史秀蘭 黃天晴 徐革鋒 鄒作宇 谷 偉 程 琳 劉晨斌 王炳謙

(1.上海海洋大學(xué),上海 201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,哈爾濱 150076;3.哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,哈爾濱 150028)

卵母細(xì)胞成熟是胚胎發(fā)育的開端。成熟期可以進(jìn)一步分為兩個方面,即細(xì)胞質(zhì)成熟和細(xì)胞核成熟,其中核成熟包括在減數(shù)分裂過程中,染色體的聯(lián)會,重組和分離[1,2]。spindlin(Spin)基因在前期的研究中被證明是減數(shù)分裂紡錘體相關(guān)的母體效應(yīng)因子,且從卵母細(xì)胞到早期胚胎發(fā)育的過渡期間,在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[3]。作為豐富的母體轉(zhuǎn)錄物,在小鼠(Mus musculus)[4]、雞(Gallus gallus)[5]和銀鯽(Carassius auratus gibelio)[6]等不同物種的研究中發(fā)現(xiàn),spindlin基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯結(jié)果表現(xiàn)出很大差異。在小鼠卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂期間,spindlin部分定位于減數(shù)分裂紡錘體[7],而雞在整個有絲分裂期間都停留在染色體上,推斷spindlin可能在間期細(xì)胞核中發(fā)揮作用,并在有絲分裂期間作為載體轉(zhuǎn)移到染色體上。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化可調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[8],有研究表明,Spin家族蛋白在細(xì)胞周期中以劑量依賴性方式被磷酸化,在核內(nèi)發(fā)揮重要功能,并且在減數(shù)分裂進(jìn)程中與紡錘體相關(guān)[9],在人(Homo sapiens)[10]、小鼠和雞的Spin蛋白家族中,蛋白激酶C(PKC)磷酸化和酪氨酸磷酸化這兩個潛在位點和RNA結(jié)合基序RNP-1是完全保守的,RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)母體轉(zhuǎn)錄物的及時翻譯和定位[11]。

通過人工誘導(dǎo),精子入卵時,使停滯在第二次減數(shù)分裂中期的卵子重新啟動,此時利用理化手段抑制第二極體的排出,即制得三倍體雌性虹鱒[12]。在生產(chǎn)過程中,三倍體雌性虹鱒生長速度快、肉質(zhì)鮮嫩[13]和養(yǎng)殖死亡率小的優(yōu)勢是二倍體虹鱒不可比擬的,并且逐漸受到市場的親睞。但是三倍體虹鱒性腺敗育的深層機(jī)理方面的研究并不詳盡。了解性腺敗育的機(jī)制是育種的關(guān)鍵,人工誘導(dǎo)的三倍體虹鱒恰成為研究多倍體魚類性腺發(fā)育的良好模型。在前期的研究中發(fā)現(xiàn),三倍體雌性虹鱒在8月齡以后,卵母細(xì)胞成熟開始受阻,不能正常產(chǎn)生配子。當(dāng)發(fā)育到10月齡后,完整的卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)幾乎不存在,由于卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)育異常,染色質(zhì)集中在核中央或偏于一側(cè),即發(fā)生破裂或壞死等敗育現(xiàn)象[14,15]。spindlin基因在脊椎動物如銀鯽、青鳉(Oryzias latipes)[16]和青黑斑河豚(Tetraodon nigroviridis)[17]等進(jìn)行過相關(guān)研究,但在虹鱒的研究中尚未見報道。為深層探究在卵母細(xì)胞敗育過程中減數(shù)分裂機(jī)制中的差異表現(xiàn),本研究選取240—330 dpf發(fā)育時期,采用基因克隆得到spindlin基因cDNA序列,分析了spindlin基因在虹鱒各組織的表達(dá)情況,并且比較了spindlin基因在不同發(fā)育階段二倍體與三倍體雌性虹鱒卵巢中的表達(dá)差異狀況。利用免疫組化方法,觀察在不同發(fā)育時期,Spin蛋白在二倍體與三倍體的卵巢組織中表達(dá)的動態(tài)變化。研究結(jié)果為進(jìn)一步探討多倍體魚類性腺發(fā)育過程中減數(shù)分裂受阻提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品保存

二倍體和三倍體雌性虹鱒取自黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚試驗站,在平均水溫為 9℃的養(yǎng)殖缸中飼養(yǎng),自240—330 dpf期間,每30d取樣1次,共采取全雌二倍體虹鱒48尾,三倍體雌性虹鱒36尾。其中采取3尾二倍體虹鱒的腎、肝、鰓、肌、腸、脾、卵巢、心和眼組織,采取體積大小為3 mm×3 mm;另取二倍體與三倍體虹鱒各6尾的卵巢組織,將所得組織均置于RNA保護(hù)液中,并放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時采取二倍體與三倍體虹鱒各3尾的卵巢組織,采取卵巢組織時,保持其形態(tài)完好度,即前部的扁三棱狀與后部線狀拖尾,并展平置于4%多聚甲醛,常溫備用。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

利用Simply P Total RNA Extraction Kit試劑盒(BioFlux,中國)提取總RNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光光度計檢驗 RNA 的完整度,同時使用ScanDrop 核酸分析儀(Analytik Jena,德國)測量 RNA 濃度和純度,即吸光度值A(chǔ)260/280在1.8—2.0可以留作備用。按照Bio RT高靈敏cDNA第一鏈合成試劑盒(BOER,中國)說明書合成cDNA,其反應(yīng)體系為5 μL Hybrid mix,0.5 μL Enzyme mix,根據(jù)所測得的RNA濃度添加模板量(1 pg—2 μg),加入Nuclease-free water補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)程序為37℃,20min;98℃,5min。獲得的cDNA置于-20℃保存。

1.3 spindlin基因cDNA克隆

在NCBI公共數(shù)據(jù)庫中檢索到與虹鱒同源性較高的物種spindlin基因的序列信息,根據(jù)高度保守區(qū)域設(shè)計引物,引物spindlinF2/R2用于該基因的核心片段克隆,其5′UTR由設(shè)計的引物spindlinF1/R1獲得,引物spindlinF3/R3用于克隆3′UTR,使用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物(表1),引物在蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。核心片段的PCR擴(kuò)增體系為10 μL,反應(yīng)體系為5 μL 2×Taqmixture、0.5 μL Forward primer+Reverse primer、1 μL cDNA、3.5 μL Nuclease-free water。反應(yīng)程序設(shè)置為94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s;59℃退火30s;72℃延伸30s;30個循環(huán);72℃延伸5 min。根據(jù)SMARTer?RACE 5′/3′ Kit Components說明書的方法和步驟進(jìn)行3′UTR和5′ UTR的RACE擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)Biospin Gel Extraction Kit(Bio-Flux公司)純化目的片段,PMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,LB培養(yǎng)基(含氨芐)挑取圓形亮白色單菌落送公司完成測序。

表1 虹鱒spindlin基因序列擴(kuò)增引物信息Tab.1 The primers used for spindlin amplification

1.4 虹鱒spindlin基因序列生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件拼接克隆片段,得到spind-lin基因完整cDNA,采用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行基因開放閱讀框預(yù)測,用Blast在線程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析基因與其他物種的同源性。使用DNAMAN6.0軟件對序列進(jìn)行翻譯及與其他物種同一蛋白的氨基酸序列多重比對。蛋白質(zhì)基本物理化學(xué)參數(shù)分析和結(jié)構(gòu)使用在線網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行分析,構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹用MEGA 7.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining,NJ)發(fā)育樹構(gòu)建工具,進(jìn)行1000 次自展檢驗(Bootstrap)評估進(jìn)化樹分支可信度。

1.5 實時熒光定量PCR

以各時期采取的二倍體和三倍體雌性虹鱒的腎、肝、鰓、肌、腸等組織和卵巢的cDNA 作為實時熒光定量(RT-PCR)的模板,根據(jù)已經(jīng)克隆出的虹鱒spindlin基因序列,以β-actin作為內(nèi)參基因,使用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物(表1),在蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。反應(yīng)體系采用Roche公司(瑞士)的SYBR Green Master 10 μL體系,SYBR Green 5 μL,上下游引物共 0.4 μL,cDNA模板0.5 μL,加ddH2O至10 μL。利用 BIO-RAD CFX96 TOUCH熒光定量儀的 2-ΔΔCt法檢測spindlin基因在各組織以及不同時期卵巢的相對表達(dá)量。反應(yīng)設(shè)置程序為95℃,10min;95℃,10s;60℃,30s;共計40個循環(huán),熔解曲線從 65℃上升到95℃,每秒增加0.5℃。

1.6 Western blot

將采取的二倍體和三倍體雌性虹鱒各時期卵巢組織剪切成細(xì)小碎塊并勻漿,按照每100 mg組織加入1 mL RIPA裂解液(Beyotime,中國)和10 μL PMSF(Beyotime,中國),在冰上使其充分裂解。12000 r/min離心5min 后,取上清放入新的EP管。按照1﹕5加入蛋白上樣緩沖液,煮沸10min,即獲得各時期卵巢蛋白,保存于-20℃待用。將各時期蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳,根據(jù)蛋白marker,切下含有目的條帶的下層分離膠,采用 PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜時需定流 I=200 mA,時間為50min。然后在5%的脫脂乳中封閉2h。用 PBST洗膜,共3次,每次10min。以Spin的抗兔多克隆抗體為一抗(Immunoway,美國),按1﹕1000比例稀釋在4℃過夜孵育,之后用 PBST 洗膜三次。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的(HRP)二抗(抗兔IgG,Immunoway,美國)用孵育液1﹕2000倍稀釋,37℃孵育2h,之后利用 PBST洗膜3次。使用 1 mL ECL 超敏發(fā)光液(500 μL A+500 μL B)滴到膜上進(jìn)行顯影,利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)進(jìn)行曝光和拍照。

1.7 利用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行切片觀察

采取各時期二倍體與三倍體雌性虹鱒卵巢組織,置于4%多聚甲醛中固定48h,然后從50%、70%、80%、85%、90%、95%和100%的乙醇依次進(jìn)行梯度脫水,二甲苯透明,置于硬軟蠟中包埋后,以5 μm厚度切片制成石蠟切片,后進(jìn)行脫蠟,在室溫環(huán)境下,將切片避光浸入3%過氧化氫(蒸餾水稀釋)10min,以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶,使用EDTA溶液進(jìn)行抗原修復(fù),在85℃下浸泡2min,在60℃下浸泡4min。以Spin抗兔多克隆抗體為一抗(Immunoway,美國),按1﹕200比例稀釋在4℃過夜孵育,后用酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物(中杉金橋公司)為二抗進(jìn)行孵育,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,最后用中性樹膠封片,使用OLYMPUS CX41的正置光學(xué)顯微鏡在物鏡40×和目鏡10×鏡頭下觀察,利用IC Capture 2.2軟件獲取圖片。

1.8 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

使用SPSS 17軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,利用Origin 2017軟件對統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行作圖,P＜0.01表示具有極顯著差異性,P＜0.05表示具有顯著差異性。

2 結(jié)果

2.1 虹鱒spindlin序列分析與多序列比對

本研究通過克隆得到虹鱒spindlin基因cDNA全長4529 bp,獲得GenBank登錄號:MN378564,其中3′UTR長3662 bp,5′UTR長141 bp,開放閱讀框(ORF)長726 bp,編碼241個氨基酸。通過對其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,虹鱒Spin蛋白質(zhì)的相對分子量為28.3 kD,理論等電點值為5.94,不穩(wěn)定指數(shù)為43.08,此蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

采用Ensembl和NCBI數(shù)據(jù)庫對spindlin全長cDNA 序列進(jìn)行分析,得到虹鱒spindlin基因的結(jié)構(gòu)圖(圖1)。通過比對發(fā)現(xiàn)虹鱒spindlin位于虹鱒第28號染色體,基因全長約13.5 kb,由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成。利用ExPASy在線分析工具,預(yù)測結(jié)果顯示該基因無信號肽,無跨膜螺旋區(qū),對虹鱒spindlin基因的磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果表明,含有絲氨酸(Ser)磷酸化位點13個[unsp(6/14/15/19/21/22/24/25/27/28)、DNAPK(66)、PKA(90)、PKC(224)],蘇氨酸(Thr)磷酸化位點7個[PKC(51/56/150/205)、unsp(96/193)、PKG(212)],絡(luò)氨酸磷酸化位點4個[unsp(2/72/166/203)],Ser-6的得分最高為0.997。

利用BLAST 在線分析軟件對虹鱒Spin氨基酸與其他物種Spin氨基酸進(jìn)行同源性比對,在硬骨魚類中,虹鱒與銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)同源最高,為99.59%,與銀鯽(Carassius auratus)、鯉(Cyprinus carpio)和斑馬魚(Danio rerio)相比分別為87.11%、92.12%和91.7%。與哺乳動物和兩棲動物相比,與雞(Gallus gallus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)和兔(Oryctolagus cuniculus)的同源性分別為65.26%、65.05%、61.18%和59.76%。與兩棲動物非洲爪蟾(Xenopus laevis)的同源性為60.16%。

圖1 虹鱒 spindlin 基因結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Rainbow trout spindlin gene structure map

2.2 Spin系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用貝葉斯分析的方法對21個物種的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析,系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示,主要分為兩大支,硬骨魚類與哺乳動物類。從分支長度來看,虹鱒與大馬哈魚親緣關(guān)系最近,其次就是紅點鮭(Salvelinus alpinus),聚為一支。與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。其他魚類親緣關(guān)系介于兩者之間(圖2)。

2.3 虹鱒spindlin基因在mRNA水平的表達(dá)模式

Spindlin基因在二倍體雌性虹鱒的卵巢、腎、肝、脾、肌、鰓、心、眼、腸和鰭等組織中均有表達(dá)。且spindlin基因在卵巢組織中的表達(dá)與其他各組織差異極顯著(P＜0.01),明顯高于其他各組織的表達(dá)。在其他組織如腎、肝、脾、肌肉、鰓、眼、腸和鰭之間相對表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05),但在心臟和鰭中的表達(dá),與其他組織有顯著性差異(P＜0.05,圖3A)。

通過分析spindlin基因在卵巢組織中不同發(fā)育階段不同倍性的相對表達(dá)量,可得出以下結(jié)論,在240—300 dpf發(fā)育階段,與三倍體雌性虹鱒不同發(fā)育時期卵巢相比,二倍體雌性虹鱒中spindlin基因的相對表達(dá)量顯著的下降,在300—330 dpf階段,表達(dá)量有回升,但恢復(fù)不到240 dpf的表達(dá)量水平。且在240、270和330 dpf階段之間差異不顯著(P＞0.05)。在240—330 dpf發(fā)育階段,與二倍體雌性虹鱒不同發(fā)育時期卵巢相比,三倍體雌性虹鱒中spindlin基因的相對表達(dá)量顯著的上升,240 dpf與270 dpf、300 dpf和330 dpf存在極顯著差異(P＜0.01),270、300和330 dpf之間差異不顯著(P＞0.05)。在同一發(fā)育階段中,spindlin基因在二倍體雌性虹鱒卵巢中的表達(dá)量較三倍體雌性虹鱒相對較高,且均存在極顯著差異(P＜0.01,圖3B)。

2.4 二倍體與三倍體虹鱒卵巢組織學(xué)觀察結(jié)果分析

在240—330 dpf階段時,二倍體虹鱒卵母細(xì)胞體積逐漸增大,核仁的數(shù)量也在增多,在卵母細(xì)胞膜的邊緣出現(xiàn)零散的濾泡細(xì)胞(Follicle cell,Fc),外排的核仁形成類核周體(Nuage,Nc),胞質(zhì)與核膜之間出現(xiàn)透明層,隨后,卵母細(xì)胞繼續(xù)變大,透明層消失。與二倍體虹鱒不同,三倍體虹鱒在240—330 dpf發(fā)育階段卵巢發(fā)育異常,卵原細(xì)胞包囊化,形成卵原細(xì)胞簇,通常由4—6個卵原細(xì)胞外被一層膜包裹。通過Spin蛋白在卵巢組織中的表達(dá)和定位分析,可以得到如下結(jié)論,在240—330 dpf發(fā)育階段,二倍體雌性虹鱒(圖4A)與三倍體虹鱒(圖4B)的卵巢組織中均有特異性表達(dá)條帶,從其深淺變化結(jié)果與實時熒光定量結(jié)果基本一致。對于二倍體虹鱒卵巢,在240 dpf,陽性信號主要集中在細(xì)胞核內(nèi),且陽性信號最強(qiáng)(圖5a),在270 dpf時,信號在核內(nèi)減弱,向胞質(zhì)擴(kuò)散(圖5b),在300 dpf時期,核內(nèi)信號持續(xù)降低,到達(dá)最低點,胞質(zhì)信號逐漸增強(qiáng)(圖5c),而330 dpf時,核內(nèi)信號回復(fù),但仍比240 dpf時弱(圖5d)。這與卵母細(xì)胞發(fā)育軌跡是相同的。對于三倍體虹鱒卵巢,由于主要存在敗育的卵母細(xì)胞和卵原細(xì)胞簇,在240—330 dpf階段,在卵原細(xì)胞中表達(dá),且信號逐漸加強(qiáng),在卵原細(xì)胞簇間隙的濾泡細(xì)胞有較弱的信號。

3 討論

圖2 Spin氨基酸序列NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The Neighbor-Joining Phylogenetic tree for amino acid sequences of Spin

圖3 spindlin基因?qū)崟r定量表達(dá)情況Fig.3 Real-time quantitative expression of spindlin genes

圖4 Spin蛋白在虹鱒二倍體與三倍體卵巢組織中不同發(fā)育時期表達(dá)情況Fig.4 Spin protein expression in different developmental stages in the diploid and triploid ovarian tissues of rainbow trout

本研究克隆得到了虹鱒spindlin基因cDNA序列全長,編碼由245個氨基酸組成的蛋白質(zhì),預(yù)測分析不存在信號肽,且無跨膜螺旋區(qū),由于蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化對細(xì)胞周期的調(diào)控是有重要作用的,在分析該基因可能存在的磷酸位點可知,絲氨酸和蘇氨酸的位點最多,且絲氨酸得分最高,在之前的研究中證明,Spin蛋白質(zhì)是MAP激酶途徑中的底物,它在絲氨酸或蘇氨酸殘基上的磷酸化是必不可少的,它與主軸相互作用發(fā)揮功能,說明可能通過磷酸化spindlin來進(jìn)行減數(shù)分裂細(xì)胞周期的調(diào)控[18—20]。小鼠的spindlin基因轉(zhuǎn)錄在未受精和受精后2細(xì)胞期到4細(xì)胞期可以被檢測到,到8細(xì)胞以后未見有表達(dá)。在雞中,在早期胚胎中chSpin-W和chSpin-Z都被轉(zhuǎn)錄,chSpin-Z在成年雞的各種組織中表達(dá),而chSpin-W在卵巢顆粒和睪丸細(xì)胞中有顯著表達(dá)。在銀鯽中,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以從成熟卵到囊胚胚胎中檢測到,但其含量從2細(xì)胞期降低,在原腸胚階段后的階段中無法被檢測到[21]。在這次研究中,在成魚虹鱒各組織中均有表達(dá),但在卵巢表達(dá)量最高,說明spindlin基因在卵母細(xì)胞成熟過程持續(xù)發(fā)揮作用,并不是只在胚胎早期有調(diào)控功能。在240—330 dpf發(fā)育階段,spindlin基因在二倍體雌性虹鱒卵巢組織表達(dá)量無顯著性差異,在三倍體虹鱒卵巢組織呈現(xiàn)低水平表達(dá)且為上升趨勢,由于魚類卵母細(xì)胞在成熟階段,先停滯在減數(shù)第一次分裂的G2期末,即生發(fā)泡(Germinal vesicle,GV)期,隨后,在促黃體激素作用下,再次恢復(fù)減數(shù)分裂,完成卵母細(xì)胞成熟[22]。值得注意的是卵母細(xì)胞完成從第一次減數(shù)分裂雙線期向中期的轉(zhuǎn)變時,會發(fā)生核膜破裂,皮層區(qū)細(xì)胞骨架的重排和減數(shù)分裂紡錘體的組裝等事件。由于三倍體虹鱒存在第三套染色體,在減數(shù)分裂偶線期,即同源染色體聯(lián)會發(fā)生紊亂,使得減數(shù)分裂不能正常進(jìn)行,無法排出成熟配子,導(dǎo)致不具備受精能力。三倍體虹鱒的spindlin基因低表達(dá)恰好證實了這一觀點。在三倍體虹鱒發(fā)育后期階段,性腺敗育形成的卵原細(xì)胞簇,會進(jìn)行再分化形成類生精細(xì)胞囊,此時與卵原細(xì)胞簇并存,且類生精細(xì)胞囊成為性腺結(jié)構(gòu)的主要組成成分,卵巢呈現(xiàn)類雄性化,由于不能正常產(chǎn)生精子,最終會出現(xiàn)大量敗育的精子細(xì)胞[23],在此階段可能是spindlin基因表達(dá)上升的原因,但這一推測仍需進(jìn)一步驗證。

圖5 Spin蛋白在虹鱒二倍體與三倍體卵巢組織中不同發(fā)育時期表達(dá)分布狀況Fig.5 Distribution of Spin protein in different gonadal stages of diploid and triploid female rainbow trout

關(guān)于Spin蛋白在核仁中的定位,在免疫組化結(jié)果顯示,Spin蛋白質(zhì)表達(dá)模式符合特定的亞細(xì)胞定位,并且與特定功能一致[24]。核仁是在卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育重要的細(xì)胞器,并且在卵子發(fā)生過程中發(fā)生廣泛的形態(tài)學(xué)變化[25,26]。密集的核仁定位意味著spindlin可能是組成調(diào)控卵母細(xì)胞生長過程的重要因子,且可以作為追蹤核仁形態(tài)變化和功能作用的標(biāo)志物。顯示的數(shù)量眾多的核仁可能與虹鱒卵母細(xì)胞發(fā)育有關(guān)。

根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn),在240—330 dpf發(fā)育階段,spindlin基因在二倍體雌性虹鱒與三倍體虹鱒卵巢組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)的趨勢同細(xì)胞自噬調(diào)控通路mTOR(Mammalian target of rapamycin)受體基因TOR1變化趨勢一致[27],有研究表明,細(xì)胞自噬在三倍體雌性虹鱒性腺敗育過程中起重要作用,由于mTOR通路在三倍體雌性虹鱒卵巢發(fā)育的過程中受阻,細(xì)胞自噬水平增加,使得細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄翻譯發(fā)生紊亂,甚至缺失。關(guān)于spindlin基因是否與這一通路有關(guān)還未見報道,但在人類研究中,已表征了兩個Spin蛋白同系物(Spin-1和Spin-2),揭示了其與抗凋亡和腫瘤發(fā)生有關(guān)[28],這為進(jìn)一步探討spindlin基因功能提供了有力的證據(jù)。三倍體虹鱒性腺敗育的發(fā)生機(jī)制還需進(jìn)一步探討。