孔維愷忻，鄢尤奇，蔡文康，胡 新△

(北京大學藥學院1. 藥理學系，2. 藥劑學系，3. 化學生物學系，北京 100191)

姜黃素是一種多酚類物質(zhì)，存在于眾多姜科姜黃屬植物中，如姜黃、莪術、郁金等。大量實驗表明，姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、改善免疫功能、治療糖尿病等諸多藥理作用，應用前景十分廣闊[1-3]。但研究人員通過對姜黃素藥動學的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素不溶于水，體內(nèi)吸收差，易代謝[4]，所以在進一步的研究中需要思考如何合理地提高姜黃素在水中的溶解度，促進機體吸收。萬紅等[5]對不同的姜黃素增溶方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)以聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)為載體制備的固體分散體具有較好的增溶作用，但仍然具有藥物分散狀態(tài)穩(wěn)定度不高等缺點。此外，很多研究人員也使用了表面活性劑的復配體系對姜黃素進行增溶[6-8]。不同性質(zhì)的表面活性劑之間具有協(xié)同效應，常常具有“1+1>2”的效果，表面活性劑之間的復配有降低使用成本、提高應用性能等優(yōu)點。劉調(diào)調(diào)等[8]使用十二烷基三甲基溴化銨(dodecyltrime-thylammonium bromide，DTAB)和吐溫80兩種表面活性劑的復配體系對姜黃素進行增溶實驗，取得了不錯的結果，但陽離子表面活性劑存在毒性高、生物相容性差等缺點。相關研究表明，吐溫等非離子表面活性劑可以通過氫鍵與H2O以及H3O+結合，從而使得非離子表面活性劑帶有部分正電性，所以相同條件下的陰離子表面活性劑與非離子表面活性劑的相互作用明顯強于陽離子表面活性劑與非離子表面活性劑的相互作用[9]。而在應用于藥物制劑的陰離子表面活性劑中，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)目前應用廣泛，常常作為輔料加入到藥劑之中，可被用于藥物增溶和穩(wěn)定過程中[10-11]，相關的理論已經(jīng)較為成熟。非離子表面活性劑吐溫20在對姜黃素的增溶作用中也表現(xiàn)出了較好的實驗結果[12-13]，具有較大的實際應用價值。所以，本研究采用SDS與吐溫20進行復配，對不同比例的復配表面活性劑體系的姜黃素增溶和保護作用進行探究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

所用試劑包括：吐溫20(分析純，天津市福晨化學試劑廠，生產(chǎn)批號：20180501)、姜黃素(分析純，北京偶合科技，生產(chǎn)批號：20181003)、SDS(分析純，天津市福晨化學試劑廠，生產(chǎn)批號：20180220)、氫氧化鈉(分析純，北京化工廠，生產(chǎn)批號：20180216)、無水乙醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，生產(chǎn)批號：20180401)、反式-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸(反式阿魏酸，純度99.73%，畢得醫(yī)藥，生產(chǎn)批號：RNL241)、4-羥基-3-甲氧基苯甲醛(香草醛，純度99.00%，畢得醫(yī)藥，生產(chǎn)批號：AGZ34)。

所用儀器包括：10 mL注射器(BioDee，生產(chǎn)批號：20180215)、水系0.45 μm針頭濾器(NAVIGATOR，生產(chǎn)批號：20180103)、UV1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)、盧湘儀TDZ5WS臺式離心機、上海馳久MYP11-2A恒溫磁力攪拌器、精密pH試紙。

1.2 實驗方法

1.2.1臨界膠束濃度的計算 表面活性劑在臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)處會形成膠束，從而對藥物起到良好的增溶和保護作用，查閱相關文獻可知，吐溫20和SDS在20 ℃的臨界膠束濃度分別為0.11 mmol/L和6.94 mmol/L[9,14]。二者不同摩爾比例的復配表面活性劑的臨界膠束濃度可依據(jù)Clints方程進行計算[15]，如式(1)所示：

(1)

其中，n1為第一種表面活性劑所占的摩爾分數(shù)，n2為第二種表面活性劑所占摩爾分數(shù)，CMC1為該溫度下第一種表面活性劑的臨界膠束濃度，CMC2為該溫度下第二種表面活性劑的臨界膠束濃度，CMC為表面活性劑復配體系的臨界膠束濃度。下述實驗操作均在20 ℃下進行。

1.2.2姜黃素濃度標準曲線的測定 姜黃素的分子結構式如圖1所示。由于姜黃素具有較多的共軛結構，所以其具有較強的紫外吸收。以無水乙醇作為溶劑，首先進行姜黃素溶液的全波長掃描，確定最大吸收波長，分別配置一定濃度梯度的姜黃素溶液，在最大吸收波長下分別測定光密度，根據(jù)最小二乘法，使用光密度對姜黃素濃度進行一元一次回歸，標準曲線中若R2值大于0.995[16]，則標準曲線可以用于后續(xù)實驗中。

圖1 吐溫20、十二烷基硫酸鈉和姜黃素的分子結構式

1.2.3對姜黃素增溶作用的測定 相關文獻表明，在可形成膠束的表面活性劑增溶實驗中，表面活性劑的濃度與增溶藥物濃度呈正相關關系，相關系數(shù)稱為摩爾增溶比(molar solubilization ratio，MSR)[17]，如式(2)所示：

(2)

其中,C1、C2均為大于臨界膠束濃度的表面活性劑濃度，x1、x2為對應的增溶藥物濃度。先配制遠高于臨界膠束濃度的表面活性劑復配水溶液(SDS所占摩爾比例分別為0%、40%、60%、80%)各25 mL，在其中加入過量的姜黃素粉末，37 ℃振蕩搖勻72 h后10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm濾膜，使用二次蒸餾水稀釋，測定光密度，換算為姜黃素濃度，姜黃素濃度(mmol/L)為因變量，表面活性劑濃度(mmol/L)為自變量進行一元一次回歸，求出直線斜率即為MSR數(shù)值。

1.2.4對姜黃素保護作用的測定 相關研究表明，溫度對姜黃素的穩(wěn)定性影響不大[18]，且pH<5時姜黃素不易分解，但當溶液的pH值升高，姜黃素的降解速率明顯加快，而且不同pH條件下姜黃素最大吸收峰會發(fā)生偏移。用NaOH把溶液的pH值控制在13。先進行全波長掃描，找到姜黃素的最大吸收峰，并測定姜黃素在不添加表面活性劑的情況下紫外吸收強度隨時間的變化。之后配制遠高于臨界膠束濃度的表面活性劑復配水溶液(SDS所占摩爾比例分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%)各25 mL，以無水乙醇作溶劑配制飽和姜黃素母液1 mL，將母液離心取上清液，過0.45 μm濾膜，每組表面活性劑復配水溶液中各加100 μL姜黃素母液，混合均勻后立即在最大吸收峰處開始測定光密度，每40 min測定一次，持續(xù)3 h。由文獻可知，姜黃素的降解過程嚴格符合一級動力學過程[8,19]，故以姜黃素濃度(mmol/L)的對數(shù)值作因變量，時間(min)為自變量進行擬合，求出降解速率常數(shù)k。

1.2.5姜黃素降解產(chǎn)物的干擾 查閱相關文獻可知，姜黃素在堿性條件下發(fā)生分解時，直接生成香草醛(vanillin)和反式阿魏酸(trans-ferulic acid)[20]。為排除在姜黃素分解過程中所生成的降解產(chǎn)物的干擾，本研究測定了在pH=13條件下的0.05 mol/L的香草醛溶液的紫外吸收曲線和反式阿魏酸紫外吸收曲線，并與姜黃素溶液紫外吸收曲線進行比較。

2 結果與討論

2.1 姜黃素的標準曲線

經(jīng)過全波長掃描，pH=7的條件下姜黃素在423 nm處取得最大的紫外吸收，在該波長下進行姜黃素標準曲線的相關實驗。姜黃素標準曲線如圖2所示，其中R2=0.996 6，可以將該標準曲線運用至后續(xù)實驗姜黃素濃度計算過程中。

2.2 對姜黃素的增溶作用

復配表面活性劑對姜黃素的增溶結果如表1和圖3所示。MSR數(shù)值隨著SDS的比例降低而單調(diào)上升。由于吐溫20比SDS的臨界膠束濃度小，更易形成膠束，所以當兩種表面活性劑進行復配時，隨著吐溫20的比例增加，復配膠束更易形成，增溶的效果更好，增溶效果的提升并非隨著吐溫20比例增加而均勻變化，可以看出當SDS的摩爾分數(shù)為50%左右時，MSR數(shù)值變化較快?？赡艿脑蚴窃谀柗謹?shù)50%前后膠束的主體發(fā)生了改變，一方面由于SDS帶負電，導致當SDS為主體時解離的帶有負電的姜黃素陰離子更多地存在于膠束的內(nèi)核而非柵欄層中，另一方面由于SDS和吐溫20分子大小的差異，膠束的體積可能在這一過程中發(fā)生了顯著的變化[21]。相關研究表明，在表面活性劑的復配體系中，陰離子表面活性劑往往比陽離子表面活性劑對膠束的體積產(chǎn)生更大的影響[22]?？偟膩碚f，在SDS-吐溫20的復配體系中，保持SDS的摩爾分數(shù)小于40%，將會得到比較良好的增溶效果。

圖2 姜黃素的標準曲線

表1 復配表面活性劑對姜黃素的增溶作用

圖3 復配表面活性劑對姜黃素的增溶作用

2.3 對姜黃素的保護作用

在pH=13條件下，姜黃素溶液全波長掃描結果如圖4所示，可見最大吸收峰在471 nm處，相比pH=7條件下發(fā)生了紅移，這可能與姜黃素離子與SDS陰離子以及OH-的相互作用有關[23]。

本研究在471 nm處進行了復配表面活性劑對姜黃素保護作用的相關實驗，如表2所示，k值越小，姜黃素降解速率越小，說明表面活性劑對姜黃素的保護作用越強。在不添加表面活性劑時，k=0.005 3，表明此時表面活性劑并未對姜黃素起到有效的保護作用，與文獻相關結果一致[24]，可能的原因是姜黃素在堿性條件下具有還原性[25]，易被氧化，而吐溫20在堿性條件下可能會發(fā)生水解，與姜黃素發(fā)生取代反應，從而減少了姜黃素的含量。吐溫20雖然能夠?qū)S素有良好的增溶作用，但是對姜黃素并沒有良好的保護作用，這也說明了使用復配表面活性劑體系對姜黃素同時進行增溶和保護的合理性。隨著SDS比例的增大，復配表面活性劑對膠束的保護作用逐漸增強，但當SDS所占比例為100%時，保護作用反而有所降低，可能的原因是此時臨界膠束濃度要遠遠大于其他情況，膠束形成數(shù)量更少，姜黃素溶解較少，并且有大量的姜黃素陰離子處于膠束之外，與水溶液中的OH-接觸更加密切,從而發(fā)生分解[26]。相比較而言，在其他情況下，由于SDS帶負電荷，姜黃素也帶負電荷，靜電相互作用下姜黃素陰離子更多地處于膠束的內(nèi)核之中，能夠避免與溶液中其他離子相互接觸，從而起到了較好的保護作用。膠束的存在也能夠使得姜黃素的分布更加均一，性質(zhì)更加穩(wěn)定。從圖5中可以看出，姜黃素的降解產(chǎn)物反式阿魏酸和香草醛在pH=13條件下的紫外吸收的最大吸收波長明顯小于471 nm。二種化合物的水溶液的濃度均為0.05 mol/L，遠高于保護作用測定過程中姜黃素的濃度，在這種情況下反式阿魏酸和香草醛在471 nm的光密度分別為0.018和0.016，所以二者的存在并不會對該實驗產(chǎn)生較大干擾。

圖4 pH=13條件下姜黃素的紫外光譜

表2 復配表面活性劑對姜黃素的保護作用

圖5 pH=13條件下姜黃素降解產(chǎn)物(0.05 mol/L)的紫外光譜

總的來說，當SDS所占摩爾分數(shù)為80%時，復配體系能夠產(chǎn)生對姜黃素較好的保護作用。如果綜合考慮SDS和吐溫20表面活性劑復配體系對于姜黃素的增溶作用和保護作用，那么使得SDS的摩爾分數(shù)為40%將會有不錯的結果，此時的增溶效果接近完全使用吐溫20的效果，摩爾增溶比MSR=0.024 3，而降解速率也得到了有效的降低，降解速率常數(shù)k=0.003 7。

綜上，在陰離子表面活性劑SDS和非離子表面活性劑吐溫20復配體系中，姜黃素的溶解度得到了提升，pH=13條件下降解速率有所下降。隨著SDS所占摩爾分數(shù)的降低，復配體系對姜黃素的增溶作用效果持續(xù)增強，而對于保護作用而言，SDS在保護作用中是關鍵因素，SDS具有較高比例時，保護作用較強，當SDS占摩爾分數(shù)80%時，姜黃素降解速率得到了實驗結果中最大程度的降低。從總體來說，綜合考慮增溶作用和保護作用二者時，當SDS摩爾分數(shù)為40%，復配體系對于姜黃素具有較優(yōu)的增溶和保護作用。