孫堯，傅源源，周蘇明，羅璨

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210009；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210029 )

重癥肺炎是入住重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)及老年患者死亡最重要原因之一，病死率30%～50%[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是引起醫(yī)院獲得性肺炎(hospital acquired pneumonia，HAP)的主要病原菌之一，由于耐藥菌株不斷產(chǎn)生，臨床上常用萬古霉素進(jìn)行治療[2-3]。近年來，萬古霉素治療MRSA引起的重癥肺炎等疾病的有效性受到質(zhì)疑。抗菌藥物能達(dá)到感染組織部位的實(shí)際濃度，抗菌清除效果及臨床療效都有著決定性的關(guān)系。對于肺部感染，抗菌藥物在肺泡上皮襯液(epithelial lining fluid，ELF)中是否能夠達(dá)到有效的濃度，影響著其實(shí)際的臨床療效及患者的病情轉(zhuǎn)歸。越來越多研究開始關(guān)注治療過程中靶組織的藥物濃度，并嘗試通過測定感染部位的實(shí)際藥物濃度，優(yōu)化抗菌藥物的給藥方案、預(yù)測臨床療效，以實(shí)現(xiàn)個體化的精準(zhǔn)藥物治療，最終達(dá)到精準(zhǔn)醫(yī)療的目的。筆者在本研究選取入住ICU診斷為肺部感染、采用機(jī)械通氣同時使用萬古霉素治療的重癥患者，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法，測定患者用藥后支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中藥物濃度，根據(jù)RENNARD等[4]所建立的尿素稀釋法，計算ELF中實(shí)際藥物濃度，并與同期血藥濃度進(jìn)行對比，以探究萬古霉素在肺部組織的滲透性，為臨床上使用萬古霉素進(jìn)行肺部感染治療的給藥方案調(diào)整提供支持依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2016年5月—2017年1月，入住南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年ICU患者?；颊咝璺纤腥脒x標(biāo)準(zhǔn)，并且不符合任何一條排除標(biāo)準(zhǔn)。入選標(biāo)準(zhǔn)：①確診肺部感染；②如培養(yǎng)出敏感菌或經(jīng)驗(yàn)性治療需要使用萬古霉素；③急性生理及慢性健康 (APACHE II)評分>15分；④氣管插管或氣管切開，使用呼吸機(jī)進(jìn)行輔助呼吸；⑤需要進(jìn)行支氣管鏡檢、肺泡灌洗或相應(yīng)治療；⑥病程中有明確的病原分離及藥敏結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲；②急性或慢性腎衰竭，肌酐清除率(ClCr)<40 mL·min-1；③用藥期間進(jìn)行血漿置換或體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ECMO)或持續(xù)性腎臟替代治療(continuous renal replacement therapy，CRRT)患者；④孕婦或正在哺乳的婦女、燒傷以及囊性纖維病患者；⑤由于治療無效或發(fā)生嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)導(dǎo)致中途停藥的患者；⑥癲或患有精神系統(tǒng)疾病的患者；⑦對萬古霉素或其他糖肽類藥物具有過敏史的患者；⑧獲得性人免疫缺陷病毒(HIV)感染或有其他嚴(yán)重傳染性疾病的患者。

1.2治療方法 治療藥物：注射用鹽酸萬古霉素(商品名：穩(wěn)可信，Eli Lilly & Co，注冊證號：H20030375，規(guī)格：每瓶500 mg)。給藥方法：萬古霉素0.5 g，溶于0.9%氯化鈉注射液100 mL，q8h，所有患者均采用自動輸液泵進(jìn)行給藥，給藥維持時間為1 h持續(xù)泵入，給藥前對輸液泵進(jìn)行校準(zhǔn)以確保所有藥液在1 h內(nèi)準(zhǔn)確輸注完畢。同時記錄患者用藥時間，給藥開始以及結(jié)束時間，所用萬古霉素的產(chǎn)品批號。

1.3樣本及患者信息采集 樣本采集：選取符合入選標(biāo)準(zhǔn)患者，于使用萬古霉素第3天，不同患者分別于一個給藥間隔內(nèi)某個時間點(diǎn)(給藥開始后1，1.5，2.5，4.5，7.5 h)進(jìn)行支氣管肺泡灌洗及血樣采集。灌洗操作參考THOMAS等[5]方法：將纖維支氣管鏡從氣管插管患者的插管接口處進(jìn)入，下至右肺中葉楔段，局部給予1%利多卡因10 mL麻醉，將無菌0.9%氯化鈉溶液200 mL分4份，每份50 mL，從纖維支氣管鏡上端注入，立即(30 s內(nèi))抽吸，回收肺泡灌洗液于痰液收集器中，并立即置于冰上。首次抽吸出50 mL回收液丟棄，因其中含有臨近氣道的細(xì)胞、痰液及分泌物等，收集剩下3次回收的灌洗液，合并至同一容器，檢測萬古霉素和尿素的濃度。支氣管肺泡灌洗操作的同時，抽取靜脈血2 mL，置于黃色促凝采血管中，檢測血中萬古霉素和尿素的濃度。

患者信息采集：分別記錄患者的姓名、性別、年齡、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、肝腎功能、APACHE II 評分、臨床肺部感染(CPIS評分)、入院及出院診斷等一般人口學(xué)資料。并記錄患者合并的基礎(chǔ)疾病、合并用藥、用藥時間、住院時間等。記錄患者除肺部感染之外有無合并其他感染、急慢性肝腎功能衰竭等。記錄有無藥物不良反應(yīng)發(fā)生、并統(tǒng)計用藥前后患者的白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞百分比(N %)、C 反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)等感染指標(biāo)，對用藥期間所做的細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行記錄。

1.4濃度測定及計算方法

1.4.1萬古霉素在血漿和肺泡灌洗液中濃度測定 采用LC-MS/MS法進(jìn)行檢測，采用Thermo Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm，3 μm)色譜柱，流動相為甲醇-水(含0.1%甲酸)進(jìn)行梯度洗脫，流速：300 μL·min-1，柱溫：25 ℃，保留時間：6.5 min；質(zhì)譜檢測離子源為ESI+電噴霧，檢測方法：正離子模式，掃描方法：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)，離子通道設(shè)定為萬古霉素m/z725.5→144.1，甲氨蝶呤(MTX，內(nèi)標(biāo))m/z455.2→308.2，毛細(xì)管電壓：4000 V，氣流溫度：350 ℃，氣流流速：9 L·min-1，電噴霧壓力：35psi[5]。

1.4.2尿素在血漿和肺泡灌洗液中濃度測定 尿素的測定參考文獻(xiàn)[6-7]方法，使用尿素測定試劑盒，利用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法[8]，尿素在脲酶的作用下水解產(chǎn)生氨離子和二氧化碳，氨離子在堿性介質(zhì)中與酚顯色劑生成藍(lán)色的物質(zhì)，該物質(zhì)的生成量與尿素含量成正比，在波長640 nm比色測定。

2.4.3萬古霉素在ELF中濃度計算 根據(jù)RENNARD等[4]所建立方法，通過纖維支氣管鏡進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，所獲得的肺泡灌洗液實(shí)際上是0.9%氯化鈉溶液稀釋的ELF。而尿素作為一種非極性的小分子，可以自由通過肺泡壁，由此認(rèn)為尿素在血液和ELF中濃度是相似的，那么就可以通過測定血中的尿素濃度，以及BALF中尿素濃度，以此作為稀釋倍數(shù)，計算ELF中實(shí)際的藥物濃度。

VELF=VBALF×[U]BALF/[U]ELF(1)

其中VELF為ELF的體積，VBALF為BALF的體積，[U]BALF為BALF中尿素濃度，[U]ELF為ELF中尿素濃度。

ELF中藥物濃度([D]ELF)計算如下：

[D]ELF=[D]BALF×(VBALF/VELF) (2)

其中，[D]BALF是BALF中藥物濃度，將(1)代入(2)可得：[D]ELF=[D]BALF×([U]ELF/[U]BALF)。因此，測定肺泡灌洗時血液中和回收BALF中尿素濃度，以及BALF中藥物濃度即可根據(jù)尿素稀釋倍比關(guān)系計算ELF中藥物的實(shí)際濃度。

1.5滲透性計算 萬古霉素對肺組織的滲透性，以藥物在ELF中濃度與血液中藥物濃度比值表示。

2 結(jié)果

2.1患者基本信息 本研究共收集符合入選標(biāo)準(zhǔn)患者19例，剔除患者3例，其中1例為使用萬古霉素<3 d即停藥換用其他抗菌藥物，1例家屬拒絕簽訂知情同意書，1例腎功能不全(ClCr=32 mL·min-1)。最終收集符合納入條件患者16例。所有患者均接受萬古霉素0.5 g，q8h的方法給藥。入組患者平均年齡(60.94±15.95)歲，平均體質(zhì)量(71.77±7.59)kg，平均BMI偏高，為(25.20±3.11) kg·(m2)-1。診斷均為肺部感染，部分患者合并血流感染或腹腔感染等。APACHE Ⅱ評分平均為(30.31±4.47)分。納入的16例患者中，用藥前腎功能正常10例，其中ClCr>150 mL·min-1的4例，腎功能受損6例。住院期間死亡2例，主要死亡原因?yàn)槎嗥鞴俟δ苷系K綜合征。所有患者入科最初24 h的人口統(tǒng)計學(xué)資料及臨床資料見表1。

2.2臨床感染相關(guān)指標(biāo) 16例患者用藥前后感染指標(biāo)見表2。用藥后患者感染指標(biāo)均有所下降，結(jié)果表明，白細(xì)胞計數(shù)和PCT的下降差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3微生物學(xué)結(jié)果 入組患者用藥期間細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果見表3。培養(yǎng)來源均為痰液或肺泡灌洗液，標(biāo)本采集方式為使用吸痰管經(jīng)氣道吸引，或使用纖維支氣管鏡經(jīng)肺泡灌洗收集，標(biāo)本采集時間為萬古霉素使用后1～3 d內(nèi)，共檢出菌株43株，其中革蘭陰性菌為25株，占58.1%。鮑曼不動桿菌為最常見的菌株，占18.6%。其次為肺炎克雷伯菌(14.1%)、金黃色葡萄球菌(11.6%)和銅綠假單胞菌(11.6%)。所有檢出菌株中，對萬古霉素敏感的菌株13株(13例患者)，其中金黃色葡萄球菌5株，凝固酶陰性葡萄球菌3株(未行菌種鑒定)，頭狀葡萄球菌2株，及人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、伊麗莎白金菌各1株(納入其他類)。有3例患者無病原學(xué)結(jié)果，為經(jīng)驗(yàn)性使用萬古霉素進(jìn)行治療。

2.4藥物在肺組織的滲透性結(jié)果 支氣管肺泡灌洗的樣本采集結(jié)果及藥物濃度測定結(jié)果見表4。灌洗時回收灌洗液體積平均為58.25 mL，回收率27%～46%。

表1 16例患者基本資料

表2 16例患者用藥前后感染指標(biāo)變化

表3 微生物學(xué)結(jié)果

肺泡灌洗的時間點(diǎn)分布在整個給藥間隔內(nèi)，其中給藥開始后1 h采樣2例，1.5 h采樣4例，2.5 h采樣4例，4.5 h采樣4例，7.5 h采樣2例。不同時間點(diǎn)灌洗液濃度及灌洗液藥物濃度-時間曲線見圖1。灌洗液中萬古霉素濃度43.86～359.16 ng·mL-1，其濃度變化趨勢與血藥濃度變化趨勢，經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，P=0.001(小于0.05)，變化趨勢具有相關(guān)性。尿素在灌洗液中的稀釋倍數(shù)約37.34倍，利用Renard公式計算ELF中萬古霉素的濃度1.48～10.15 μg·mL-1，低于血藥濃度，其滲透率為8.4%～47.13%，平均為23.12%，與類似研究的結(jié)果基本一致[5，10，14]。4例腎功能亢進(jìn)(ClCr>150 mL·min-1)患者的滲透率(18.89±2.73)%，其他患者(24.54±11.02)%，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，2例死亡患者的滲透率(18.19±3.23)%，與存活患者的滲透率(23.83±10.33)%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

傳統(tǒng)的抗感染藥物治療通常關(guān)注血藥濃度和微生物二者之間的關(guān)系，隨著精準(zhǔn)藥物治療的推廣，越來越多研究發(fā)現(xiàn)藥物在靶組織達(dá)到的實(shí)際濃度較血藥濃度更有治療意義。與血藥濃度比較，感染的治療效果與抗菌藥物在感染組織部位的實(shí)際濃度更為相關(guān)，而且大多數(shù)藥物濃度檢測基本上都是通過血藥濃度來推測組織濃度，沒有具體的組織濃度檢測值推薦。對于肺部

表4 16例患者的灌洗液藥物濃度測定結(jié)果

圖1 不同時間點(diǎn)血藥-灌洗液藥物濃度

感染來說，胞外病原菌主要存在于ELF中[1]，抗菌藥物在此處聚集的濃度決定抗感染治療的效果，因此，近年來研究開始對藥物在ELF中的濃度進(jìn)行測定，一方面是為了解藥物對肺組織的滲透性，另一方面探討肺部組織濃度與臨床治療效果的相關(guān)性，用以優(yōu)化現(xiàn)有的抗菌藥物方案。萬古霉素已經(jīng)上市50多年，盡管對其臨床應(yīng)用的研究眾多，但大部分為不同病理生理狀態(tài)下血藥濃度的測定和群體藥動學(xué)分析，而對于肺組織的滲透性研究，以及肺組織藥物濃度與臨床療效相關(guān)性的研究很少。

支氣管肺泡灌洗可以通過注入0.9%氯化鈉溶液抽吸回收的方法，間接獲得稀釋的ELF，是臨床較為安全、方便的獲得ELF的方法。目前尚未建立公認(rèn)的肺泡灌洗采樣的支氣管鏡檢和灌洗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，本研究中的肺泡灌洗操作參考大量以往的研究并結(jié)合ICU臨床經(jīng)驗(yàn)，給予無菌0.9%氯化鈉溶液200 mL分4次注入灌洗，首次50 mL丟棄，且均由ICU同一醫(yī)師進(jìn)行操作，減少由個體間差異導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差。灌洗液在肺內(nèi)停留時間參考先前的各項(xiàng)研究[5，10-11]，選擇注入0.9%氯化鈉溶液后立即(30 s之內(nèi))抽吸出，計算得ELF的稀釋倍數(shù)為17.8～79，與先前的研究基本一致。研究表明不同的停留時間，可自由擴(kuò)散的小分子物質(zhì)被不同程度地稀釋，導(dǎo)致回收的灌洗液中尿素濃度受到影響，立即抽吸可盡量減少自由擴(kuò)散帶來的誤差。通過支氣管肺泡灌洗獲得樣本的操作受到很多因素的影響，首先應(yīng)保證患者給藥方法保持一致，本研究均采用輸液泵，60 min持續(xù)靜脈泵入，于采樣前30 min內(nèi)做好肺泡灌洗準(zhǔn)備工作，以確保在準(zhǔn)確的時間點(diǎn)獲得樣本。樣本采集的操作標(biāo)準(zhǔn)和人員始終保持一致，以減少誤差。

很多研究對臨床常用的抗菌藥物對肺部滲透性進(jìn)行測定，給藥方法包括口服和靜脈滴注，目標(biāo)人群通常為健康志愿者或普通患者。總體來說，對于β-內(nèi)酰胺類、糖肽類藥物，其對肺組織的滲透率<100%，臨床使用時需要根據(jù)血藥濃度估算組織部位實(shí)際到達(dá)濃度，并結(jié)合PK/PD參數(shù)、敏感菌的最低抑制濃度(MIC)等綜合考慮調(diào)整給藥方案；而對于喹諾酮類、利奈唑胺等，其肺組織中藥物濃度通常能達(dá)到血藥濃度的幾倍甚至幾十倍(滲透率>100%)，這類藥物更多地聚集在肺組織，能起到較好的抗菌效應(yīng)，但對血流感染仍需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。

對嚴(yán)重肺損傷患者進(jìn)行藥物對肺部組織穿透性的研究發(fā)現(xiàn)，靜脈給予萬古霉素后測得肺組織內(nèi)實(shí)際藥物濃度要低于血清中的藥物濃度[2-3]。對10例上呼吸機(jī)重癥肺炎患者給予常規(guī)劑量萬古霉素30 mg·kg-1，每天1次，于給藥后24 h測定血清藥物濃度及谷濃度下的ELF中藥物濃度[4]，結(jié)果顯示，10例患者中4例血清藥物濃度>20 mg·mL-1，其ELF中可以檢測到萬古霉素。這些研究都顯示萬古霉素對肺部的滲透性較小，對肺組織部位藥物濃度進(jìn)行檢測，能夠幫助醫(yī)生了解其實(shí)際感染部位能夠達(dá)到的藥物濃度，從而根據(jù)藥物的PK/PD特點(diǎn)來優(yōu)化給藥方案，使感染部位的組織濃度達(dá)到有效治療范圍內(nèi)，以獲得更好的臨床療效。

本研究中，萬古霉素在ELF中的濃度在一個給藥間隔內(nèi)范圍為1.48～10.15 μg·mL-1，灌洗同時血藥濃度為8.71～61.96 μg·mL-1，平均滲透率為23.12%，滲透率較低。LODISE等[5]針對于10名健康志愿者測定其ELF中萬古霉素的濃度，靜脈給藥萬古霉素1 g，q12h，給藥9次后進(jìn)行肺泡灌洗并測定ELF藥物濃度，結(jié)果表明萬古霉素在ELF的滲透率為41%。LAMER等[10]研究納入進(jìn)行機(jī)械通氣重癥患者14例，測得的ELF滲透率為18%?？梢娭匕Y患者對藥物的體內(nèi)過程，受疾病嚴(yán)重程度、器官功能狀態(tài)、白蛋白水平、合并癥等而千差萬別。此外，筆者對腎功能亢進(jìn)患者與其他患者滲透率進(jìn)行比較，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，2例死亡患者與存活患者滲透率比較也差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但由于本研究納入例數(shù)較少，此結(jié)果僅作為參考。

從本研究來看，萬古霉素肺組織滲透率低，在肺部感染患者，其ELF中藥物濃度可能不能滿足治療所需，制定治療方案的時候要根據(jù)萬古霉素的PK/PD特點(diǎn)，一是保證給予足夠的劑量，二是可以將給藥間隔由q12h調(diào)整為q8h甚至q6h。如果萬古霉素血藥濃度已達(dá)標(biāo)但臨床效果未有改善時，尤其是當(dāng)目標(biāo)細(xì)菌MIC值較高的時候，應(yīng)當(dāng)考慮可能肺組織濃度不足所致，此時萬古霉素非最佳選擇。

由于涉及ICU患者以及特殊的采樣方式，本研究存在一些缺陷，如入組例數(shù)少，采樣時間受限，某些關(guān)鍵指標(biāo)(器官功能、白蛋白水平、合并用藥等)基線不能充分匹配等。藥物對肺組織的滲透性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是血漿蛋白結(jié)合率，因?yàn)橛坞x的藥物更加容易透過組織屏障，進(jìn)入感染部位。萬古霉素為大分子，并非高蛋白結(jié)合率藥物，蛋白結(jié)合率約為50%，因此本研究設(shè)計中未考慮蛋白結(jié)合率變化的影響，所測定的血清、灌洗液藥物濃度均為總的藥物濃度(包括游離藥物和蛋白結(jié)合的藥物)。本研究對血清藥物及ELF藥物濃度進(jìn)行分析，其隨時間變化趨勢具有一定的相關(guān)性，藥物在血液中PK過程與在ELF中PK過程類似。由于藥物蛋白結(jié)合率為濃度依賴性，因此藥物體內(nèi)各部位的濃度也有很大差異，后續(xù)可以考慮蛋白結(jié)合率的影響，對藥物在血清、ELF中的PK特點(diǎn)進(jìn)一步研究。

本研究納入16例患者，初步對萬古霉素在此類人群中的肺部滲透性進(jìn)行研究，后期將收集更多患者，并細(xì)化入選標(biāo)準(zhǔn)，以獲得更具針對性的數(shù)據(jù)支持。