徐貴靜，王新本，賈孝榮

（蘭州古馳生物科技有限公司，甘肅蘭州 730050）

百合（Lilium browniivar.viridulum Baker）是百合科百合屬多年生草本球根植物，又名強(qiáng)蜀、山丹、中逢花、百合蒜等[1-2]。百合不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，還具有多種功能性成分，如總磷脂、多糖、粗纖維、酚類等[3-5]，是國(guó)家衛(wèi)計(jì)委公布的首批藥食同源植物之一。研究表明，百合具有抗癌、抗氧化、抗過(guò)敏、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、止咳平喘等保健功能[6-8]。而蜂蜜含有大量的糖類、維生素、礦物質(zhì)和氨基酸[9-10]，其單糖可被人體直接吸收，對(duì)婦女、幼兒，特別是老人具有良好的保健作用。研究表明，蜂蜜可改善血液成分，促進(jìn)心腦血管功能；促使肝細(xì)胞再生，抑制脂肪肝的形成；增強(qiáng)抵抗力，促進(jìn)睡眠和胃腸蠕動(dòng)等[11-12]。

傳統(tǒng)食醋是以高粱、大米等富含淀粉的作物為原料，在微生物作用下，經(jīng)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵及后熟、陳釀等工藝釀造而成的一種酸性調(diào)味品。除了含有大量的醋酸外，醋還含有鈣、鐵、乳酸、甘油及脂肪酸等物質(zhì)，研究表明經(jīng)常食用醋可促進(jìn)脂肪和糖類物質(zhì)的代謝，利尿通便，還可降低血壓和血清膽固醇[13]。但是隨著生活水平的提高，人們對(duì)醋的需求不再局限于傳統(tǒng)風(fēng)味，而是有了更多特色風(fēng)味的需求[14-16]。目前百合類醋只有百合與苦蕎、南瓜及杜仲發(fā)酵釀造的醋[17-19]，尚未見(jiàn)百合與蜂蜜共同發(fā)酵釀造醋的研究。因此本研究以鮮百合、蜂蜜為原料，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了百合蜂蜜復(fù)合醋醋酸發(fā)酵工藝參數(shù)，為百合蜂蜜復(fù)合醋的生產(chǎn)提供理論支持和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

蘭州百合，2019年11月采摘，蘭州市售。

醋酸菌C1，實(shí)驗(yàn)室分離；蜂蜜，市售；食品級(jí)α-淀粉酶（2 000 U/g），邢臺(tái)萬(wàn)達(dá)生物工程有限公司；食品級(jí)糖化酶（50 000 U/g），江蘇博立生物制品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800PC紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Mettler Toledo AL204分析天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；搖床，中科院武漢科學(xué)儀器廠；離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；恒溫水浴箱，北京醫(yī)療設(shè)備廠；磁力攪拌器，上海南匯電訊器材廠。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

百合預(yù)處理→混合蜂蜜→配料→滅菌→接種→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→滅菌→陳釀→澄清→灌裝→成品

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）百合預(yù)處理

鮮百合清洗去除泥沙等雜物，并去除腐爛、褐變的百合，打漿后待用（打漿時(shí)加入1‰抗壞血酸，防止褐變）。由于鮮百合含有大量的淀粉，容易產(chǎn)生沉淀且會(huì)影響飲料的口感，因此，必須將之降解，本試驗(yàn)選用反應(yīng)條件較為溫和的生物酶降解工藝，盡可能地保留百合原有的營(yíng)養(yǎng)成分及自然風(fēng)味[20]。采用先液化后糖化的工藝，液化溫度70～88 ℃，α-淀粉酶添加量為12 U/g；糖化溫度58～62 ℃，糖化酶添加量為200 U/g。

（2）酒精發(fā)酵

將蜂蜜、百合處理液及水按照一定的比例混合，加入活化后的酵母（添加量1%），發(fā)酵溫度為28～38 ℃，發(fā)酵一段時(shí)間后得到發(fā)酵底液；酒精發(fā)酵初期酵母菌大量繁殖，需要通入少量空氣，中后期進(jìn)行酒精發(fā)酵，為無(wú)氧發(fā)酵，并在發(fā)酵過(guò)程中控制發(fā)酵溫度及排除所產(chǎn)生的CO2氣體[21-22]。

（3）醋酸發(fā)酵及陳釀

酒精發(fā)酵結(jié)束后，將醋酸菌種擴(kuò)大培養(yǎng)液接入酒精發(fā)酵醪中發(fā)酵，發(fā)酵溫度28～38 ℃，發(fā)酵一段時(shí)間后滅菌，于4～10 ℃條件下陳釀30 d[23-25]。

（4）澄清

加入1‰皂土于4 ℃澄清12 h，上清液進(jìn)行滅菌。皂土在使用前必須活化，活化方法為皂土與水按照質(zhì)量比1∶10混勻，混勻后靜置24～48 h[26-27]。

1.3.3 百合和蜂蜜配比的確定

將百合和蜂蜜分別按照比例2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4添加，按照1.3.1的工藝流程釀造百合蜂蜜復(fù)合醋，以感官評(píng)分（外觀20%、香氣20%、口味40%和風(fēng)格20%）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由25名專業(yè)人士對(duì)百合蜂蜜醋的感觀進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.4 百合蜂蜜復(fù)合醋醋酸發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

分別考察初始酒精度、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響，初始酒精度設(shè)置為4°、6°、8°、10°、12°；接種量設(shè)置為3%、4%、5%、6%、7%；發(fā)酵溫度設(shè)置為28、30、32、34、36 ℃；發(fā)酵時(shí)間為4、6、8、10、12 d。

1.3.5 百合蜂蜜復(fù)合醋發(fā)酵工藝優(yōu)化

為了更好地確定百合蜂蜜復(fù)合醋的最佳工藝參數(shù)，運(yùn)用BOX-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選取初始酒精度（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）4個(gè)重要工藝參數(shù)為因素，以發(fā)酵結(jié)束后醋的酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化百合蜂蜜復(fù)合醋醋酸發(fā)酵工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 BOX-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of BOX-Behnken experiments design

1.4 酸度的測(cè)定方法

酸度的測(cè)定參照GB 2719—2018的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行均差等數(shù)據(jù)的分析，采用Office 2010軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合和蜂蜜配比的確定

圖1顯示了百合和蜂蜜的添加配比，由圖1可知，當(dāng)百合和蜂蜜配比為1∶3時(shí)，百合蜂蜜復(fù)合醋的感官評(píng)分最高，因此，百合和蜂蜜配比確定為1∶3。

圖1 百合和蜂蜜添加配比的確定Fig.1 Determination of additive ratio of Lilium and honey

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 初始酒精度對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響

不同初始酒精度對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著初始酒精度的升高，酸度呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)初始酒精度為8°時(shí)，酸度最高，可達(dá)4.11%。分析認(rèn)為初始酒精度低，醋酸菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的醋酸含量低，而酒精度偏高則抑制了醋酸菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致所產(chǎn)百合蜂蜜復(fù)合醋的酸度降低。因此，選擇初始酒精度為8°進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 初始酒精度對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響Fig.2 Effect of different alcohol of Lilium and honey compound vinegar

2.2.2 接種量對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響

不同接種量對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響見(jiàn)圖3。由圖可知，隨著接種量的升高，其酸度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。適當(dāng)增加醋酸菌接種量會(huì)縮短發(fā)酵周期，但是接種量過(guò)大會(huì)消耗發(fā)酵液中的酒精，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)多的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致其細(xì)胞老化、自溶等，從而影響復(fù)合醋的產(chǎn)量。當(dāng)接種量為6%時(shí)，復(fù)合醋的酸度最高。因此，接種量選擇6%進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 接種量對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響Fig.3 Effect of different inoculum size of Lilium and honey compound vinegar

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響

發(fā)酵溫度對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響見(jiàn)圖4（見(jiàn)下頁(yè)）。由圖可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，百合蜂蜜復(fù)合醋的酸度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí)，酸度最高。發(fā)酵溫度過(guò)低，不利于醋酸菌的生長(zhǎng)，而溫度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致部分乙酸被氧化，加快醋酸菌的老化，造成百合蜂蜜復(fù)合醋的酸度低。因此選擇發(fā)酵溫度為34 ℃進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperature of Lilium and honey compound vinegar

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著醋酸發(fā)酵時(shí)間的增加，其酸度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵10 d時(shí)，復(fù)合醋的感觀評(píng)分最高。隨著發(fā)酵的進(jìn)行酸度逐漸增加，但由于過(guò)度發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致部分乙酸被氧化。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為10 d進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋酸度的影響Fig.5 Effect of different fermentation time of Lilium and honey compound vinegar

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及模型的建立

本研究根據(jù)百合蜂蜜復(fù)合醋的發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果，最后選定初始酒精度、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間為優(yōu)化試驗(yàn)的四個(gè)因素，以酸度為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，其二次多元回歸模型為：R=5.32+0.072A+0.053B+0.38C+0.12D+0.013AB-0.020AC+0.032AD-0.052BC+0.020BD-5.000×10-3CD-0.45A2-0.49B2-0.77C2-0.69D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The result and condition of response surface experiment

由回歸模型的方差分析（表3）可以看出：模型差異極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)差異不顯著（P=0.054 0＞0.05），決定系數(shù)（R2）為0.984 4，校正系數(shù)（AdjR2）為0.968 9，該模型可以涵蓋該模型91.49%響應(yīng)值的變化，因而擬合程度良好，試驗(yàn)誤差?。磺以摶貧w模型一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)中的A、C、D、BC、A2、B2、C2、D2均表現(xiàn)出顯著水平；各因素對(duì)產(chǎn)品酸度的影響依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞初始酒精度＞接種量。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

圖6 初始酒精度、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋的影響Fig.6 Interaction of alcohol,inoculum size,fermentation temperature and fermentation time on Lilium and honey compound vinegar

初始酒精度（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）間的交互作用對(duì)產(chǎn)品總酸的影響如圖6所示。由圖可知，當(dāng)初始酒精度一定時(shí)，隨著接種量的增大，百合蜂蜜復(fù)合醋的酸度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。當(dāng)接種量恒定時(shí)，隨著初始酒精度的增大，復(fù)合醋酸度呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，其它兩因素間的交互作用也均呈現(xiàn)先增大后緩慢降低的趨勢(shì)。

2.4 響應(yīng)面工藝的驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)分析，得出百合蜂蜜復(fù)合醋的最佳工藝條件為初始酒精度8.16°，接種量6.04%，發(fā)酵溫度34.5 ℃，發(fā)酵時(shí)間10.09 d，在此條件下預(yù)測(cè)發(fā)酵得到的百合蜂蜜復(fù)合醋酸度為5.38%。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，將其修正為初始酒精度8.2°，接種量6%，發(fā)酵溫度34.5 ℃，發(fā)酵時(shí)間10 d，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到百合蜂蜜復(fù)合醋的酸度為5.42%，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為0.74%，其參數(shù)具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 小結(jié)

對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋的發(fā)酵工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，確定了最佳工藝條件為初始酒精度8.2°，接種量6%，發(fā)酵溫度34.5 ℃，發(fā)酵時(shí)間10 d，在此條件下百合蜂蜜醋的酸度為5.42%，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為0.74%。各因素對(duì)百合蜂蜜復(fù)合醋的影響大小依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞初始酒精度＞接種量。通過(guò)對(duì)回歸模型的可靠性分析，得知該回歸模型極顯著，擬合度較好。因此，本試驗(yàn)得到的參數(shù)具有一定的實(shí)用價(jià)值，所釀制的百合蜂蜜復(fù)合醋呈淡琥珀色，無(wú)沉淀物，酸味柔和，有醋香味及百合和蜂蜜的風(fēng)味。