朱利芹 馮瑩 曹惠芳 杜楠

(1.上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院呼吸內科，上海 200040；2.淮安市第一人民醫(yī)院腫瘤內科，江蘇 淮安 223300)

結直腸癌屬于臨床常見的胃腸道惡性腫瘤，早期臨床表現(xiàn)不典型，伴隨腫瘤組織不斷增大而出現(xiàn)排便習慣改變、腹瀉、便血、便秘等臨床癥狀，在疾病晚期病患可出現(xiàn)貧血以及體質量下降等全身性臨床癥狀，對病患生命安全產(chǎn)生嚴重威脅[1]。有報道[2]指出，miRNA異常表達在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中具有重要意義，其中miRNA具備抑癌基因或者癌基因的能力，受到臨床重點關注。MicroRNA(miRNAs微小PaqA)是一種單鏈非編碼RNA分子，廣泛存在于人類、動物、植物的細胞中，其長度約19～24 nt，通過與靶基因序列特異性相互作用在轉錄水平調節(jié)基因表達，腫瘤的發(fā)生、進展有關，作為一類新型基因調節(jié)劑與結直腸癌的關系相當密切[3]。X射線修復交叉補充因子6(XRCC6)抑制吉西他濱誘導的DNA損傷和多種癌細胞凋亡，參與DNA雙鏈斷裂修復和重組[4]。MiR-1207-3p通過纖維連接蛋白調節(jié)前列腺癌中的雄激素受體，但miR-1207-3p在結直腸癌中的作用未見報道。本研究探討miR-1207-3p靶向XRCC6對結直腸癌細胞HT-29凋亡的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 上?？道噬锟萍加邢薰咎峁┑膍iRNA cDNA第一鏈合成試劑盒；哈爾濱?；锟萍加邢薰咎峁┑膍iR-1207-3p SYBRGreen miRNA實時熒光定量PCR試劑盒；生工生物工程(上海)股份有限公司提供的miR-1207-3p mimics和miR-1207-3p inhibitor；齊一生物科技(上海)有限公司提供的Luciferase熒光素酶報告檢測試劑盒；漢恒生物科技(上海)有限公司提供的LipoFiter3轉染試劑；Sigma公司提供的蛋白裂解液；北京索萊寶科技有限公司提供的青鏈霉素混合液；北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供的2×SDS蛋白電泳上樣緩沖液；美國Bimake公司提供的蛋白酶抑制劑Cocktail；美國Hyclone公司提供的RPMI-1640培養(yǎng)基；英國Abcam公司提供的XRCC6，Cleaved-Casp3，Cleaved-Casp9，TUBULIN抗體；美國Gbico公司提供的胎牛血清；中科院上海生命科研所提供的HT-29細胞；生工生物工程(上海)股份有限公司提供的PBS。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉染 結直腸癌細胞HT-29維持在含有100 μg/mL鏈霉素、10%熱滅活的胎牛血清以及100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為潮濕37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。對結直腸癌細胞HT-29進行LipoFiter3轉染試劑轉染，將脂質體與miR-1207-3p mimics或inhibitor相混合20 min后，滴入HT-29細胞。

1.2.2Western blot 進行10%SDS-PAGE的電泳，轉移到PVDF膜上，隨后將PVDF膜進行封閉1 h，封閉環(huán)境為0.01%Tween-20和5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水。然后在4℃下與目的蛋白的抗體溫育過夜，使用ECL Plus Western印跡檢測系統(tǒng)對特定蛋白質進行觀察，將PVDF膜在室溫下與綴合有HRP的相應二抗孵育1 h。

1.2.3qRT-PCR 用細胞刮將結直腸癌細胞HT-29刮入EP管中，用PBS洗3次，對MCF7的miRNA進行miRNA快速提取，將純化好的總miRNA進行逆轉錄。用miR-1207-3p的正向和反向引物進行qRT-PCR。MiR-1207-3p上游引物序列為5′-TCAGCTGGCCCTCATTTC-3′，內參U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-GAAATGAGGGCCAGCTGA-3′，內參U6下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。1 μL 10×miScript通用引物溶液，1μL 10×miScript配對引物溶液，最后用9.5 μL DEPC水補足25 μL混合液。將7500Real-Time PCR儀(Biosystems)設置擴增條件：95℃×10 min，然后將95℃×15 s、56℃×30 s，72℃×35 s過程進行40個循環(huán)，最終將產(chǎn)物放置于-20℃保存。所有實驗重復3遍。

1.2.4Annexin V染色 將結直腸癌細胞HT-29置于37℃5%CO2和1%O2的缺氧室中靜置16～18 h，隨后在低氧或含氧量正常的條件下培養(yǎng)結直腸癌細胞HT-29 2 h，在指定的氧條件下用1 μm阿糖胞苷處理16～18 h，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，使用Annexin V-FITC-A進行染色。

2 結 果

2.1MiR-1207-3p與XRCC6的相關性 采用TargetScan生物軟件分析后，發(fā)現(xiàn)miR-1207-3p處于16～22的位置與XRCC6的3′端非編碼區(qū)有1處高度匹配，見圖1。將 XRCC6的3′端非編碼區(qū)做 UC 非匹配突變，并選取一種野生型的XRCC6作為對照，通過luciferase assay，MT-XRCC6 3′UTR報告活性降低(t=14.730，P<0.001)。見圖2。

圖1 TargetScan生物軟件在線分析miR-1207-3p與XRCC6相關性

圖2 利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-1207-3p靶向XRCC6基因

2.2過表達miR-1207-3p后XRCC6蛋白和HT-29細胞凋亡標志蛋白的表達量 為進一步證實miR-1207-3p靶向XRCC6與HT-29細胞凋亡的相關性，對miR-1207-3p的相對表達量進行qRT-PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)在轉染miR-1207-3p mimics進HT-29細胞后，其相對表達量顯著增加(t=17.730，P<0.001)；XRCC6 的表達量采用Western Blot 檢測，結果發(fā)現(xiàn)細胞凋亡標志蛋白 Cleaved-Casp3、Cleaved-Casp9的表達量上升，XRCC6 的表達量下降，HT-29 細胞凋亡水平上升(t=34.180，P<0.001)。見圖3～圖5。

圖3 轉染miR-1207-3p mimcs后miR-1207-3p的表達水平

圖4 過表達miR-1207-3p時XRCC6和凋亡相關蛋白表達水平

圖5 過表達 miR-1207-3p 時 HT-29 細胞凋亡水平

3 討 論

結直腸癌作為臨床常見的惡性腫瘤，主要發(fā)生在患者腸黏膜上皮細胞，受到遺傳或者環(huán)境因素影響后產(chǎn)生惡性變化，不僅具有較高的患病率及復發(fā)率，同時癌細胞出現(xiàn)轉移的風險較大，不僅對患者消化系統(tǒng)造成一定傷害，同時可能牽連患者肺臟、骨骼、淋巴與肝臟受損，直接危及生命安全[5]。

miRNA屬于微小RNA分子，可在細胞內發(fā)揮多種調節(jié)作用。由于miRNA具有較高的特異性、保守性以及穩(wěn)定性等特點，因此在研究疾病發(fā)生、發(fā)展以及預后方面具有積極意義[6]。在人體內，它通過與靶基因mRNA分子3′端非編碼區(qū)結合，抑制靶基因的翻譯，負調控靶基因的蛋白水平[7]。研究[8]表明它在胚胎發(fā)育、細胞分化、血管形成、腫瘤發(fā)生等許多重要病理生理過程中發(fā)揮調控作用。在腫瘤方面，研究[9]發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤的發(fā)生、轉移微環(huán)境形成、浸潤甚至治療耐受等有密切關系。近年來，研究[10]表明miRNA與腫瘤發(fā)生關系密切，由于相關的靶基因對腫瘤的作用不同，不同miRNA在腫瘤中表達情況也存在差異，因而可以根據(jù)這種表達差異來判斷miRNA對腫瘤的調控作用。

本研究通過TargetScan分析，發(fā)現(xiàn)MiR-1207-3p由位于8q24易感基因位點的PVT1非蛋白編碼基因編碼，能夠靶向結合XRCC6的3′端非編碼區(qū)的16～22的區(qū)域。研究還發(fā)現(xiàn)，結直腸癌細胞 HT-29 凋亡水平與miR-1207-3p相關，miR-1207-3p過表達，HT-29凋亡水平上升，細胞凋亡標志蛋白CleavedCasp3、Cleaved-Casp9的表達量顯著上升，XRCC6的表達量下降，分析原因：miR-1207-3p所致的XRCC6表達量下降導致游離Bax的增多，造成XRCC6-Bax復合體的減少，導致Bax進入線粒體引發(fā)了細胞凋亡，XRCC6 通過C-末端接頭結構域中賴氨酸殘基的乙?；M行轉錄后調節(jié)，導致Bax的釋放，XRCC6的乙?；芙M蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙?；傅恼{節(jié)，兩組相反的酶主要參與染色質重塑。

綜上所述，miR-1207-3p可通過抑制XRCC6表達量來促進結直腸癌細胞HT-29的凋亡。