彭思璐 劉 冰 寇 丹 劉仁偉

四川綿陽(yáng)四0四醫(yī)院感染科，四川 綿陽(yáng) 621000

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)癌癥死因順位中，肝癌僅次于肺癌，位居第二，已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的重要疾病之一。近來(lái)的研究[1]結(jié)果提示，肝癌及其癌前病變過(guò)程與肝細(xì)胞內(nèi)的癌基因激活、抑癌基因失活及相關(guān)基因調(diào)控通路紊亂有關(guān)，microRNA(miR)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈 RNA分子，均由內(nèi)源基因編碼，雖然不能參與蛋白質(zhì)的合成，但對(duì)于基因功能和表達(dá)水平可發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中均扮演著重要的角色。但采用miR作為肝癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警標(biāo)志物的相關(guān)研究仍不夠充分，特別是與AFP等傳統(tǒng)血清標(biāo)志物用于評(píng)價(jià)肝纖維化程度、病毒載量等的對(duì)比研究較為缺乏?；谏鲜霈F(xiàn)況，本文針對(duì)HBV感染者外周血miR和AFP水平與肝纖維化、HBV-DNA的相關(guān)性進(jìn)行了分析，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2018年02月-2020年02月在四川綿陽(yáng)四0四醫(yī)院感染科就診的33例HBV感染患者作為研究對(duì)象，對(duì)患者外周血miR水平、AFP水平進(jìn)行檢測(cè)，并分析其與肝纖維化程度、血清HBV-DNA水平、血清HBV五項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性，所有患者均簽署知情同意書(shū)自愿參與本研究，本研究方案符合《赫爾辛基宣言》要求。納入標(biāo)準(zhǔn)：入選患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，診斷標(biāo)準(zhǔn)為：既往有CHB病史或乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性超過(guò)6個(gè)月，現(xiàn)HBsAg和(或)HBV-DNA仍為陽(yáng)性，年齡大于18歲，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他肝炎病毒感染者、酒精性肝病患者、免疫性肝病患者、代謝或遺傳性肝病患者、肝癌患者；合并其它部位惡性腫瘤、血液疾病、免疫缺陷癥、心肺腎等其它重要器官功能不全患者、腦卒中、急性冠狀動(dòng)脈綜合征的患者；妊娠期或哺乳期患者。

1.2觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.2.1無(wú)創(chuàng)肝纖維化檢測(cè) 采用Fibrotouch瞬時(shí)彈性成像技術(shù)對(duì)患者的肝硬度值(LSM)進(jìn)行定量檢測(cè)，瞬時(shí)彈性掃描儀購(gòu)自法國(guó)Echosens公司，根據(jù)《瞬時(shí)彈性成像技術(shù)(TE)臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)(2015年)》[3]，將LSM>8.5kPa判定為顯著肝纖維化，并將納入患者分為研究組(發(fā)生顯著肝纖維化)和對(duì)照組(未發(fā)生顯著肝纖維化)。

1.2.2血漿miR水平檢測(cè) 采集所有患者的空腹外周靜脈血樣本5mL，取2mL血樣經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理后離心分離血漿，采用R1200-100T型總RNA提取試劑盒(美國(guó)Solarbio公司)提取血漿總RNA，采用特異的莖環(huán)引物對(duì)目標(biāo)microRNA進(jìn)行混合反轉(zhuǎn)錄，采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)戏磻?yīng)(PCR)方法對(duì)miR-20a、miR-21、miR-26a、miR-122、miR-192、miR-146a、miR-223和miR-483-5p等8種miR水平進(jìn)行檢測(cè)，PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，引物購(gòu)自博奧新景公司。

1.2.3血清AFP水平檢測(cè) 取3mL血樣在室溫下靜置2h后離心分離血清，應(yīng)用UniCel DxI800型全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)(美國(guó)Beckman Coulter公司)采用化學(xué)發(fā)光免疫法對(duì)血清AFP水平進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒為儀器配套試劑盒。

1.2.4血清HBV-DNA水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)血清HBV-DNA水平進(jìn)行定量檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.5血清HBV五項(xiàng)檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光法對(duì)血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb進(jìn)行定量檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光分析儀及試劑盒均購(gòu)自美國(guó)雅培公司。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者年齡、性別構(gòu)成及觀察指標(biāo)的比較 兩組患者在年齡、性別構(gòu)成及血清HBV五項(xiàng)指標(biāo)、AFP水平方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，研究組患者的LSM、血漿miR水平、血漿HBV-DNA水平分布均高于對(duì)照組，兩組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者年齡、性別構(gòu)成及觀察指標(biāo)的比較

2.2HBV感染者外周血miR和AFP水平與肝纖維化、HBV DNA的相關(guān)性分析 Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，血漿miR水平與LSM、血清HBV-DNA水平均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與年齡、血清HBV五項(xiàng)指標(biāo)、血清AFP水平均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，而血清AFP水平與年齡、血漿miR水平、LSM、血清HBV-DNA水平、血清HBV五項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表2

表2 HBV感染者外周血miR和AFP水平與肝纖維化、HBV-DNA的相關(guān)性

3 討 論

肝癌具有起病隱匿，早期診斷率低及高侵襲性、高轉(zhuǎn)移率、高復(fù)發(fā)率的臨床特點(diǎn)，故早期預(yù)警、早期診斷是改善肝癌預(yù)后的關(guān)鍵。目前，針對(duì)肝癌及其癌前病變的診斷方法主要包括病理學(xué)檢查、影像學(xué)檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查，其中，肝穿刺活組織檢查是診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但針對(duì)早期病灶的穿刺難度較大，而且作為一種創(chuàng)傷性檢查，無(wú)法用于篩查和監(jiān)測(cè)；超聲、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、核磁共振成像(MRI)等影像學(xué)檢查對(duì)于早期肝癌的診斷具有較大局限性，難以檢出體積小的病灶，而且有超過(guò)20%的早期肝癌缺乏典型的影像學(xué)表現(xiàn)[4]；血液腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)勢(shì)，能夠用于無(wú)癥狀人群的腫瘤篩查，成為了肝癌預(yù)警及其癌前病變?cè)\斷的重要手段和熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。miR一般由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，成熟的miR與目標(biāo)mRNA的3'-UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，通過(guò)降解靶mRNA、抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯等機(jī)制調(diào)節(jié)靶蛋白的生成，從而發(fā)揮維持正常干細(xì)胞功能、調(diào)控細(xì)胞增殖分化等多重生物學(xué)作用。miR基因表達(dá)量約占整個(gè)基因組的1%，目前在人類(lèi)基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)的miR種類(lèi)已經(jīng)超過(guò)2500個(gè)，可對(duì)人類(lèi)基因組中三分之一的基因發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)，有研究[5]利用miR探針基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了miR-221、miR-145、let-7及 miR-122a等35種miR在原發(fā)性肝癌和肝硬化組織中存在表達(dá)異常，在后續(xù)的研究[6]中，學(xué)者們又先后發(fā)現(xiàn)了miR-125b、miR-195、miR-199a、miR-101、miR-718等多種與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征有關(guān)的miR，由于miR片段較小且具有穩(wěn)定性，故外周血miR表達(dá)水平與腫瘤組織中表達(dá)水平具有相似的變化趨勢(shì)，血漿miR不受RNA酶的影響，能夠在低溫條件下長(zhǎng)期保存且檢測(cè)方便，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，這都提示了miR有望成為一種新型血液標(biāo)志物用于肝癌的預(yù)警和早期診斷。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血中存在多種miR的異常表達(dá)，這些miR可能來(lái)源于腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)部，當(dāng)腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡時(shí)，這些miR通過(guò)外泌體等方式進(jìn)入血液循環(huán)，此外，在腫瘤侵襲周?chē)M織過(guò)程中，正常組織中的miR也會(huì)因組織損傷而釋放入血。本研究結(jié)果顯示，出現(xiàn)顯著肝纖維化的HBV感染患者的血漿miR水平出現(xiàn)了明顯上調(diào)，而且其水平與LSM及血清HBV-DNA水平具有相關(guān)性，能夠用于預(yù)測(cè)HBV感染患者的顯著肝纖維化。通過(guò)這一結(jié)果可見(jiàn)，外周血miR表達(dá)水平的升高可能提示著肝纖維化程度的加劇和病毒活動(dòng)性的增強(qiáng)，提示著肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的升高，其機(jī)制可能是，在HBV感染病變進(jìn)展至肝纖維化時(shí)期時(shí)，肝組織細(xì)胞的破壞和不良增生會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的特異性miR釋放入血，從而使患者出現(xiàn)外周血miR水平的上升，因此，血漿miR水平可作為評(píng)價(jià)HBV感染患者病情活動(dòng)度和肝癌風(fēng)險(xiǎn)的輔助指標(biāo)。同時(shí)，本研究結(jié)果也提示了HBV-DNA水平對(duì)于預(yù)測(cè)肝纖維化也具有一定的價(jià)值，這提示了較高的病毒載量可能與肝纖維化程度有關(guān)，故及時(shí)有效的抗病毒治療也是降低HBV感染患者肝癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵手段。

綜上所述，HBV感染患者血漿miR水平與其肝纖維化程度和病毒載量具有相關(guān)性，而AFP與這兩項(xiàng)指標(biāo)缺乏相關(guān)性，血漿miR水平和血清HBV-DNA水平可作為預(yù)測(cè)患者肝纖維化的輔助指標(biāo)，肝纖維化程度高和HBV-DNA載量水平高的人群發(fā)生肝癌風(fēng)險(xiǎn)程度高，臨床醫(yī)生應(yīng)有效利用miR等外周血標(biāo)志物對(duì)患者的肝癌風(fēng)險(xiǎn)開(kāi)展早期預(yù)警，積極采取抗病毒和抗肝纖維化治療，從而降低肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、提高早期診斷率、改善患者的預(yù)后。