鄭立肯，葉世蕓，殷少文，王維

(1.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴陽 550002；2.貴陽市第三人民醫(yī)院科教科，貴陽 550006)

苦參類生物堿(Matrine-typealkaloids)常由豆科槐屬(Sophor)植物苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)、苦參(Sophoraflavescens)、山豆根(EuchrestaJ.Benn)的干燥根、植株、果實經(jīng)有機溶劑提取制得[1]。目前已提取得到苦參類生物堿中苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿、氧化槐定堿和槐胺堿等，進行過較多的生物活性研究[2]，其具有抗菌、抗炎、抗病毒及真菌作用，且對機體免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用[3-7]。苦參膜是原國家食品藥品監(jiān)督管理局于2009年批準以苦參總堿為原料的婦科膜劑，由藥效物質(zhì)群苦參總堿與水溶性輔料聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)制成。功能主治抗菌消炎，常用于宮頸柱狀上皮異位，赤白帶下，滴蟲性陰道炎及陰道真菌性感染等婦科疾病?？鄥⒛べ|(zhì)柔軟，體積小，使用時無異物感，制劑與正常陰道腔內(nèi)弱酸性pH值相似，減少對女性陰道腔的刺激，抑菌同時不破壞陰道正常菌群，使患者在治療過程中感受更舒適。苦參膜藥效物質(zhì)明確，作用可靠，因其膜類制劑可作為其他藥物載體的優(yōu)勢，臨床常將苦參膜與其他藥物或與婦科手術聯(lián)合治療女性生殖道疾病，較單獨用藥有效率更高，1年內(nèi)復發(fā)率顯著降低[8-12]。

苦參膜生產(chǎn)需求日益增長，為擴大生產(chǎn)，對現(xiàn)有苦參膜生產(chǎn)工藝進行規(guī)模化，在不改變膜制備原理的前提下，對原手動設備進行自動化升級改造，篩選出一套高效節(jié)能生產(chǎn)中藥膜劑的關鍵技術及設備，解決目前中藥膜劑設備自動化、規(guī)?；碾y題。將原料的攪拌配料改造設計為真空乳化配料，手動水浴成膜改造為連續(xù)涂布成膜，手動刀切分膜改造為貼合分條機分切，手工包裝改造為四邊封自動包裝機包裝。但這一過程是否會引起藥品質(zhì)量的變化尚未有研究，且目前質(zhì)量標準只對苦參膜中氧化苦參堿和苦參堿進行含量測定，忽略藥效物質(zhì)槐果堿與槐定堿含量變化，不能全面反映苦參膜質(zhì)量是否穩(wěn)定。由于產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性、均一性是保證藥品療效穩(wěn)定的前提，因此本實驗建立可檢測苦參膜中苦參總堿多成分含量的高效液相色譜(HPLC)法苦參膜指紋圖譜方法，旨在為苦參膜的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1260 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XS205電子天平(瑞士METTLER公司，感量：0.01 mg)；JP2-160電子天平(日本CHYOBANCE公司，感量：0.1 mg)；Welch Ultimate XB-NH2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，上海Welch公司；YQ-1000A超聲清洗儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)。

1.2試劑與藥品 氧化苦參堿對照品(批號：170428，C15H24N2O2含量≥98%)，苦參堿對照品(批號：170512，C15H24N2O含量≥98%)，槐果堿對照品(批號：161113，C15H22N2O含量≥98%)，槐定堿對照品(批號：170425，含量≥98%)，均購于北京世紀奧科生物技術有限公司；三氯甲烷(分析純，上海試劑四赫維化工有限公司)；乙腈(色譜純)、無水乙醇(分析純)、氨水(分析純)、無水乙醇(分析純)，均購于天津市科密歐化學試劑有限公司；磷酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠)；娃哈哈純凈水(娃哈哈飲料有限公司)；30批生產(chǎn)工藝設備變更前后產(chǎn)苦參膜批號見表1，均由貴州得軒堂護康藥業(yè)股份有限公司提供。

表1 生產(chǎn)工藝設備變更前后苦參膜批號

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱 Ultimate XB-NH2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-無水乙醇-3%磷酸(85：7.5：7.5)，柱溫35 ℃，流速1 mL·min-1，檢測波長220 nm，進樣量10 μL，理論板數(shù)以氧化苦參堿計不得小于3000，4個成分與其他組分之間的分離度均>1.5。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液制備 取氧化苦參堿、苦參堿、槐定堿、槐果堿對照品適量，精密稱定，用乙腈-無水乙醇(85：15)溶解定容。制得含氧化苦參堿3.98 mg·mL-1、苦參堿3.77 mg·mL-1、槐果堿3.61 mg·mL-1、槐定堿3.74 mg·mL-1的混合對照品溶液，搖勻，即得?？筛鶕?jù)實驗需求稀釋至各不同濃度。

2.2.2供試品溶液制備 取同一批次苦參膜6片，剪碎并混合均勻。精密稱定0.6 g，置具塞錐形瓶中，精密加入氨水0.5 mL與三氯甲烷25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，放置至室溫，三氯甲烷補足損失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，精密吸取5 mL，揮干溶劑，使用流動相溶解并移至25 mL量瓶中定容，搖勻，用孔徑0.45 μm濾膜濾過，備用。

2.3精密度實驗 取批號20161002苦參膜樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件測定，連續(xù)進樣 6次，以2號峰(苦參堿)與4號峰(氧化苦參堿)的保留時間和色譜峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各峰保留時間與峰面積RSD均<3.0%，表明該方法精密度良好。

2.4穩(wěn)定性實驗 取“2.3”項下同一供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件，分別在 0，2，4，8，16，20，24 h 時測定，記錄指紋圖譜，以2號峰(苦參堿)與4號峰(氧化苦參堿)的保留時間和色譜峰面積為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積。各峰保留時間與峰面積 RSD均<3.0%，表明苦參膜樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5重復性實驗 取同一批次苦參膜樣品6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，以2號峰(苦參堿)與4號峰(氧化苦參堿)的保留時間和色譜峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各峰保留時間與峰面積 RSD均<3.0%，結果表明該方法重復性良好。

2.6指紋圖譜的建立

2.6.130批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜指紋圖譜的建立及相似度評價 取30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜，分別按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，得到30批苦參膜指紋圖譜(圖1)，將得到的數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2012 A版進行分析，以S2為參照指紋圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，生成對照指紋圖譜，并對色譜峰進行指認。將30批苦參膜供試品色譜圖與對照指紋圖譜匹配，進行相似度評價，得到30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜指紋圖譜相似度在0.851～0.996，結果見表2。

圖1 30批苦參膜HPLC指紋圖譜

2.6.230批苦參膜共有峰的標定及指認 30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜共標定8個共有峰，設S2(20140102)為參照圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，生成對照指紋圖譜，并對色譜峰進行指認。其中3，4，7，8號峰分別與槐果堿，苦參堿，槐定堿，氧化苦參堿對照品保留時間一致，見圖2。

表2 30批苦參膜相似度評價結果

A.混合對照品；B.對照指紋圖譜；C.空白溶劑；3.槐果堿；4.苦參堿；7.槐定堿；8.氧化苦參堿。

2.730批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜指紋圖譜聚類分析 以10批樣品21個共有峰的相對峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0版軟件，以系統(tǒng)聚類法結合歐氏距離(d)為測度進行分析，結果見圖3。由圖3可知，d=25時，30批樣品可聚為2類，S26、S27、S28、S29、S30首先聚為一類，其余聚為一類；d=20時，后一類又可聚為2類，即S23、S24、S25聚為一類，其余聚為一類。

2.830批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜指紋圖譜主成分因子分析 采用SPSS 22.0版軟件對30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜的8個共有峰(變量)峰面積原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，以主成分的特征值及貢獻率為依據(jù)，進行主成分因子分析，計算相關系數(shù)矩陣，主成分特征值、累積貢獻率并計算主成分綜合得分，對30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜品質(zhì)進行評價。通過先驗檢驗得KMO值=0.621>0.6，Bartlett的球形檢驗P<0.05，證明數(shù)據(jù)存在關聯(lián)性，可進行因子分析。根據(jù)因子分析結果可得總方差解釋表，對各變量進行因子提取和因子旋轉的結果，結果見表3，碎石圖見圖4。

結合圖4，苦參膜主成分分析中前2個主成分的特征值較大(均>1) 且連線較陡峭，累積方差貢獻率82.125%(>60%)，認定提取前2個主成分進行分析較為合適，前2個主成分累計方差貢獻率為82.125%，前2個主成分可以反映整體指標82.125%的信息。其中提取主成分1的特征值為4.169，其貢獻率為52.113%；提取主成分2的特征值為2.401，貢獻率為30.012% 。

每個樣本都是由數(shù)個變量屬性特征構成，這些屬性特征之間的關系，可以利用載荷圖來對圖像特征進行描述，載荷的絕對值越大，對于主成分的影響就越大，而這種影響可以通過載荷所代表的點到原點之間的距離來衡量，見圖5。

進行正交旋轉，得到30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜各指標在2個主成分中的旋轉成分矩陣，見表4。第一主成分中的信息主要來自色譜峰3，4，6，7，8。其中3號峰為槐果堿，4號共有峰為苦參堿，7號共有峰為槐定堿，8號峰為氧化苦參堿，6號峰為未知峰。根據(jù)表4，5，以 Y1，Y2 代表2個主成分作為30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜成分所表達的信息，建立苦參膜品質(zhì)的評價模型，得出如下成分的線性關系表達式分別為Y1=-0.147F1-0.019F2+0.251F3+0.184F4+0.026F5-0.207F6+0.2F7-0.230F8，Y2=0.397F1+0.379F2-0.147F3+0.117F4+0.307F5+0.017F6+0.067F7+0.084F8。表達式中各變量不是原始變量，而是標準化變量。

將上述所得表達式，與所對應的2個主成分的方差貢獻率做內(nèi)積，得到苦參膜質(zhì)量綜合評價函數(shù)的表達式為Y綜合得分=(Y1×4.462 +Y2×2.108)÷82.125，根據(jù)以上表達式得到30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜得分值及排序，見表5。綜合得分越高表明對苦參膜樣品中有效成分的統(tǒng)計質(zhì)量越好[13-14]。

表3 兩個主成分因子的特征值和方差貢獻率

圖4 主成分因子碎石圖

圖5 共有峰指紋譜載荷

表4 旋轉成分矩陣

結果30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜綜合得分由高到低樣品編號分別為S26、S27、S30、S28、S29、S24、S25、S22、S6、S19、S23、S5、S4、S16、S1、S2、S3、S18、S7、S21、S9、S17、S13、S20、S15、S12、S11、S14、S10、S8，其中排名前5的編號所屬批次均為生產(chǎn)設備變更后未過期苦參膜，且綜合排名前8名亦為生產(chǎn)日期較近批號苦參膜。而其余設備變更前后苦參膜綜合排名未出現(xiàn)規(guī)律。

表5 30批樣品主成分因子得分及排序

在2個主成分中，F(xiàn)1是特征值較大的，信息量較全面的指標，其累積方差貢獻率達到55.711%，在主成分1中系數(shù)較大的為X3、X4、X6、X7、X8，表明峰3，4，6，7，8的量是影響30批苦參膜中苦參總堿量差異的主要成分，對照結果以表明其中3，4，7，8號峰分別為槐果堿、苦參堿、槐定堿與氧化苦參堿，6號峰為未知峰。欲探究以上5類成分是否為指標性成分，故量化5個峰峰面積，采用SPSS 22.0版進行系統(tǒng)聚類分析，采用組間聯(lián)結法，利用歐式距離(d)作為樣品的測度。聚類譜系圖見圖6。結果表明，d=25時，30批樣品可聚為2類，S26、S27、S28、S29、S30等未過期批號苦參膜首先聚為一類，其余聚為一類；經(jīng)主成分分析結果篩選出數(shù)據(jù)進行聚類分析與之前聚類結果基本一致，由此得出，通過多元統(tǒng)計分析可以初步篩選出苦參膜中苦參總堿差異的指標性成分[15]。

圖6 30批生產(chǎn)設備變更前后苦參膜進行主成分分析后的聚類樹狀圖

2.9苦參膜中4種指標成分含量測定

2.9.1線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液，制成9個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照“2.1”項色譜條件進行測定，并記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得標準曲線方程。4個成分的線性回歸方程見表6。

2.9.2精密度實驗 取批號20140703苦參膜樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣 6次，記錄峰面積。計算槐果堿、苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿峰面積 RSD分別為0.89%，0.65%，0.5%，0.8%，表明儀器精密度良好。

表6 4種成分標準曲線

2.9.3穩(wěn)定性實驗 取批號20130710苦參膜樣品，按照“2.1”項下色譜條件，分別在 0，2，4，8，16，20，24 h 時測定，記錄峰面積。計算槐果堿、苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿峰面積 RSD分別為0.95%，2.36%，1.18%，1.02%，表明供試品溶液在室溫放置 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9.4重復性實驗 取批號20141002苦參膜樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。計算槐果堿、苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿峰面積 RSD分別為1.11%，2.88%，0.39%，0.33%，結果表明該方法重復性良好。

2.9.5加樣回收率實驗 取同一批次苦參膜9份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，測得氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿、槐定堿的平均回收率為99.27%，99.26%，98.43%，101.24%，RSD為0.2%，0.9%，1.85%，2.2%，所以該測定方法可行。

2.9.6樣品測定 分別取30批苦參膜，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，計算樣品中槐果堿、苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿4個成分的量，結果見表7。

2.9.7兩獨立樣本T檢驗 采用SPSS 22.0版軟件對樣品進行獨立樣本T檢驗分析。由T檢驗結果可得，生產(chǎn)工藝變更前后指標成分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿含量均大于生產(chǎn)設備變更前。

3 討論

槐果堿也稱為13，14-脫二氫苦參堿，臨床與實驗證明其具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗肝纖維化、抗心律失常等作用[16]，同時槐果堿可抑制氧化應激、炎癥和誘導細胞凋亡等途徑減輕機體損傷[17]。張劍美等[18]研究表明槐果堿抗炎機制與其抑制TLR4/MAPK、JAK2/STAT3信號通路活化密切相關，付聰敏等[19]發(fā)現(xiàn)槐果堿可明顯抑制COX-2/PGE2信號通路，降低MDA、PGE2和COX-2 mRNA及蛋白的水平發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛與抗氧化應激作用?；钚猿煞只倍▔A亦具有顯著鎮(zhèn)痛作用[20]，且對各種急慢性炎癥(包括免疫性和非免疫性炎癥)均有抗炎作用，對體液免疫和細胞免疫都有抑制作用[21]，二者均為目前研究較多的苦參類生物堿。本實驗建立婦科膜劑苦參膜HPLC指紋圖譜，等度洗脫操作簡單，可同時測定4類指標性活性物質(zhì)，為產(chǎn)品后期藥效研究和臨床擴大應用提供依據(jù)。過去苦參膜質(zhì)量標準只對其中氧化苦參堿和苦參堿進行含量檢測，不能全面反映苦參膜質(zhì)量情況是否穩(wěn)定，并忽略藥效物質(zhì)槐果堿與槐定堿含量變化。同時主成分因子分析結果表明影響產(chǎn)品綜合得分的主要因子為3號峰槐果堿、4號峰苦參堿、7號峰槐定堿、8號峰氧化苦參堿與6號未知峰，通過二次聚類分析，結果與之前聚類結果相同，故可將上述5類物質(zhì)可作為苦參膜質(zhì)量檢測新指標性物質(zhì)，同之前苦參膜質(zhì)量標準中僅對苦參堿及氧化苦參堿定量檢測提高了標準，更全面保證產(chǎn)品質(zhì)量。

表7 30批苦參膜含量測定結果