)，并且對女性雜合子攜帶者具有良好的篩查效果(如本研究表1中篩查檢出2例女性患者的CGG重復(fù)數(shù)存在差異)，可快速準確區(qū)分不同基因型人群，對脆性X綜合征的篩查及確診實驗的開展具有良好的優(yōu)勢。

綜上所述，針對智力低下、孤獨癥等人群開展脆性X綜合征的臨床和實驗室篩查工作對于提早發(fā)現(xiàn)、盡早干預(yù)，以及對患兒父母進行必要的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，避免智力低下患兒的出生具有重要意義。