朱瑜丹，李仲昆，梁月琴，夏洪穎，李翠紅，王重娟

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650051)

荊芥穗(Herbaschizonepetae)為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗，味辛，性微溫，歸肝肺經(jīng)，是一味常用的中藥解表藥[1]。荊芥穗用藥歷史悠久。民間用于治療頭風(fēng)、虛勞、婦人血風(fēng)等[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，荊芥穗具有抗炎、抗病毒和鎮(zhèn)痛作用，并具有一定的抗補(bǔ)體作用[2]。荊芥穗治療婦科血癥、帶下等疾病，也取得較好的效果[3]，因此具有較高的開發(fā)價(jià)值。目前研究較多荊芥穗有效成分為其揮發(fā)油，化學(xué)成分種類繁多，主要是單萜和倍半萜成分，還含少量的醛、羧酸和酯類等化合物[4-5]，而對(duì)于荊芥穗多糖卻鮮有報(bào)道。多糖是中草藥中重要組成成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等作用。其中植物多糖的來源廣泛、毒副作用小[6]。筆者通過水提醇沉法提取荊芥穗多糖(Herbaschizonepetaepolysaccharide，HSP)，利用高效液相色譜(HPLC)分析HSP的單糖組成，并分別從體內(nèi)外水平評(píng)價(jià)HSP的免疫調(diào)節(jié)活性，為其在食品與醫(yī)療保健中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性ICR小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過昆明市延安醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在昆明市延安醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房中，室內(nèi)溫度(22±2) ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h循環(huán)照明，實(shí)驗(yàn)開始前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由攝食和飲水。

1.1.2藥物及試劑 荊芥穗(河北百草康神藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1806011)，由昆明市延安醫(yī)院李仲昆主任藥師鑒定為荊芥穗。單糖標(biāo)準(zhǔn)品D-甘露糖(D- Mannose，Man，批號(hào)：10127360)、L-鼠李糖(L-rhamnose，Rha，批號(hào)：GG01)、D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid，GlcA，批號(hào)：10136713)、L-半乳糖醛酸(L-galacturonic acid，GalA，批號(hào)：KBLFG)、D-葡萄糖(D-glucose，Glc，批號(hào)：10145311)、D-半乳糖(D- galactose，Gal，批號(hào)：10134490)、L-阿拉伯糖(L-arabinose，Ara，批號(hào)：V900920)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP，批號(hào)：BCBK6062V)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，批號(hào)：WXBC5159V)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)級(jí)Lipopolysaccharides(LPS)來源于大腸埃希菌 055：B5(批號(hào)：028M4138V)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；噻唑藍(lán)(MTT，批號(hào)：829Z051)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；FITC標(biāo)記葡聚糖40(批號(hào)：20614)購(gòu)自瑞典TdB Consultancy AB公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30243.01B)；胰蛋白酶(貨號(hào)：SH30042.01)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosv-namide，CY，批號(hào)：14122325)購(gòu)自江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7購(gòu)自加拿大ABM公司。

1.1.3儀器及設(shè)備 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；UV-2201型紫外分光光度計(jì)(日本島津)；KDC-2046低速冷凍離心機(jī)(安徽中佳科學(xué)儀器有限公司)；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；Model 550全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó) BIO-RAD公司)；FC-500流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；Nikon50i光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；FA2004電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，感量：0.1 mg)。

1.2荊芥穗多糖的提取 稱取荊芥穗粉末300 g，置回流提取裝置中，加入8倍量95%乙醇，70 ℃回流提取3 h以除去醇溶性小分子。藥渣加入10倍量純水，90 ℃回流提取2 h，重復(fù)提取2次，合并2次上清液。4000×g離心15 min，上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至400 mL。向濃縮液中加入95%乙醇，使溶液中乙醇的終濃度為70%，靜置過夜。該步驟重復(fù)3次以純化多糖，沉淀置真空干燥箱40 ℃干燥48 h，得荊芥穗多糖(Herbaschizonepetaepolysaccharide，HSP)7.47 g，得率為2.49%，本研究只提取一個(gè)批次HSP，以下各實(shí)驗(yàn)均采用該批次HSP。

1.3總糖、糖醛酸及蛋白質(zhì)含量測(cè)定 總糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[7]；糖醛酸含量測(cè)定采用硫酸-四硼酸鈉法[7]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[7]。

1.4單糖組成分析 稱取一定量單糖標(biāo)準(zhǔn)品(Man 1.53 mg、Rha 1.54 mg、GlcA1.05 mg、IdoA 1.05 mg、GalA 1.30 mg、Glc 1.07 mg、Gal 1.28 mg、Ara 1.14 mg)以及供試品HSP 7.15 mg，置于5 mL COD管中，以不加供試品的空白管為對(duì)照，每管加2 mol·L-1三氟乙酸1 mL，110 ℃中水解4 h。將水解液蒸干，用甲醇洗5次。加水1 mL溶解，取上述水解液50 μL與0.6 mol·L-1的氫氧化鈉溶液50 μL混合；加0.5 mol·L-1PMP甲醇溶液50 μL，70 ℃烘箱反應(yīng)30 min；取出放置10 min冷卻至室溫；加 0.3 mol·L-1鹽酸溶液100 μL中和；加水至1 mL，使用等體積三氯甲烷萃取3次，將水相用孔徑0.22 μm濾膜濾過后，進(jìn)樣分析。

色譜條件：Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：0.1 mol·L-1乙酸銨(pH值5.5)緩沖液-乙腈(85：15)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。

1.5MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞按每孔1×104個(gè)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，分別加入含有各濃度HSP(12.5，25，50，100，200，400，800 μg·mL-1)的新鮮培養(yǎng)基，每孔150 μL，陽(yáng)性對(duì)照組分別加入1 μg·mL-1LPS。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO溶液150 μL，震蕩混勻，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處吸光度(A值)。細(xì)胞生長(zhǎng)率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞按每孔1×105個(gè)加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，分別加入低、中、高濃度HSP(100，200，400 μg·mL-1)的新鮮培養(yǎng)基，每孔1 mL，陽(yáng)性對(duì)照組加入1 μg·mL-1LPS。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入1 mg·mL-1FITC-dextran 40，37 ℃避光培養(yǎng)1 h。棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，PBS 500 μL重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7動(dòng)物分組、造模及給藥 參考文獻(xiàn)[8]方法，將小鼠適應(yīng)性暫養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組5只：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、HSP組。模型對(duì)照組和HSP組在實(shí)驗(yàn)第1，3，5，7天腹腔注射CY 50 mg·kg-1，空白對(duì)照組注射等體積0.9%氯化鈉注射液。HSP組每天灌胃HSP 1.0 g·kg-1[0.1 mL·(10 g)-1]，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)8 d。每天稱定并記錄小鼠體質(zhì)量，同時(shí)記錄小鼠活動(dòng)情況及進(jìn)食量。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，小鼠禁食12 h，處死小鼠，沿腹部正中線切開，充分暴露小鼠胸腔和腹腔，取小鼠胸腺、脾臟和全段小腸。記錄小鼠全段小腸上派氏結(jié)個(gè)數(shù)，并計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果

2.1HSP中總糖、糖醛酸及蛋白質(zhì)含量 本研究采用硫酸-苯酚法測(cè)定HSP中總糖含量，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=77.61X-0.016，R2=0.994。采用硫酸-四硼酸鈉法測(cè)定糖醛酸含量，以吸光度為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=10.4X-0.060，R2=0.978。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量，以吸光度為縱坐標(biāo)，BSA濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=39.42X+0.640，R2=0.972。根據(jù)回歸方程計(jì)算出HSP中總糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)的含量分別為22.93%，25.25%和8.59%。

2.2HSP單糖組成分析 選取常見的8種單糖Man、Rha、GlcA、IdoA、GalA、Glc、Gal、Ara為混合標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)PMP衍生化后進(jìn)行HPLC分析。圖1(A)可以看出8種混合單糖實(shí)現(xiàn)良好的分離。參照?qǐng)D1(A)，HSP由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara 組成。在HPLC圖譜中，峰面積與質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系，因此通過峰面積可對(duì)單糖進(jìn)行定量分析[9-10]。根據(jù)峰面積比值、各標(biāo)準(zhǔn)單糖和HSP質(zhì)量計(jì)算HSP中各單糖比例，結(jié)果見表1所示，從表1可看出，組成HSP的主要單糖為Ara，所占比例達(dá)到92.26%，其次是GalA(6.67%)和Rha(4.36%)。

圖1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品(A)、HSP(B)經(jīng)PMP衍生化后的HPLC圖譜

表1 荊芥穗多糖單糖組成分析

2.3HSP對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響 為了考察HSP的體外免疫調(diào)節(jié)活性，本研究以小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7為模型，采用MTT法測(cè)定HSP對(duì)Raw264.7細(xì)胞增殖率的影響。結(jié)果見圖2。LPS和不同濃度的HSP作用于Raw264.7細(xì)胞24 h后均對(duì)其增殖率產(chǎn)生不同程度的影響，且HSP對(duì)巨噬細(xì)胞的促增殖作用呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。低濃度(≤100 μg·mL-1)的HSP對(duì)細(xì)胞增殖率的影響與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中濃度(200 μg·mL-1)的HSP能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖(t=-7.89，P<0.05)。高濃度(400，800 μg·mL-1)的HSP能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖(t=-5.12，-3.96，P<0.01)。由于400和800 μg·mL-1的HSP促增殖作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故分別以100，200，400 μg·mL-1為低、中、高濃度進(jìn)行進(jìn)一步免疫調(diào)節(jié)活性研究。

①與空白對(duì)照組比較，t=4.45，5.11，3.96，P<0.01；②與空白對(duì)照組比較，t=7.89，P<0.05。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吞噬活性 本研究采用流式細(xì)胞術(shù)考察濃度為100，200，400 μg·mL-1的HSP對(duì)Raw264.7細(xì)胞吞噬活性的影響，結(jié)果見圖3。低濃度HSP組與空白對(duì)照組比較，熒光強(qiáng)度相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中濃度和高濃度的HSP能夠顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性(t=-191.22，-28.82，P<0.01)，且隨HSP濃度的增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明HSP對(duì)巨噬細(xì)胞的促吞噬作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

2.5HSP對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察Raw264.7細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見圖4。與空白對(duì)照組比較，經(jīng)HSP和LPS處理后的細(xì)胞數(shù)量增多，與MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)HSP具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。此外，經(jīng)HSP和LPS處理后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化。空白對(duì)照組中Raw264.7細(xì)胞呈圓形或橢圓形，貼壁良好，較少見突起，細(xì)胞內(nèi)未見空泡。經(jīng)LPS和不同濃度的HSP處理24 h后，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞體積變大，呈圓形、橢圓形、菱形、梭性或不規(guī)則形，可見較多偽足，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多顆粒和空泡，呈現(xiàn)激活狀態(tài)，且隨著HSP濃度的增加，其對(duì)Raw264.7細(xì)胞形態(tài)的影響越顯著。

A.空白對(duì)照組(4 ℃)；B.空白對(duì)照組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.HSP低濃度組；E.HSP中濃度組；F.HSP高濃度組；①與空白對(duì)照組比較，t=22.72，22.08，8.10，P<0.01。

2.6HSP對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用 為了評(píng)價(jià)HSP的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用，本研究通過腹腔注射50 mg·kg-1CY誘導(dǎo)建立免疫抑制小鼠模型，考察HSP對(duì)免疫抑制小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及派氏結(jié)數(shù)量的影響。結(jié)果見表2，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量增加值、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(t=6.34，5.49，11.72，P<0.01)，提示造模成功。與模型對(duì)照組比較，HSP能夠提高小鼠的體質(zhì)量增加值和腸道派氏結(jié)數(shù)量，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HSP能夠顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.36，-2.98，P<0.05)。

圖4 HSP對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

表2 3組小鼠體質(zhì)量增值、臟器指數(shù)及派氏結(jié)結(jié)果

3 討論

多糖是自然界廣泛存在的一類天然有機(jī)大分子物質(zhì)，其與脂肪、核酸、蛋白質(zhì)一起被稱為構(gòu)成生命體的四大基本物質(zhì)，具有重要的生物學(xué)功能。近年來，中草藥多糖成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)，它不僅參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成，也是多種內(nèi)源性生物活性分子的重要組成部分，其中，免疫調(diào)節(jié)作用是其主要的藥理作用之一[11]。中藥多糖來源廣泛，來源于不同動(dòng)植物的多糖，可能由于其單糖組成或連接方式不同而具有不同的藥理活性[12-13]，即使是來源于同一物種的多糖，由于自然環(huán)境或采收季節(jié)變動(dòng)也可能使多糖的組成發(fā)生變化，進(jìn)而影響其藥理活性[14]。因此，本研究初步對(duì)HSP的化學(xué)組成進(jìn)行研究，分別測(cè)定其總糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量。并通過PMP衍生化后進(jìn)行HPLC分析，研究HSP的單糖組成。結(jié)果表明HSP由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Ara 組成，其中最主要的單糖種類為Ara，占比達(dá)到92.26%。此外，還含有部分酸性多糖GalA、GlcA和蛋白質(zhì)，因此HSP可能是一種酸性雜化蛋白多糖，但僅從目前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能確定蛋白質(zhì)是否與多糖連接，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。此外，HSP中單糖的連接方式還有待于進(jìn)一步研究。

免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成。本研究首先在體外研究HSP對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能。免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。其中巨噬細(xì)胞是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象，也在機(jī)體免疫應(yīng)答和防御中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15]。因此，本研究選擇醫(yī)學(xué)研究中常用的小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞作為細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)HSP對(duì)Raw264.7細(xì)胞增殖、吞噬活性以及形態(tài)的影響。結(jié)果顯示，低濃度的HSP促增殖作用不顯著，當(dāng)濃度高于200 μg·mL-1時(shí)，HSP表現(xiàn)出顯著的促增殖作用，且隨著濃度的增加，促增殖作用增強(qiáng)，表明HSP的促增殖作用具有濃度依賴性。同樣，隨著HSP濃度的增加，巨噬細(xì)胞吞噬活性增強(qiáng)，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)偽足和胞內(nèi)空泡，呈現(xiàn)出激活狀態(tài)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSP能夠劑量依賴性的活化Raw264.7細(xì)胞。

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)HSP在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)活性，本研究采用CY誘導(dǎo)建立免疫抑制小鼠模型，并選擇體質(zhì)量增長(zhǎng)值、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、腸道派氏結(jié)數(shù)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其發(fā)育狀態(tài)直接影響機(jī)體免疫能力，因此胸腺和脾臟指數(shù)可以作為反映機(jī)體免疫狀態(tài)的初步指標(biāo)[16]。派氏結(jié)是存在于哺乳動(dòng)物小腸段的集合淋巴小結(jié)，其中富含胸腺源性T細(xì)胞和B細(xì)胞，是腸道黏膜免疫系統(tǒng)的免疫誘導(dǎo)部位[17]。派氏結(jié)的大小、數(shù)量及其中淋巴細(xì)胞的數(shù)量和活性狀態(tài)等可以反映腸道黏膜局部的免疫狀態(tài)[18]。本研究中，通過隔日腹腔注射50 mg·kg-1CY的方法，注射4次后，小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低，提示小鼠免疫力被抑制，造模成功。而HSP能夠顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺脾臟指數(shù)，表明HSP在體內(nèi)仍然具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。此外，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組中免疫抑制小鼠腸道派氏結(jié)數(shù)量減少，HSP能夠一定程度上恢復(fù)免疫抑制小鼠腸道派氏結(jié)水平，但由于組內(nèi)差異較大，三者之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究從荊芥穗中分離得到的酸性雜化多糖，分別從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其在適當(dāng)劑量下能夠活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)免疫抑制小鼠免疫功能。本研究為荊芥穗多糖在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，但該多糖的結(jié)構(gòu)及具體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚，有待深入研究。