劉明輝 黃 波 馮瑤 劉曉舒 王 實(shí) 張 何 宋光熠 劉文艷*

遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽 110101

糖尿病腎病是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，其發(fā)生發(fā)展是由多種因素的綜合作用而導(dǎo)致，因其病因復(fù)雜而使得臨床治療缺乏有效的藥物，目前在糖尿病及其并發(fā)癥的防治的藥物應(yīng)用上，中藥及其有效組分被廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)研究旨在證實(shí)復(fù)方中藥組分對糖尿病及糖尿病腎病防治的有效性，并對其作用機(jī)制進(jìn)行研究探討。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級SD種系大鼠(8周齡、190～210g體重)、繁育鼠固體顆粒飼料(由遼寧省長生生物技術(shù)有限公司提供)。鏈脲菌素(Streptozotocin)為Adamas Reagent CO.Ltd產(chǎn)品(貨號：CFHF-33231A批號：644548120509規(guī)格：25g；95+)。中藥復(fù)方制劑(成分含黃芪多糖、麥冬多糖、三七皂苷等)由北京普惠天悅生物技術(shù)有限公司提供。caspase-3、Na+,K+-ATPase、SOD、CAT、MDA等測定試劑盒均來源于南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)設(shè)備有北京京立LDZ5-2低速離心機(jī)、德國耶拿SPECORD plus200紫外-可見分光光度計、上海三科318C酶標(biāo)儀。

1.2方法

1.2.1制作大鼠糖尿病模型方法 用0.01mol/L檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制濃度為12.2mg/ml的鏈尿菌素，每1Kg體重以155mg的標(biāo)準(zhǔn)一次性大鼠腹腔注射給藥。鏈尿菌素注射給藥1周后，檢測大鼠空腹血糖，將其中血糖水平高于16.0mmol/L的大鼠選為合格大鼠，隨機(jī)將合格大鼠分為模型對照組、中藥組分干預(yù)組(小劑量干預(yù)組、大劑量干預(yù)組)，要求10只/組、雌雄各半。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法 小劑量干預(yù)組、大劑量干預(yù)組大鼠分別以50mg/Kg、500mg/Kg(體重)標(biāo)準(zhǔn)，每天用復(fù)方中藥組分灌胃；模型對照組大鼠每天用同樣體積生理鹽水灌胃。灌胃藥量標(biāo)準(zhǔn)各組均為10ml/kg(體重)。另取10只大鼠(雌雄各半)作為正常(空白)對照組，用與注射鏈尿菌素同樣體積的0.01mol/L、 pH5.0檸檬酸緩沖液，給大鼠一次性腹腔注射，并每天以10ml/kg(體重)標(biāo)準(zhǔn)的生理鹽水灌胃。各組大鼠連續(xù)給藥12周后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)檢測：①斷頭采血進(jìn)行caspase-3檢測。②腎臟取材，進(jìn)行10%組織勻漿后，再離心15min(3000r/min)，最后取上清液進(jìn)行Na+,K+-ATPase、SOD、CAT和MDA檢測(按試劑盒說明書操作)。

2 結(jié) 果

2.1 Caspase-3含量、腎組織Na+,K+-ATPase活性的變化 連續(xù)給藥12周后，各組大鼠實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果提示：鏈脲菌素糖尿病模型對照組Caspase-3含量明顯高于空白對照組、腎組織Na+,K+-ATPase活性明顯低于空白對照組；大劑量組腎組織Na+,K+-ATPase活性明顯高于模型對照組；復(fù)方中藥組分無論是大劑量組還是小劑量組，其Caspase-3含量均明顯低于模型對照組；小劑量組與模型對照組無顯著性差異。詳見表1

表1 中藥組分對鏈脲菌素糖尿病大鼠血漿Caspase-3和腎組織Na+,K+-ATPase的影響的影響

2.2腎組織SOD、CAT、MDA的變化連續(xù)給藥12周后，各組大鼠血漿SOD、CAT、MDA的檢測結(jié)果為：糖尿病模型對照組MDA明顯高于正常對照組，而其SOD和CAT明顯低于空白對照組；復(fù)方中藥組分大劑量組SOD和CAT均高于模型對照組，但其MDA則低于模型對照組；復(fù)方中藥組分小劑量組SOD、CAT和MDA與模型對照組比較均無顯著性差異。詳見表2

表2 中藥組分對鏈脲菌素糖尿病大鼠腎組織SOD、CAT、MDA的影響

3 討 論

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病持續(xù)10～20年，DN的發(fā)生率能達(dá)到30%～50%，出現(xiàn)蛋白尿的患者臨床觀察約7年內(nèi)有50%發(fā)展至終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)，所以，DN早期的防治尤為重要[1,2]。大量的研究表明在DN蛋白尿發(fā)生、發(fā)展和腎小球硬化過程中，腎臟細(xì)胞損傷是直接致病因素。

Caspase-3是氧化應(yīng)激引起腎臟細(xì)胞凋亡損傷的重要細(xì)胞因子[3,4]。生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)能夠被SOD消除，SOD可對抗與阻斷因氧自由基而造成的細(xì)胞損害，還可及時修復(fù)受損細(xì)胞，是氧自由基的頭號殺手[5]；CAT主要作用就是催化過氧化氫分解成氧和水，達(dá)到清除體內(nèi)的過氧化氫的目的，使得H2O2不能與O2反應(yīng)生成非常有害的-OH，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害[5,6]；自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物即MDA，具有細(xì)胞毒性，其產(chǎn)生也會加劇膜的損傷。

本項實(shí)驗(yàn)研究表明由含黃芪多糖、麥冬多糖、三七皂苷等中藥成分配制的復(fù)方制劑對鏈脲菌素糖尿病大鼠的腎臟具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與下調(diào)caspse-3水平，抑制腎臟細(xì)胞凋亡和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，升高SOD、CAT，降低MDA及提高腎臟組織Na+，K+-ATPase活性均密切相關(guān)，但要發(fā)揮這些作用，要求復(fù)方制劑需要大劑量使用，如小劑量應(yīng)用則對腎臟幾乎無保護(hù)作用。