劉新華 翁美其 宋 銳 趙媛莉 章晉勇,4* 肖調(diào)義

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙 410128;2.中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室,淮安研究中心,武漢 430072;3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,青島 266109;5.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所,長沙 410153)

微孢子蟲是一類在自然界中廣泛存在的、形成孢子的專性細胞內(nèi)寄生蟲,主要寄生于昆蟲、魚類、哺乳動物和甲殼類等[1,2]。搖蚊幼蟲生活于自然水體底部,常鉆入底泥中,以有機碎屑和腐敗物質(zhì)為食,從而容易攝入底泥中的成熟孢子而發(fā)生感染[3]。目前,搖蚊幼蟲已成為微孢子蟲重要宿主之一,全球已報道約50余種搖蚊幼蟲微孢子蟲[4,5]。我國水生微孢子蟲的研究主要集中于魚類或甲殼類經(jīng)濟動物,如寄生于南美白對蝦肝胰腺的蝦肝腸孢蟲(Enterocytozoon hepatopenaeiTourtip,et al.2009)、寄生于中華絨螯蟹肝胰腺的中華絨螯蟹肝孢蟲(Hepatospora ericheriorStentiford,et al.2013)、寄生于珍珠龍膽腸道上皮細胞核內(nèi)的石斑魚腸孢蟲(Enterospora epinepheliYan,et al.2018)、寄生于真鯛腹腔的真鯛格留蟲(Glugea pagriSu,et al.2014)等,而在搖蚊幼蟲上至今仍沒有相關(guān)報道[6—10]?；诖?作者于2017年11月至2018年8月對我國養(yǎng)殖池塘中搖蚊幼蟲微孢子蟲感染情況進行初步調(diào)查,發(fā)現(xiàn)一種寄生于羽搖蚊幼蟲脂肪體的微孢子蟲,通過形態(tài)學(xué)、透射電鏡觀察以及分子生物學(xué)分析,鑒定其為薩梅諾娃新佩雷斯蟲(Neoperezia somenovaiaeIssi,et al.2012)。本研究是薩美諾娃新佩雷斯蟲在國內(nèi)的新記錄和中國首例搖蚊幼蟲微孢子蟲報道。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及處理

于2017年11月至2018年8月在江蘇洪澤異育銀鯽養(yǎng)殖場(33°21′20″N,118°52′47″E)收集到羽搖蚊幼蟲120尾(體長5.3—7.6 cm),活體運輸至當?shù)佤~病研究室觀察。

1.2 活體檢查

首先,肉眼觀察帶回的搖蚊幼蟲,當發(fā)現(xiàn)有疑似感染個體時,取少量病灶組織進行壓片觀察確認,并在1000×倍下鏡檢對新鮮孢子進行觀察、測量和拍照。同時分離感染的脂肪體組織分別保存在95%酒精以及2.5%中性戊二醛中,以用于后續(xù)的分子分析與電鏡觀察。

1.3 超微結(jié)構(gòu)觀察

將感染的脂肪體組織保存到2.5%中性戊二醛中,4℃固定24h,磷酸緩沖液沖洗,經(jīng)1%鋨酸固定和磷酸緩沖液漂洗后,再經(jīng)系列丙酮脫水,滲透、包埋和切片后經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,HITACHI H-7700透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu),工作電壓為80 KV。

1.4 DNA提取、18SrDNA序列的擴增和測定

取酒精保存的感染組織,剪碎后用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次以去除殘余酒精。加入600 μL磷酸緩沖液和適量酸洗玻璃珠(直徑0.1 mm),用樣本快速勻漿儀Fast Prep-24 5G(MP,美國)破碎孢壁,6.0速率振蕩4次,每次20s。鏡檢觀察孢子是否完全破碎。破碎后利用細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen,德國)提取樣品基因組DNA。羽搖蚊鑒定用真核生物COⅠ通用引物LCO1490(5′-GGTCA ACAAATCATAAAGATATTGG-3′)與HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)進行擴增[11],PCR反應(yīng)體系為50 μL,其中DNA 2 μL、1× PCR mixture 25 μL(康為,北京),正反引物各2 μL(10 μm)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s;50℃退火30s;72℃延伸1min,35個循環(huán);72℃終延伸10min。微孢子蟲用其18S rDNA通用引物V1F(5′-CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC-3′)與1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行擴增[12,13],PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括2 μL DNA、25 μL 1×PCR mixture(康為,北京)、正反引物各2 μL(10 μm),最后補加雙蒸水至50 μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min;94℃變性40s;50℃退火30s;72℃延伸2min,35個循環(huán);72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,用膠回收試劑盒(康為,北京)純化回收,將目的片段連接到pMD18-T載體(TaKaRa,日本),再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中,50 μL/mL氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基均勻涂布并培養(yǎng)過夜,挑取陽性克隆,用于測序。測序在自動測序儀ABI PRISM?3730 DNA Sequencer(Applied Biosystems USA)上完成。測序結(jié)果通過BioEdit進行拼接[14],并根據(jù)測序峰圖進行人工校正(DNASTAR INC.,Madisom,Wis),將拼接完畢的序列提交至Gen-Bank。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及遺傳距離分析

將所獲得序列通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對,并從GenBank上選取相似性較高的種類18S rDNA序列數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,選取Trichonosema pectinatellae(AF484695)為外類群。利用CLUSTAL 1.8[15]對進行多重比對,分別利用最大似然法(Maximum Likehood,ML)和貝葉斯法(Bayesian Inferences,BI)進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。通過jModelTest[16]挑選最佳核苷酸替代模型應(yīng)用于ML和BI分析。ML分析利用PhyML 3.0[17]軟件進行運算100代。BI分析利用Mr.Bayes[18]軟件進行操作,以隨機樹(Random)為起始樹,替換模型參數(shù)Nst為6,馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法(Markov chain Monte Carlo process)設(shè)置為4條鏈同時運行1000000代。獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹用Figtree v1.4.4(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)和Adobe Illustrator(Adobe Systems Inc.美國)編輯、注釋。

2 結(jié)果

2.1 宿主鑒定及形態(tài)描述

擴增獲得搖蚊COⅠ基因709 bp,將其提交到GenBank(序列號:MN750315),BLAST比對發(fā)現(xiàn)其與羽搖蚊序列(JF412099)相似性為98.2%,在種內(nèi)范圍之內(nèi),表明宿主為羽搖蚊幼蟲。

搖蚊感染薩梅諾娃新佩雷斯蟲個體可見脂肪體組織明顯白濁(圖1A),感染率為12.5%(15/120)。成熟孢子呈卵圓形,孢子長(5.7±0.2)μm(5.3—6.3 μm),寬(3.7±0.1)μm(3.4—4.0 μm,圖1B、1C)。

2.2 超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡觀察顯示發(fā)育階段均為離核,與宿主細胞質(zhì)直接接觸,無產(chǎn)孢囊或寄生囊泡狀結(jié)構(gòu),各發(fā)育階段發(fā)育不同步(圖2)。早期單核裂殖體階段未觀察到,僅發(fā)現(xiàn)一些高電子密度的多核裂殖體(圖2A),經(jīng)原生質(zhì)團分裂形成單核或多核產(chǎn)孢體,進一步發(fā)育為孢子母細胞(圖2B、2C)。孢子母細胞形狀不規(guī)則,與宿主細胞質(zhì)直接接觸,周圍被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)繞。隨著發(fā)育的進行可見極絲、孢壁以及錨狀盤等微孢子蟲的典型結(jié)構(gòu)。成熟孢子卵圓形,離核,細胞核較大,位于孢子正中央,細胞核周圍被大量核糖體圍繞(圖2D—F)。極質(zhì)體分為兩部分,前半部分為中空格子狀,后半部分薄膜狀(圖2G)。錨狀盤位于孢子前端,呈蘑菇狀。孢壁三層,外層為高電子密度層,厚26.5—62.7 nm,中層為電子透明層,厚151.8—236.1 nm,最里層為質(zhì)膜層(圖2H)。同型極絲,30—31圈,分2—3列排列(圖2D)。后泡較小,位于孢子的末端(圖2E)。

圖1 薩梅諾娃新佩雷斯蟲光鏡觀察Fig.1 Observation of Neoperezia semenovaiae by light microscope

圖2 薩梅諾娃新佩雷斯蟲透射電鏡觀察Fig.2 Electron micrographs of spores of N. semenovaiae

2.3 分子序列分析

通過分子克隆獲得2條1356 bp 18S rDNA序列,GC含量43.8%,二者間相似性為99.8%。將獲得序列與相似性較高的種類進行相似性與遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)(表1),遺傳距離最近的為N. semenovaiae(0.0076/99.2%,HQ396520),其他相似的種類還有:N. chironomi(0.0324/96.8%,HQ396519),Schroedera airthreyi(0.0396/96.1%,AJ749819),Brynosemaplumatellae(0.0452/95.5%,AF484692)。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)本研究所報道的微孢子蟲與Neoperezia、Bryonosema及Schroedera屬種類聚為一枝;Neoperezia semonovaiae中國種群先聚為一個分支后,再與俄羅斯種群聚類,支持率高(圖3)。

圖3 基于18S rDNA基因序列構(gòu)建的貝葉斯(BI)系統(tǒng)發(fā)育樹(分子節(jié)點數(shù)值分別表示BI和ML的分枝支持率)Fig.3 Phylogenetic tree of N. semenovaiae generated by Bayesian inferences(BI)based on the partial 18S rDNA sequences(Numbers at branch nodes indicate the support values of Bayesian inferences(BI)and maximum likelihood(ML)support values)

表1 基于18S rDNA對薩梅諾娃新佩雷斯蟲與相似性較高種類的相似性(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)Tab.1 Comparison of similarities(above diagonal)and genetic distances(below diagonal)of N. semenovaiae with other most similar species based on the partial 18S rDNA

分類學(xué)信息:

薩梅諾娃新佩雷斯蟲Neoperezia semenovaiaeIssi,et al.2012

宿主:羽搖蚊幼蟲Chironomus plumosuslarva

采樣地點:江蘇洪澤異育銀鯽養(yǎng)殖場(33°21′20″N,118°52′47″E)

寄生部位:脂肪體

宿主大小:體長5.3—7.6 cm

感染率:12.5%(15/120)

樣本保存:2.5%戊二醛與95%酒精固定標本保存于中國科學(xué)院水生生物研究所魚病研究室,標本號:MTR201712291、MTR201712292.

序列號:薩梅諾娃新佩雷斯蟲(MN512229,MN512230),羽搖蚊(MN750315)。

3 討論

傳統(tǒng)微孢子蟲的分類學(xué)研究主要基于不同發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)特征,由于不同發(fā)育階段形態(tài)特征復(fù)雜,同種、屬間也存在顯著差異,特別是一些具有多態(tài)性的種類,易造成冗余種屬的出現(xiàn),如此前一種寄生于苔蘚蟲的種類(Pseudonosema cristatellae)因其發(fā)育階段出現(xiàn)藕核而錯誤的鑒定為Nosema cristatellae[19];Amblyospora屬種類生活史需要多個宿主完成,具多態(tài)性,在不同宿主中不同發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)特征差異顯著,常被鑒定為不同的種類[20]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)手段的發(fā)展,上述問題得到有效的解決,結(jié)合不同發(fā)育階段的形態(tài)特征、生態(tài)特征(寄主生境與寄生部位)及分子特征已成為微孢子蟲分類學(xué)研究的標準方法[1,2]。

N. semenovaiae因其孢子具有二態(tài)性,早先被錯誤的鑒定為Semenovaiae chironomi,與Neoperezia分別歸屬于兩個不同科中[21,22]。近期,俄羅斯學(xué)者應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)分類學(xué)手段相結(jié)合的方法對S. chironomi進行重新鑒定,發(fā)現(xiàn)S. chironomi與N. chironomi應(yīng)為同屬種類,根據(jù)命名先后順序,取消了Semenovaiae屬,并將Semenovaiae chironomi重命名為N. semenovaiae[23]。本研究發(fā)現(xiàn)的種類各發(fā)育階段形態(tài)特征與Neoperezia屬種類一致[21],如宿主相同,成熟孢子為卵圓形,極絲圈數(shù)較多,細胞核較大等。目前,Neoperezia屬種類已報道兩種,分別為N. chironomi和N. semenovaiae(表2)。N. chironomi寄生于宿主軀體所有脂肪體組織,本文描述的種類只發(fā)現(xiàn)寄生于軀體前段的脂肪體組織[19,20]。此外,其極絲圈數(shù)比N. chironomi更多(30—31vs.24—27),二者在孢子大小上也有明顯差別。透射電鏡發(fā)現(xiàn)薩梅諾娃新佩雷斯蟲早期發(fā)育階段較少,未發(fā)現(xiàn)孢子二態(tài)型,產(chǎn)孢體、孢子母細胞以及成熟孢子超微結(jié)構(gòu)特征與N. semenovaiae相似。另外,BLAST比對發(fā)現(xiàn)其與N. semenovaiae序列相似性為99.1%,進一步證實二者應(yīng)為同種。值得注意的是,在我國發(fā)現(xiàn)的N. semenovaiae所有發(fā)育階段均是與宿主細胞質(zhì)直接接觸,未觀察到產(chǎn)孢囊結(jié)構(gòu),而俄羅斯科學(xué)家之前證實其在產(chǎn)孢體、孢子母細胞以及成熟孢子時期出現(xiàn)產(chǎn)孢囊結(jié)構(gòu),這可能是由于其產(chǎn)孢囊結(jié)構(gòu)較薄、不易觀察所導(dǎo)致[23]。

表2 薩梅諾娃新佩雷斯蟲與已報道的新佩雷斯屬種類形態(tài)特征比較Tab.2 Morphological comparison of Neoperezia semenovaiae with other reported Neoperezia spp.

系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)薩梅諾娃新佩雷斯蟲與新佩雷斯蟲、苔蘚蟲微孢子蟲(Bronosema plumatellae、Schroedera plumatellae及Schroedera airthreyi)聚為一個獨立進化枝,表明新佩雷斯蟲與一些苔蘚蟲微孢子蟲可能來源于共同祖先。進一步分析發(fā)現(xiàn),薩梅諾娃新佩雷斯蟲中國種群先聚為一個支系,然后與俄羅斯種群進行聚類,表明地理隔離已對該物種造成了分化,但其祖先種究竟起源于中國還是俄羅斯仍需進一步的研究。此外,羽搖蚊幼蟲廣泛分布于我國不同省份水域,調(diào)查我國不同區(qū)域羽搖蚊幼蟲是否感染N. semenovaiae及感染后在形態(tài)學(xué)與分子水平上是否已發(fā)生分化也是我們未來需要關(guān)注的方向之一。

綜上所述,本文報道了我國首例搖蚊幼蟲微孢子蟲,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生態(tài)學(xué)特征以及分子特征將其鑒定為薩梅諾娃新佩雷斯蟲。