胡彥武，楊溫欣，包小雪，于帥，武子敬，李瑞麗

(1.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，通化 134002；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長春 130117)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種以動脈血管壁炎癥改變?yōu)橹鞯穆赃M(jìn)行性疾病，炎癥反應(yīng)出現(xiàn)在AS形成的各個階段[1]。該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，有學(xué)者認(rèn)為血脂代謝異常可引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性因子，誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附、遷移至動脈管壁內(nèi)膜形成AS斑塊[2]。因此，控制炎癥反應(yīng)已成為治療AS的新思路。

葛根素是從中藥葛根中提取一種異黃酮類化合物，化學(xué)名為4，7-二羥基-8-β-D-吡喃葡萄糖醛基異黃酮，分子式為C21H20O9，相對分子質(zhì)量416.37。近年來，對葛根素的研究一直都比較活躍，發(fā)現(xiàn)葛根素具有明顯的心血管保護(hù)活性。研究顯示，葛根素可顯著降低ApoE-/-小鼠[3]、家兔AS模型粥樣斑塊炎癥因子[4]的表達(dá)，并可通過調(diào)控NF-κB信號通路改善實驗動物血脂異常、抑制AS時血管壁慢性炎癥反應(yīng)，但是否調(diào)控與NF-κB信號通路級聯(lián)的絲裂原活化激酶(mitogen-activated kinase，MAPK)信號通路及深入機(jī)制，筆者尚未見報道。本研究旨在探討葛根素對AS大鼠血脂代謝及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β等炎性因子水平的影響，并通過檢測MAPK信號通路相關(guān)信號蛋白磷酸化情況，進(jìn)而明確葛根素抗AS的作用及可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，吉林大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)2007-0003。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，相對濕度(50±10)%，實驗前動物禁食12 h，自由飲水。

1.2藥品與試劑 葛根素(四川維克奇生物技術(shù)有限公司，批號：181112，含量：98.0%)，辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司，批號：M018303)，膽固醇(百奧生物科技有限公司，批號：180621)，膽酸鈉(美國Gibco公司，批號：8118241)，丙基硫氧嘧啶(上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號：180617)，維生素D3注射液(VD3，上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號：180905)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20180805，20180812，20180823，20180901)；TNF-α、IL-6、IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司提供，批號分別為180712，180705，180714)，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)1/2、p38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun Nterminal kinase，JNK)、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號分別為ZB-0426，ZB-0527，ZB-0621，ZB-0601，ZB-0514，ZB-0512)，BCA蛋白測定試劑盒(美國Thermo公司，批號：ZM02N0016)，電致化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液和硝酸纖維素膜(美國Millipoer公司)。

1.3儀器與設(shè)備 倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，URIT-660酶標(biāo)儀(桂林優(yōu)利特集團(tuán)有限公司)，超低溫冰箱(美國Thermo公司)，H1650臺式低溫離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，F(xiàn)A1004電子天平(上海精科天平儀器廠，感量：0.1 mg)。

1.4動物造模 采用高脂飼料誘導(dǎo)建立大鼠AS模型[5]。將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，分別為正常對照組15只和AS模型組45只。兩組大鼠均自由飲水，正常對照組大鼠給予普通飼料，模型組大鼠給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料80.8%+豬油10%+白糖5%+膽固醇3.5%+膽酸鈉0.5%+丙基硫氧嘧啶0.2%)，并于造模開始時，模型組各鼠腹腔注射VD370 U·kg-1，每天1次，連續(xù)3 d。造模9周后，從兩組大鼠中各隨機(jī)選出5只，禁食(不禁水)12 h后，10%水合氯醛0.35 mL·(100 g)-1麻醉，腹主動脈取血后，剪取胸主動脈，進(jìn)行TG、TC、LDL-C、HDL-C等血脂成分檢測及病理學(xué)檢查，以判斷造模是否成功。

1.5動物分組及給藥 AS模型復(fù)制成功后，將模型組剩余40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即模型對照組、辛伐他汀組(4 mg·kg-1·d-1)、葛根素大劑量組(60 mg·kg-1·d-1)、葛根素小劑量組(30 mg·kg-1·d-1)[5]，每組10只。辛伐他汀組和葛根素大、小劑量組分別灌胃給藥，模型對照組和正常對照組剩余10只大鼠灌胃等量0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續(xù)給藥4周。

1.6標(biāo)本取材與制備 各組大鼠用10%水合氯醛0.35 mL·(100 g)-1麻醉，腹主動脈取血，分離血清，-80 ℃冰箱保存，用于檢測TG、TC、LDL-C、HDL-C及TNF-α、IL-6、IL-1β等指標(biāo)；分離整根主動脈，剪取主動脈弓段血管組織，切取薄片厚度2～3 mm，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、制成切片厚度4 μm，用于蘇木精-伊紅(HE)染色，另一部主動脈組織剝離外部脂肪組織，液氮保存，用于檢測ERK1/2、p38、JNK及其磷酸化蛋白表達(dá)情況。

1.7觀測指標(biāo)

1.7.1檢測大鼠血脂水平 采用COD-PAP酶法測定各組大鼠血清TC水平，GPO-PAP酶法測定TG水平，采用直接法測定LDL-C、HDL-C水平。

1.7.2檢測大鼠血清炎性因子水平 采用ELISA法檢測各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測定各樣品吸光度值，計算血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.7.3檢測大鼠胸主動脈組織MAPK信號通路蛋白磷酸化情況 采用Western blotting法檢測各組大鼠胸主動脈組織中ERK1/2、p38、JNK及其磷酸化蛋白表達(dá)情況，具體方法如下：液氮中研磨胸主動脈組織，加入組織裂解液裂解，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加5×上樣緩沖液煮沸10 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后經(jīng)聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，ERK1/2、p38、JNK、p-ERK1/2、p-p38及p-JNK一抗(1：1000)稀釋液，室溫孵育2 h，繼以辣根酶標(biāo)記的二抗(1：5000)稀釋液室溫孵育1 h，按照ECL試劑盒說明書進(jìn)行操作，將發(fā)光液均勻地滴在PVDF膜上，反應(yīng)1 min，最后將膜放入暗室壓片成像。結(jié)果用目的蛋白的灰度值與非磷酸化蛋白的灰度值的比值表示，用Quantity One 軟件對顯影條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠胸主動脈組織病理變化 正常對照組胸主動脈組織內(nèi)膜、中膜、外膜分界明顯，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整且排列有序，中膜可見梭形平滑肌細(xì)胞，彈力纖維層結(jié)構(gòu)完整無破裂，外膜為疏松結(jié)締組織；模型對照組內(nèi)膜增厚不光滑、內(nèi)皮細(xì)胞脫落結(jié)構(gòu)不完整，中膜內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤、泡沫樣細(xì)胞，彈力纖維變性、斷裂和崩解，偶見散在鈣化灶；辛伐他汀組，葛根素大、小劑量組內(nèi)膜增厚程度較輕，內(nèi)皮細(xì)胞較為完整，中膜內(nèi)炎細(xì)胞浸潤少見、泡沫樣細(xì)胞少見(圖1)。

2.2大鼠血脂水平變化 見表1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠TC、TG、LDL-C等均顯著升高(均P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，與模型對照組比較，辛伐他汀組及葛根素大、小劑量組TC、TG、LDL-C水平均顯著降低(P<0.05)，HDL-C水平均顯著提升(P<0.05)，但均未達(dá)到正常水平；與辛伐他汀組比較，葛根素大、小劑量組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且葛根素大、小劑量組間上述指標(biāo)水平差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3大鼠血清TNF-α、IL-6和 IL-1β水平變化 見表2。與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，辛伐他汀組，葛根素大、小劑量組TNF-α、IL-6和 IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)；與辛伐他汀組比較，葛根素大、小劑量組TNF-α、IL-6和IL-1β水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且葛根素大、小劑量組間上述指標(biāo)水平亦差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4大鼠胸主動脈組織MAPKs磷酸化情況 Western blotting實驗結(jié)果顯示，各組大鼠胸主動脈組織ERK1/2、p38及JNK 3種蛋白表達(dá)情況均較為相似，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但其相應(yīng)磷酸化蛋白p-ERK1/2、p-p38及p-JNK在各組間的表達(dá)均差異較大。與正常對照組比較，模型對照組p-ERK1/2、p-p38及p-JNK蛋白表達(dá)水平顯著升高；與模型對照組比較，辛伐他汀組和葛根素大、小劑量組p-ERK1/2、p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；辛伐他汀組與葛根素大、小劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且葛根素大、小劑量組間上述指標(biāo)水平亦差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

3 討論

AS是導(dǎo)致冠心病、心肌梗死、缺血性腦卒中等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅人類健康，是引起全世界死亡率高的主要原因[6]。眾多研究認(rèn)為[7-8]，AS的形成與脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)，高脂血癥是AS發(fā)病的重要危險因素。高脂血癥可致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而促進(jìn)沉積于內(nèi)膜下LDL-C被氧化修飾成ox-LDL，巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，并伴隨血管炎癥、平滑肌細(xì)胞增殖、血管鈣化及斑塊形成[9]。為了更好地應(yīng)用于臨床，本研究采用腹腔注射VD3聯(lián)合高脂飼料誘導(dǎo)大鼠AS模型，結(jié)果顯示，模型對照組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C等血脂指標(biāo)水平顯著異于正常對照組；HE染色結(jié)果顯示，模型對照組大鼠胸主動脈內(nèi)膜增厚、內(nèi)皮細(xì)胞受損，中膜內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、泡沫樣細(xì)胞多見，彈力纖維變性、斷裂和崩解，偶見散在鈣化灶。以上結(jié)果與文獻(xiàn)[10-11]報道一致，表明大鼠AS模型復(fù)制成功。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.葛根素小劑量組；E.葛根素大劑量組。

表1 5組大鼠血清血脂水平比較

Tab.1 Comparison of serum lipid levels among five groups of rats

表1 5組大鼠血清血脂水平比較

組別TCTG正常對照組1.55±0.080.96±0.09模型對照組6.52±0.44①5.23±0.11①辛伐他汀組4.24±0.13②4.33±0.20②葛根素 小劑量組4.30±0.15②4.33±0.15② 大劑量組4.27±0.12②4.31±0.16②組別LDL-CHDL-C正常對照組0.74±0.120.65±0.06模型對照組4.34±0.26①0.32±0.04①辛伐他汀組3.15±0.15②0.45±0.05②葛根素 小劑量組3.20±0.23②0.42±0.04② 大劑量組3.19±0.22②0.43±0.04②

①與正常對照組比較，t=7.022～9.365，P<0.05；②與模型對照組比較，t=7.694～11.215，P<0.05。

①Compared with normal control group，t=7.022-9.365，P<0.05；②compared with model control group，t=7.694-11.215，P<0.05.

他汀類藥物是目前廣泛應(yīng)用于臨床及動物實驗的基礎(chǔ)降脂藥，其可降低TC、TG、LDL-C水平、升高HDL-C水平，并可改善血管內(nèi)皮功能，減輕炎癥反應(yīng)，降低粥樣斑塊內(nèi)膽固醇及ox-LDL水平、減輕血栓形成等[5，12]。辛伐他汀是他汀類藥物中經(jīng)典藥物，故本研究以其作為陽性對照藥，觀察葛根素對AS大鼠血脂代謝的影響。本研究結(jié)果顯示，辛伐他汀、葛根素均可顯著降低AS大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，顯著提升血清HDL-C水平，且葛根素調(diào)節(jié)血脂作用與辛伐他汀顯著不明顯。

表2 5組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平比較

Tab.2 Comparison of the serum levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β among five groups of rats

表2 5組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平比較

組別TNF-αIL-6 IL-1β正常對照組80.56±6.2440.16±2.3010.36±0.98模型對照組133.52±10.13①60.78±5.90①25.21±2.06①辛伐他汀組98.45±9.41②50.77±4.21②13.65±1.42②葛根素 小劑量組100.19±8.58②50.76±2.32②13.51±1.54② 大劑量組101.74±9.20②48.49±3.84②12.35±1.30②

①與正常對照組比較，t=7.502～11.381，P<0.05；②與模型對照組比較，t=6.308～13.213，P<0.05。

①compared with normal control group，t=7.502-11.381，P<0.05；②compared with model control group，t=6.308-13.213，P<0.05.

越來越多的研究表明[13]，炎癥參與AS的發(fā)生與發(fā)展，炎性因子和免疫細(xì)胞參與了AS的病理生理過程。AS斑塊處的T淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞可過度分泌IL-6、TNF-α及IL-1β等炎性細(xì)胞因子，作為炎癥和免疫反應(yīng)的重要遞質(zhì)，上述炎性細(xì)胞因子可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)和釋放，增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性[5，14]，并可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及血栓形成，最終導(dǎo)致AS形成和斑塊不穩(wěn)定[15-16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS模型大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著升高，使用葛根素干預(yù)處理后，各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著降低。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.葛根素小劑量組；E.葛根素大劑量組；①與正常對照組比較，t=8.011～13.214，P<0.05；②與模型對照組比較，t=7.562～12.383，P<0.05。

MAPKs是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分為ERK、JNK和p38 MAPK三類，是將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)所需的一類重要信號系統(tǒng)，在多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16]。MAPK信號通路在未受刺激時，處于靜止?fàn)顟B(tài)，受到炎性刺激時，p38、ERK1/2和JNK可經(jīng)上下游激酶刺激，發(fā)生級聯(lián)磷酸化而激活，參與細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等細(xì)胞過程的調(diào)控[17-18]。因此，檢測組織細(xì)胞p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平，可反映MAPK信號通路激活情況。本研究采用Western blotting法檢測大鼠胸主動脈中p38、ERK1/2和JNK等蛋白磷酸化情況，結(jié)果顯示，AS大鼠胸主動脈組織p-ERK1/2、p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)均顯著增加，表明AS病理進(jìn)程中涉及到MAPK信號通路的激活；而葛根素可顯著抑制MAPK信號通路中上述相關(guān)蛋白磷酸化，且其效果與辛伐他汀相似。提示葛根素抗AS作用機(jī)制可能與抑制MAPK信號通路激活有關(guān)。

綜上所述，大鼠AS病理狀態(tài)下，血脂代謝異常，血清TNF-α、IL-6等炎性因子水平升高。葛根素可有效調(diào)節(jié)TC、TG、LDL-C、HDL-C等異常變化的血脂指標(biāo)水平，降低AS大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平，并可抑制AS大鼠胸主動脈組織MAPK信號通路中上述相關(guān)蛋白磷酸化，抑制p-ERK1/2、p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)。以上結(jié)果說明，葛根素能夠通過調(diào)節(jié)血脂、降低血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平來發(fā)揮抗AS作用，而機(jī)制可能與抑制MAPK信號通路激活有關(guān)。而上述作用機(jī)制可能僅僅是一方面，有關(guān)葛根素對AS大鼠治療作用的深入機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。