劉 娟 鄭國棟 陳 杰 鄒曙明

(1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201306;2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部團(tuán)頭魴遺傳育種中心,上海201306;3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306)

水體中的溶氧水平是生物生存、生長、發(fā)育和能量代謝等過程中必不可少的因素。水體中的溶氧含量易受到外界因素(如天氣狀況)影響[1],當(dāng)水體氧含量不足以滿足魚體正常生存的需求時(shí),魚體就會(huì)出現(xiàn)缺氧應(yīng)激反應(yīng)[2],缺氧應(yīng)激會(huì)影響魚體生長、發(fā)育、繁殖和代謝等方面,長時(shí)間的低氧脅迫或脅迫強(qiáng)度過大時(shí),甚至?xí)饌€(gè)體死亡[3,4]。

缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factors,HIFs)是缺氧應(yīng)答反應(yīng)的主要調(diào)控因子,在維持動(dòng)物體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)平衡的過程中起著至關(guān)重要的作用[5]。在常氧條件下,脯氨酸羥基化酶家族(Prolyl hydroxylases,PHDs)在特定脯氨酸殘基位點(diǎn)羥基化HIF-1和HIF-2,并通過泛素蛋白酶系統(tǒng)迅速使HIF-1和HIF-2蛋白發(fā)生降解[6—8]。而在低氧條件下,PHDs的酶活性受到抑制,TET1與PHD2競爭與HIF-2結(jié)合,導(dǎo)致PHD2降低HIF-2的羥基化,增強(qiáng)低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9,10]。TET(Ten eleven translocation)1屬于α- 酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid,α-KG)和Fe2+依賴的雙加氧酶大家族,是一種5mC羥基化酶,是DNA去甲基化過程中不可或缺的一種酶[11],在調(diào)控胚胎干細(xì)胞的發(fā)育,腫瘤、血液系統(tǒng)等有重要作用。通過在斑馬魚(Danio rerio)和小鼠(Mus musculus)的研究,肖武漢團(tuán)隊(duì)研究表明,DNA羥甲基化酶基因TET1參與缺氧應(yīng)答反應(yīng),并在缺氧應(yīng)答反應(yīng)中有重要作用[9]。Tsai等[12]研究表明,TET1是由低氧誘導(dǎo)因子(HIF-2)調(diào)控的。TET1作為HIF-1α的輔助激活物,增強(qiáng)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性[12]。Chen等[13—15]研究表明,TET1參與了缺氧反應(yīng)的改變并參與了腫瘤的發(fā)生。

團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類,草食性,俗稱武昌魚。團(tuán)頭魴與其他鯉科魚類相比,具有不耐低氧的特點(diǎn),在運(yùn)輸和養(yǎng)殖過程中,容易因缺氧而引起應(yīng)激反應(yīng),甚至死亡,影響了其養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高。因此研究缺氧應(yīng)答相關(guān)基因,探究團(tuán)頭魴缺氧應(yīng)答基因的相關(guān)功能就顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料均取自上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部團(tuán)頭魴遺傳育種中心,受精卵為團(tuán)頭魴(F4代)卵細(xì)胞人工體外受精,將受精卵培養(yǎng)于培養(yǎng)皿(直徑15 cm)約100—120顆,在室溫(22±1)℃,溶氧量(7.0±0.5)mg/L下培養(yǎng),使用經(jīng)24h曝氣的自來水,每4—5h換水。每隔4h(0—40h)固定一批胚胎,按照RNA保存液使用說明操作,保存于-80℃至使用。原位雜交所用胚胎去卵膜后于4%磷酸緩沖液4℃、12h,后轉(zhuǎn)至甲醛中-20℃保存;取體質(zhì)量為150—160 g的F5代團(tuán)頭魴暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室的塑料水族箱(35 cm×55 cm×45 cm)中,暫養(yǎng)7d,溫度(24.5±1.0)℃、溶氧量(7.0±0.5)mg/L,每2日換水(24h曝氣的自來水)1/3,每日投喂兩次(8:00和16:00),保持自然光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

取30尾F5代團(tuán)頭魴幼魚于3個(gè)自動(dòng)循環(huán)系統(tǒng)的水箱(50 L)各10尾,共設(shè)2個(gè)溶氧水平,低氧處理方法參考Zhang等[16],根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)其中兩組為低氧組(1.5±0.5)mg/L;對(duì)照組(7.0±0.5)mg/L,急性缺氧處理4h,各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取3尾魚,MS-222(100 mg/L)麻醉,取組織(心、肝臟、腦、鰓、肌肉、皮膚、眼睛、腎和脾臟)-80℃保存,而后將缺氧處理組恢復(fù)至常氧(7.0±0.5)mg/L,24h后取組織-80℃保存,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。團(tuán)頭魴極不耐低氧,胚胎在低氧條件下極易死亡,故根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),胚胎低氧處理組設(shè)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組,每組200顆胚胎,低氧組(3.5±0.5)mg/L;對(duì)照組(7.0±0.5)mg/L,低氧處理6h,低氧處理組在6、12、18、24及30 hpf取樣,放入RNA保存液,對(duì)照組也及時(shí)在對(duì)應(yīng)的各個(gè)發(fā)育階段取樣,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)200顆胚胎。水體溶氧水平通過氮?dú)夂驮鲅醢舻臍忾y通氣大小來控制,并及時(shí)用溶氧儀檢測氧含量。

1.3 TET1基因擴(kuò)增及序列測定

通過與GenBank中預(yù)測的多種鯉科魚類TET1 mRNA序列比對(duì),根據(jù)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組中已有TET1序列,設(shè)計(jì)引物F1/R1(表1),以團(tuán)頭魴腦組織cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR,分別擴(kuò)增獲得TET1基因片段序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接至pGEM-T載體,篩選獲得陽性克隆送上海生工測序,測序結(jié)果經(jīng)整合確認(rèn)其為目的條帶。

表1 所用引物序列Tab.1 Primers sequences used in this study

1.4 序列及進(jìn)化樹分析

利用BioEdit 7.0.0.1、NCBI BLAST等軟件對(duì)所得序列比對(duì)獲得TET1基因序列。用NCBI BLAST對(duì)不同物種的TET1蛋白預(yù)測序列進(jìn)行比較[17]。用Clustal X1.81同源比對(duì)蛋白序列,Phyre2、Pymol軟件預(yù)測TET1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[18]。MEGA 6.06構(gòu)建TET1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[19]。

1.5 整胚原位雜交(WISH)分析

根據(jù)原位雜交探針的設(shè)計(jì)原則,探針的引物(表1),用Primer5.0軟件在ORF與3′UTR之間設(shè)計(jì)探針引物(700—1000 bp),進(jìn)行常規(guī)TA克隆,送測,將質(zhì)粒用內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切,酶切產(chǎn)物作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,體外轉(zhuǎn)錄使用的地高辛作為標(biāo)記[20]。

原位雜交實(shí)驗(yàn)[21]主要包括胚胎賦水、蛋白酶K處理、固定胚胎、去除固定、預(yù)雜交和雜交,然后探針的去除洗滌和抗體血清的封閉及抗體血清的去除、洗滌胚胎、羅氏BM染料顯色和拍照等關(guān)鍵步驟。

1.6 熒光定量(qRT-PCR)分析

實(shí)時(shí)定量PCR使用PCR熒光定量儀(BioRad,Hercules,CA,USA),以18S[21]為內(nèi)參基因,引物序列(表1),Mix使用SYBR Green Premix ExTaq(TaKaRa)。所得數(shù)據(jù)以Mean±SE的形式表示,用SPSS進(jìn)行單因素方差法分析。

2 結(jié)果

2.1 團(tuán)頭魴TET1基因的序列分析

團(tuán)頭魴TET1基因全長為5526 bp,編碼1841個(gè)氨基酸,通過Phyre2、Pymol軟件模擬預(yù)測TET1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),將團(tuán)頭魴TET1與人類TET1、斑馬魚TET1對(duì)比,發(fā)現(xiàn)人類、斑馬魚與團(tuán)頭魴TET1二級(jí)結(jié)構(gòu)相似,都主要包括無規(guī)則卷曲及α螺旋(圖1)。

通過MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,TET1與對(duì)應(yīng)的物種聚合度良好,團(tuán)頭魴的TET1基因與無脊椎動(dòng)物的TET1基因聚為一支,而人類、小鼠、虎鯨等脊椎動(dòng)物聚為一支。在魚類分支中,團(tuán)頭魴的TET1與金線鲃、露斯塔野鯪和斑馬魚聚為一個(gè)小分支(圖2)。

圖1 人類、斑馬魚及團(tuán)頭魴TET1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 The predicted secondary structure of TET1 in human,zebrafish and blunt snout bream

圖2 團(tuán)頭魴TET1基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of blunt snout bream TET1 sequences in vertebrates

2.2 TET1在胚胎和組織中的表達(dá)模式

整胚原位雜交結(jié)果顯示,TET1基因在12 hpf時(shí)在頭部檢測到相對(duì)較弱信號(hào)(圖3b),在24和36 hpf胚胎時(shí)期,TET1基因主要在頭部強(qiáng)烈表達(dá)(圖3d和3f);qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,團(tuán)頭魴TET1基因從受精卵開始就有表達(dá),隨著胚胎不斷發(fā)育它們的表達(dá)水平明顯的提高,在20 hpf處顯著升高,并在20—44 hpf都維持在一個(gè)較高水平(圖4a),這與原位雜交結(jié)果基本一致。如圖4b所示,團(tuán)頭魴TET1廣泛表達(dá)于各個(gè)組織中,并在腦組織中高度表達(dá),在肝、心和鰓組織中表達(dá)相對(duì)較低。

2.3 TET1在胚胎和組織中的低氧表達(dá)分析

通過qRT-PCR檢測急性低氧脅迫處理團(tuán)頭魴各組織中TET1的表達(dá)量,結(jié)果顯示在低氧脅迫下,TET1基因在鰓、肝臟、心和脾組織中極顯著地升高(P＜0.01),但在腦、皮膚、眼和腎臟中顯著地降低(P＜0.01),氧含量恢復(fù)24h后,各個(gè)組織均有恢復(fù)的趨勢,但大多尚未恢復(fù)到正常表達(dá)水平(圖5)。胚胎低氧脅迫的檢測結(jié)果顯示,低氧處理組胚胎TET1基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(圖6),尤其在24 hpf低氧處理組的表達(dá)量極顯著地高于對(duì)照組(P＜0.001)。

3 討論

團(tuán)頭魴是一種不耐低氧的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類。本研究中對(duì)團(tuán)頭魴TET1的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析研究,TET1序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示團(tuán)頭魴TET1在3′ 端催化結(jié)構(gòu)域高度保守,包括富含半胱氨酸區(qū)域(Cys-rich domain)和DSBH結(jié)構(gòu)域,兩者構(gòu)成具有雙加氧酶活性的結(jié)構(gòu)。DSBH結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)保守的鐵離子結(jié)合區(qū)和1個(gè)酮戊二酸結(jié)合區(qū)(2-oxoglutarate(2OG)-Fe(II)-dependent dioxygenases),參與將5mC羥化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)、5-甲?；奏?5-formylcytosine,5fC)、5-羧甲基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC)的主動(dòng)去甲基化過程。另外,我們發(fā)現(xiàn)人類TET家族3′ 端都具有保守的催化結(jié)構(gòu)域,這種結(jié)構(gòu)可能決定了TET家族都具有催化5mC羥基化的酶活性。TET15′端有典型的CXXC zinc finger domain,CXXC結(jié)構(gòu)域能增強(qiáng)對(duì)DNA CpG島(富含胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)的DNA區(qū)域)的定向結(jié)合能力,從而完成主動(dòng)去甲基化的過程。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示,團(tuán)頭魴與人類、斑馬魚的TET1結(jié)構(gòu)相似,說明團(tuán)頭魴TET1基因在長期進(jìn)化過程中具有高度的保守性。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示團(tuán)頭魴TET1與其他硬骨魚類具有良好的聚類關(guān)系,這些結(jié)果說明團(tuán)頭魴TET1是硬骨魚特異基因組復(fù)制產(chǎn)生。TET1基因保守的功能性結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列暗示著在進(jìn)化過程中可能具有保守的生物學(xué)功能。

圖3 團(tuán)頭魴TET1基因各時(shí)期的原位雜交結(jié)果Fig.3 Whole-mount embryo in situ hybridization analysis of blunt snout bream TET1 mRNAs

葛亮[22]在斑馬魚中的研究發(fā)現(xiàn),斑馬魚TET1基因在22 hpf及36 hpf主要在頭部表達(dá)。與在斑馬魚中研究相符,我們的研究結(jié)果顯示,團(tuán)頭魴TET1基因在早期表達(dá)相對(duì)微弱,中期和后期表達(dá)信號(hào)顯著增強(qiáng),都主要在頭部表達(dá)。團(tuán)頭魴TET1基因從受精卵開始就有表達(dá),隨著胚胎不斷發(fā)育它們的表達(dá)水平有顯著的提高但有一定的波動(dòng)性,與原位雜交結(jié)果基本一致。這表明TET1可能參與胚胎發(fā)育過程,并在胚胎發(fā)育過程起著重要作用。有研究表明TET1在小鼠ES細(xì)胞的維持和囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)特化相關(guān)[23,24]。團(tuán)頭魴TET1基因在各個(gè)組織都有廣泛的表達(dá),并在腦組織中高度表達(dá),這與在小鼠中的研究相吻合。Kriaucionis和Heintz[25]的研究發(fā)現(xiàn),5hmC在小鼠腦組織高度分布。也有研究表明,TET1對(duì)小鼠腦部神經(jīng)元的發(fā)育有重要相關(guān)性[26,27]。另外,我們發(fā)現(xiàn)除腦組織外,TET1基因在脾和腎等重要組織中也高度表達(dá)。

圖4 團(tuán)頭魴TET1基因在胚胎各時(shí)期(a)及成魚各組織(b)的熒光定量表達(dá)分析Fig.4 qRT-PCR analysis of blunt snout bream TET1 mRNAs levels during embryogenesis(a)and in adult tissues(b)

圖5 TET1基因在各組織中的低氧轉(zhuǎn)錄響應(yīng)Fig.5 The effect of hypoxia on blunt snout bream TET1 mRNAs in juvenile tissues*表示顯著性(P＜0.01)

氧含量對(duì)生物體的生存與生長至關(guān)重要,氧含量易受天氣等的影響而發(fā)生變化,生活在氧含量易變化的魚類在進(jìn)化過程中發(fā)展出適應(yīng)低氧的復(fù)雜機(jī)制[28,29],在適應(yīng)低氧應(yīng)激的過程中,低氧應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化[16,30]。在斑馬魚缺氧脅迫實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)低氧條件下誘導(dǎo)了TET1的mRNA水平,引起5hmC水平增高[9]。本研究發(fā)現(xiàn),團(tuán)頭魴TET1基因在低氧脅迫環(huán)境處理的胚胎中顯著的誘導(dǎo)表達(dá),此結(jié)果表明,團(tuán)頭魴胚胎期的TET1基因可以受到低氧脅迫的誘導(dǎo)。在幼魚的急性低氧脅迫實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴TET1基因在鰓、肝和脾等組織中表達(dá)顯著上調(diào),在腦和皮等組織中表達(dá)顯著下調(diào),這可能暗示著TET1基因在低氧應(yīng)答有重要作用。另外,我們發(fā)現(xiàn)隨著溶氧的恢復(fù)鰓、脾和肝等組織中TET1的表達(dá)量并沒有恢復(fù)到正常水平,說明24h恢復(fù)期不足以讓團(tuán)頭魴TET1基因在低氧脅迫中完全恢復(fù)。Jing等[9]的研究發(fā)現(xiàn),與野生型相比,TET1敲除魚對(duì)低氧更為敏感。根據(jù)在低氧脅迫下胚胎及組織中這些表達(dá)特征可以推斷團(tuán)頭魴TET1基因可能參與低氧脅迫響應(yīng),進(jìn)而增強(qiáng)其對(duì)低氧的適應(yīng)性。

4 結(jié)論

本文主要探究了團(tuán)頭魴TET1的功能結(jié)構(gòu)和胚胎各時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式,及在低氧應(yīng)激條件下胚胎及幼魚各組織中的差異表達(dá)分析。我們認(rèn)為低氧脅迫下TET1基因的差異表達(dá)暗示這可能是一種潛在的低氧調(diào)控機(jī)制,需要我們進(jìn)一步挖掘探究。本研究主要為TET1基因的功能探究提供參考依據(jù),為參與低氧應(yīng)答機(jī)制的研究提供了新的線索。

圖6 TET1基因胚胎發(fā)育各時(shí)期的低氧轉(zhuǎn)錄響應(yīng)Fig.6 The effect of hypoxia on blunt snout bream TET1 mRNAs during embryogenesis