何天目，陳啟洪，楊沙，張建永，李曉飛，3

(1.遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學藥學院，遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，遵義 563000)

斑蝥味辛，性溫，有大毒，是我國首先發(fā)現的一種具有抗腫瘤作用的中藥。入藥始載于《神農本草經》，具有破血逐瘀、散結消癥、攻毒蝕瘡之功[1]，2015年版《中華人民共和國藥典》將其歸為大毒中藥[2]。其中斑蝥素(cantharidin)是斑蝥中主要活性成分，對肝癌、胃癌等多種腫瘤具有較強的殺傷和抑制作用[3]，且被開發(fā)成上市藥物，同時圍繞其開發(fā)的衍生藥物效果也較好。但目前臨床對斑蝥的用法用量、毒性等掌握不夠，加之藥物管理不嚴，常因多服、誤服產生胃腸道反應及肝腎毒性，嚴重者可致腎衰竭，甚至死亡[4]。其毒性物質基礎多認為是斑蝥素。有研究發(fā)現小鼠腹腔注射斑蝥素后，腎小球和腎小管出現充血，并伴有腎小球囊異常[5]。還有研究通過動物和細胞實驗發(fā)現斑蝥素可引起嚴重腎毒性，并伴有血清肌酐、尿蛋白及尿素氮水平顯著升高，且光鏡下可見腎小球簇狀回縮、小管混濁腫脹，電鏡下可見典型的凋亡形態(tài)學改變[6]。目前斑蝥素致腎毒性機制尚不清楚，相關分子機制亟需厘清，從而破除其臨床應用限制，更好地發(fā)揮抗腫瘤的作用和價值。

網絡藥理學最初由英國藥理學家HOPKINS[7]于2007年率先提出，其基于系統(tǒng)生物學和多向藥理學等多個學科，運用各種組學、高通量篩選、網絡可視化及網絡分析等技術，闡釋“藥物-靶點-疾病”之間復雜的網絡關系，從多維度視角理解疾病的分子基礎，預測藥物干預后的作用機制，并通過實驗驗證、評估藥物的有效性、作用機制及不良反應，從而發(fā)現高效、低毒的藥物[8]。有研究基于網絡藥理學的方法預測附子毒性成分與心臟毒性的關系，發(fā)現其分子機制可能與SCN5A、GJA1及GJA5靶點有關[9]。也有研究發(fā)現，二至丸對腎臟的保護作用機制與ESR1、ESR2、GCK、MMP3等靶點及 PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路、嘌呤代謝過程等信號通路有關[10]。然而，目前采用網絡藥理學研究藥物腎毒性的方法尚不完善。因此，本研究首先獲取腎毒性相關靶點，構建網絡，基于網絡藥理學的方法對斑蝥素致腎毒性的分子機制進行研究，以期為斑蝥素的深入開發(fā)及臨床安全應用提供新的思路，并為網絡藥理學在腎毒性預測方面提供參考。

1 方法

1.1斑蝥素作用蛋白靶點預測及網絡構建 通過TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、CTD(https：//ctdbase.org)、Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)等數據庫檢索斑蝥素的潛在作用靶點(檢索式cantharidin)，通過Uniprot(https：//www.uniprot.org)數據庫進行校正和轉化，整合獲取斑蝥素作用的蛋白靶點(人源)。

1.2腎毒性相關靶點網絡及構建 基于“1.1”項方法，通過國內外文獻檢索及Digsee(https：//210.107.182.71/geneSearch/)、Genecards(https：//www.gene-cards.org)、CTD等數據庫檢索腎毒性相關的靶點(檢索式nephrotoxicity)，并通過Omcishare(http：//www.omicshare.com/tools/Home/Soft/venn)在線分析平臺對與斑蝥素作用靶點進行互作可視化。

1.3靶點-疾病互作網絡 將“1.2”項得到斑蝥素與腎毒性共同靶點，作為斑蝥素腎毒性靶點，導入CTD數據庫進行腎毒性相關疾病的分析。采用Cytoscape 3.7.0版軟件，構建“靶點-疾病”互作網絡，進一步以Network analysis插件對網絡特征指標度(Degree)和介數(Betweenness)進行分析。

1.4蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建 將篩選得到的斑蝥素腎毒性靶點導入STRING(https：//string-db.org)獲取蛋白質相互作用關系，該軟件可自動對每一個蛋白質相互作用信息進行打分，分值越高表明蛋白質的相互作用置信度越高。為保證數據的可靠性，本研究選取打分值高于0.7的高置信度的數據，構建由導入靶點組成的PPI網絡，并采用Cytoscape3.7.0版軟件對網絡進行可視化處理和分析。

1.5靶點蛋白的基因功能和通路分析 采用在線分析數據庫DAVID(https：//david.ncifcrf.gov)對斑蝥素腎毒性靶點進行GO基因功能分析及KEGG通路富集分析，設定閾值P<0.05，獲取靶點參與的主要信號通路。并通過Cytoscape 3.7.0版軟件構建“靶點-通路”網絡圖及Omicshare在線分析平臺對富集分析結果進行可視化，解析斑蝥素腎毒性的主要信號通路，揭示其導致腎毒性的分子機制。

1.6分子對接驗證 選擇斑蝥素腎毒性作用的關鍵靶點，采用Systems Dock Web Site(http：//system-sdock.unit.oist.j p/iddp/home/index)在線對接網站，將靶點與斑蝥素一一進行分子對接，以其Docking Score評價斑蝥素和靶點的結合活性。一般認為得到的Docking Score值越大，配體與受體的結合越穩(wěn)定。當Docking Score>4.25，認為分子與靶點結合具有一定活性；當Docking Score>5.0，說明分子與靶點的結合具有較好活性。

2 結果

2.1斑蝥素作用的靶點網絡 通過檢索收集到斑蝥素的潛在作用靶點共41個，腎毒性潛在作用靶點共5619個，網絡見圖1所示，對斑蝥素腎毒性的潛在作用靶點進行整合，同時刪除重復的作用靶點，總共得到斑蝥素的腎毒性的32個靶點，具體見表1，圖2。

2.2靶點-疾病網絡分析 將32個斑蝥素腎毒性靶點蛋白導入CTD 數據庫中進行相關疾病的分析，查詢靶點相關聯的疾病，共得到354種疾病，導入Cytoscape 3.7.0版軟件，構建“靶點-疾病”網絡，見圖3。在網絡中，一個節(jié)點的度(degree)表示和節(jié)點相連的路線的條數，其度值越大，說明該節(jié)點在網絡中發(fā)揮比較重要的作用。其中，排名前5的靶點分別為PTGS2(degree=105)、TP53(degree=84)、AHR(degree=52)、BCL-2(degree=51)、AKT1(degree=30)，介數(betweeness)也相對較高，表明上述靶點在網絡中的重要性；其中腎毒性相關的疾病有Kidney neoplasms (腎腫瘤，degree=5)、Carcinoma，renal cell(腎癌，degree=4)、Kidney diseases(腎臟疾病，degree=2)、Acute kidney injury(急性腎損傷，degree=2)、Kidney failure，chronic(慢性腎衰竭，degree=1)；其他度較高的疾病有Prostatic neoplasms(前列腺腫瘤，degree=13)、Breast neoplasms (乳腺腫瘤，degree=13)、Stomach neoplasms(胃腫瘤，degree=9)、Carcinoma，hepatocellular(肝癌，degree=8)、Colorectal neoplasms(結直腸腫瘤，degree=8)等。

圖1 “腎毒性-靶點”網絡圖

表1 斑蝥素致腎毒性的靶點信息

2.3斑蝥素腎毒性靶點PPI網絡構建與分析 將斑蝥素腎毒性中32個靶點蛋白導入STRING數據庫中，限定物種為人源，獲取這32個靶點的相互作用關系，將置信度設置為>0.7，篩選得到31個靶點蛋白(除CAMK4，置信度<0.7)，隨后將結果導入Cytoscape 3.7.0軟件構建PPI網絡，見圖4。PPI網絡共包括31個節(jié)點，120條邊，每一個節(jié)點表示一個靶點，顏色變化及節(jié)點大小對應其degree值大小，邊表示靶點之間的關聯。根據網絡拓撲學性質，獲得degree值排前10的關鍵蛋白分別為CASP3(degree=19)、TP53(degree=18)、AKT1(degree=15)、MAPK1(degree=14)、MAPK8(degree=14)、CASP8(degree=14)、MAPK3(degree=13)、CASP9(degree=13)、JUN(degree=12)、BCL-2(degree=11)，表明這些靶點在PPI網絡圖中的中心度較高，能與多個靶點發(fā)生相互作用，提示其可能是斑蝥素致腎毒性的重要靶點。

圖2 斑蝥素靶點與腎毒性靶點維恩圖

圖3 斑蝥素致腎毒性“靶點-疾病”網絡圖

2.4GO生物進程分析 將斑蝥素腎毒性篩選后的31個關鍵靶點經cytoscape 3.7.0 ClueGO分析，得到369個生物進程，其中排名前10的生物進程，見表2。主要涉及平滑肌細胞增殖正調控、細胞對寒冷的應答、蛋白質定位對細胞核的正調控作用、花生四烯酸代謝及成纖維細胞增殖調控等方面；經Omicshare平臺進行動態(tài)GO分析，見圖5，6。腎毒性靶點還涉及到生物調控、信號轉導、細胞對機械刺激的反應、代謝過程及免疫應答等方面。這些生物過程多與細胞凋亡、免疫炎癥等發(fā)展密不可分，提示斑蝥素可能通過調控以上生物進程等引起腎毒性。

圖4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

表2 斑蝥素致腎毒性靶點的生物進程分析結果

2.5KEGG通路富集分析 采用DAVID在線分析平臺對斑蝥素腎毒性篩選后的31個關鍵靶點進行 KEGG 通路富集分析，將排名前30的通路導入Cytoscape 3.7.0版軟件作“靶點-通路”網絡圖，見圖7，并通過Omicshare平臺對通路數據可視化，見圖8，以影響因子(rich factor，RF)、P值以及調控通路上的基因個數來衡量 KEGG 的富集程度，其中RF指差異表達的基因中位于該通路條目的基因數目與所有注釋基因中位于該通路條目的目的基因總數的比值，且富集的程度與RF值成正比。研究結果發(fā)現靶點主要富集于Colorectal cancer(結直腸腫瘤)、Pathway in cancer(腫瘤途徑)、Apoptosis(細胞凋亡)、Hepatitis B(乙型肝炎)、TNF(腫瘤壞死因子)及MAPK(MAPK信號轉導)等通路。

圖5 靶點的GO生物進程層級關系

圖6 前20個GO生物進程富集結果

2.6分子對接結果 為驗證斑蝥素腎毒性共同預測靶點的準確性，本研究采用Systems Dock Web Site進行分子對接。首先通過Chemdraw 14.0版軟件繪制斑蝥素，并保存為sdf格式，見圖9，再將斑蝥素和31個關鍵靶點進行分子對接，根據默認參數對其中有蛋白晶體結構的11個靶點進行對接，見圖10。結果發(fā)現，Docking Score<5.0有2個(18.2%)，>5.0的有9個(81.8%)，對接結果良好，提示其具有良好的相互作用，驗證了本研究預測的可靠性，同時為進一步闡述斑蝥素致腎毒性的分子機制提供依據。

圖7 “靶點-通路”網絡圖

圖8 前20個KEGG通路富集氣泡圖(P≤0.05)

3 討論

近年來，中藥安全性問題一直備受關注，其中腎毒性不容忽視。目前研究發(fā)現中藥引起腎毒性機制主要有誘導腎臟細胞凋亡[11]、激活腎臟免疫炎癥反應[12]、引發(fā)溶血反應[13]、導致氧化損傷[14]及誘發(fā)腎缺血[15]等，但對于中藥引起腎毒性的過程及深入分子機制尚不明確。斑蝥素是傳統(tǒng)抗腫瘤中藥斑蝥的主要活性成分，可抑制多種腫瘤細胞，且已投入臨床使用，但因其嚴重的不良反應已成為限制斑蝥素廣泛應用的主要因素。《中華人民共和國藥典》2015年版明確規(guī)定，斑蝥的常用量為0.03～0.06 g，炮制后多入丸散用；外用適量，研末或浸酒醋，或制油膏涂敷患處，不宜大面積用[2]。此外，研究發(fā)現斑蝥素0.14 μg即可誘發(fā)皮膚起泡，10 mg就可發(fā)生嚴重中毒反應甚至致死[16]。其嚴重不良反應已引起社會的廣泛關注，亟需引入新的減毒策略，但其分子機制尚不清楚。因此，本研究基于網絡藥理學的方法，探討斑蝥素致腎毒性的分子機制，以期為斑蝥素的安全使用及臨床應用提供參考。

圖9 斑蝥素結構式

圖10 斑蝥素與11個靶點的分子對接得分

本研究綜合“靶點-疾病”、PPI及“靶點-通路”網絡發(fā)現，斑蝥素致腎毒性共32個靶點，經置信度>0.7篩選后得到31個核心靶點，主要包括PTGS2/COX-2(前列腺素內環(huán)氧化物合成酶2)、TP53/p53(腫瘤蛋白p53)、BCL-2(B淋巴細胞瘤-2基因)、AKT1(蛋白激酶)、CASP3(Caspase-3，半胱氨酸蛋白酶-3)等靶點。其中PTGS2/COX-2主要參與炎癥調節(jié)和抗氧化反應，有研究發(fā)現PTGS2/COX-2表達上調參與斑蝥素引起大鼠急性膀胱炎的過程；此外也有研究發(fā)現PTGS2/COX-2表達下調與黃芩發(fā)揮抗炎作用減輕斑蝥素毒性有關[17]。還有研究發(fā)現PTGS2/COX-2蛋白mRNA水平參與GTS-21減輕順鉑引起腎毒性的過程[18]，上述研究提示斑蝥的腎毒性與PTGS2/COX-2有關，值得深入研究。TP53/p53具有調節(jié)細胞生長和增殖的作用，有研究發(fā)現p53、BCL-2、BAX蛋白水平改變參與斑蝥素抑制舌鱗狀癌細胞的過程[19]；還有研究發(fā)現TP53、CASP3表達上調及BCL-2水平下降可能與慶大霉素對腎臟細胞的毒性作用有關[20]。BCL-2是抑制凋亡基因，有研究發(fā)現BCL-2表達水平降低、BAX表達上調參與斑蝥素抑制人肺癌細胞的過程，但對腎臟正常細胞筆者還未見報道[21]。此外，CASP3是促凋亡基因，有研究發(fā)現CASP3、BCL-2、BAX蛋白水平在斑蝥素治療人非小細胞肺癌中發(fā)生改變，且與自噬、細胞凋亡密切相關[22]；還有研究發(fā)現CASP3、BAX表達水平降低及BCL-2表達水平上調參與小檗堿減輕甲氨蝶呤引起腎毒性的過程[23]。AKT1活化后可以調節(jié)細胞凋亡和葡萄糖代謝，但AKT1參與斑蝥素致腎毒性目前還未見報道，綜上可知，上述靶點在斑蝥素腎毒性中的作用值得進一步探索。對斑蝥素的41個作用靶點分析發(fā)現，HAMP(鐵調素基因)可能是斑蝥素致腎毒性的作用靶點，如有研究表明HAMP與慢性腎衰竭、腎腫瘤有關[24-25]。然而，HAMP蛋白并不在5619個腎毒性潛在靶點中，因此，該潛在靶點也有待進一步探索。綜上可知，斑蝥素致腎毒性的分子機制是多靶點共同作用，可在后期實驗研究中，選取合適的靶點及相關通路進行分析，更有效地揭示分子機制。

結合GO生物進程分析，斑蝥素腎毒性主要涉及平滑肌細胞增殖、花生四烯酸代謝、成纖維細胞增殖、代謝過程及免疫應答等方面。如有研究發(fā)現，血管平滑肌細胞與成纖維細胞增殖能被斑蝥素抑制和遷移[26-27]，同時，平滑肌細胞caveolae參與大鼠腎動脈收縮功能調控機制，提示以上過程可能與斑蝥素引起腎毒性有關[28]；此外，花生四烯酸代謝通路主要參與炎癥反應和氧化應激，可能是引起腎毒性的潛在途徑[29]；能量代謝、氨基酸代謝及腸道微生物代謝可能與苦參堿對小鼠的腎毒性有關[30]；免疫應答可能與馬兜鈴酸類中藥激活大鼠巨噬細胞和T細胞引起腎炎樣病變有關[31]。因此，斑蝥素致腎毒性分子機制可能與細胞增殖、免疫應答、能量代謝及腸道菌群微生物調節(jié)等有關。

本研究采用在線分析系統(tǒng)DAVID進行KEGG通路富集分析，發(fā)現網絡中核心靶點主要富集在細胞凋亡、炎癥反應、MAPK信號轉導通路及腫瘤途徑等信號通路。如有研究發(fā)現人骨肉瘤細胞凋亡與斑蝥素作用的線粒體途徑有關，伴有Bax、PARP表達上調與BCL-2、p-Akt、p-Cdc2水平下降，且呈劑量依賴性[32]。還有研究發(fā)現炎癥反應可能與斑蝥素抑制血管平滑肌細胞增殖有關，其炎癥相關因子IL-6、TNF-α水平明顯下調[33]。細胞凋亡、炎癥反應也參與燈盞乙素減輕順鉑腎毒性的過程[34]。提示凋亡與炎癥過程可能是斑蝥素致腎毒性的重要機制之一。還有研究發(fā)現，抑制結直腸腫瘤細胞的侵襲與轉移可能與斑蝥素影響RhoA蛋白的表達有關，斑蝥素在抑制腫瘤細胞的同時也引起嚴重的腎損傷，且呈量毒關系[35]。此外，MAPK信號通路是核心信號轉導通路，廣泛參與細胞增殖分化、生長發(fā)育、代謝和免疫調節(jié)[36]。如有研究發(fā)現，MAPK通路是斑蝥素治療乳腺癌細胞和肺癌細胞的重要途徑[37-38]。同時，MAPK 信號通路也參與大葉蘭酚減輕小鼠高葡萄糖誘導腎毒性的過程[39]，提示其可能是斑蝥素致腎毒性的潛在通路。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學研究方法，通過篩選斑蝥素腎毒性共同靶點、構建“靶點-疾病”、PPI、“靶點-通路”網絡，結合GO生物進程分析與KEGG通路富集分析等一系列網絡分析，從系統(tǒng)層面揭示斑蝥素致腎毒性多靶點、多途徑的分子作用機制。然而，目前斑蝥素致腎毒性分子機制的研究尚不清楚，該研究結果仍需進一步實驗驗證，可結合分子生物學、代謝組學等技術進行深入分子機制分析，從而為后續(xù)研究斑蝥素致腎毒性的分子機制及斑蝥素的安全評價提供思路與線索，進一步為擴大斑蝥素的臨床應用提供參考。