駱池怡，彭楚芳，楊 媛，秦 滿，王媛媛

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，兒童口腔科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

乳牙樹脂粘接修復(fù)是兒童口腔臨床最常規(guī)的治療之一，然而針對不同粘接系統(tǒng)對乳牙的粘接作用研究較少[1-4]。就乳牙樹脂粘接修復(fù)治療而言，操作步驟簡便、受唾液污染影響小的粘接劑更為適用，自酸蝕粘接劑在這一點(diǎn)上契合臨床需求。對自酸蝕粘接劑的研究大多集中在恒牙，對乳牙粘接性能的研究結(jié)論尚無統(tǒng)一定論[5-10]，本研究將比較3種臨床上常見的自酸蝕粘接劑在乳牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)粘接的表現(xiàn)，同時分析粘接界面老化后粘接強(qiáng)度的改變。

低齡兒童樹脂粘接治療過程中術(shù)野隔濕是一大難題，發(fā)生長時間或大量的唾液污染的情況下要求重新預(yù)備粘接界面進(jìn)行再次粘接處理[11-12]。然而在有效隔濕情況下發(fā)生的一過性唾液污染如何處理尚無定論，Santschi等[5]發(fā)現(xiàn)粘接劑固化后發(fā)生唾液污染時即刻吹干，可恢復(fù)通用型粘接劑的即刻粘接強(qiáng)度。本研究將模擬粘接劑光固化后一過性唾液污染并即刻吹干的處理方法，評估不同自酸蝕粘接劑粘接強(qiáng)度的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將實(shí)驗(yàn)組依據(jù)不同的自酸蝕系統(tǒng)分為兩步法自酸蝕粘接劑Clearfil SE Bond(SE 組，Kuraray Noritake Dental公司, 日本)、一步法自酸蝕粘接劑AdperTMEasy One (EO組，3M ESPE公司，美國)和通用型粘接劑Scotchbond Universal (SBU組，3M Deutschland公司，德國)3組。對照組采用AdperTMSingle Bond Plus(SL組，3M ESPE公司，美國)全酸蝕(格魯瑪酸蝕劑，Heraeus公司，德國)粘接系統(tǒng)。充填樹脂為復(fù)合樹脂Z250(A2色，3M ESPE公司，美國)。

根據(jù)操作說明書，4種粘接系統(tǒng)的操作簡述如下：SE組：干燥牙齒粘接界面上均勻涂布預(yù)處理劑靜置20 s，氣槍吹干5 s，涂布粘接劑后輕輕吹勻，光照固化10 s。EO組：牙齒粘接界面加壓涂抹粘接劑15 s，氣槍吹干直至粘接面無液體殘留，光照固化10 s。SBU組：保持粘接界面干燥，加壓涂抹粘接劑20 s，輕輕吹薄粘接界面5 s，光照固化10 s。SL組：酸蝕劑酸蝕粘接界面15 s，用三用槍水汽沖洗10 s，吹干界面，輕輕加壓涂抹粘接劑15 s，氣槍吹干5 s，光照固化10 s。

1.2 唾液的采集

為了模擬臨床上唾液污染的模式，且減少樣本間的差異，每次采集同一個人在上午8點(diǎn)至9點(diǎn)之間空腹時的非刺激性唾液，并立即直接應(yīng)用。

1.3 試樣的制備

本研究通過了北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批件號：PKUSSIRB-201839145)。共收集了150顆臨床因乳牙滯留拔除或自然脫落的無齲/淺齲乳牙，牙位包括乳切牙、乳尖牙和乳磨牙，用0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯胺水溶液(氯胺T粉，中國源葉生物公司)清潔和消毒后，儲存在4 ℃蒸餾水中，6個月內(nèi)使用。

乳磨牙的牙冠沿牙長軸方向使用慢速切割機(jī)(Buehler Iso MetⅡ-1180-250，Buehler公司, 美國)切割，獲得頰、舌、近中、遠(yuǎn)中4個部分，每個乳磨牙可制成4個試樣[13]，對乳前牙不做額外切割，所有試樣均在體視顯微鏡下以40倍的放大倍數(shù)仔細(xì)檢查是否完好。

將試樣的待粘接面倒置于模具底，加入自凝樹脂(新世紀(jì)公司，中國)包埋，脫模后得到240個僅暴露待粘接面的圓柱形釉質(zhì)試樣塊。用600目碳化硅水砂紙打磨待粘接面15 s，以獲得平坦的釉質(zhì)表面。牙本質(zhì)試樣的制備方法相似，需打磨待粘接面至牙本質(zhì)層，并用600目碳化硅水砂紙拋光15 s[14]。

根據(jù)不同的粘接系統(tǒng)(自酸蝕粘接劑： SE、EO、SBU；對照組全酸蝕粘接劑：SL)，兩種污染狀態(tài)(無或有唾液污染)以及兩種儲存條件，將240個乳牙釉質(zhì)試樣和240個牙本質(zhì)試樣均隨機(jī)分為16組(n=15個/組)。

按第1.1小節(jié)中描述的操作方法應(yīng)用粘接劑后，無唾液污染組的試樣使用內(nèi)徑2.0 mm、高2.0 mm的標(biāo)準(zhǔn)模具堆塑復(fù)合樹脂，并從頂部光固化20 s。有唾液污染組的試樣在應(yīng)用粘接劑光固化后，粘接界面上滴加6 μL的唾液，靜置5 s后以相同的氣壓吹干，再行樹脂堆塑，模具建樣過程見圖1。

A, the applied adhesive system for setting up the bonding sample; B, a drop of saliva (6 μL) placed on the defined bonding area to establish the contaminated sample.

1.4 儲存條件

粘接即刻組：37 ℃蒸餾水中儲存24 h；老化處理組：37 ℃蒸餾水中儲存24 h后，在5 ℃和55 ℃水浴中循環(huán)5 000次，每一水浴中停留30 s。

1.5 剪切強(qiáng)度測試和斷裂模式

將粘接試件固定于萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)(Instron 3367型，Instron公司, 美國)， 加載方向平行于粘接面，加載速度1 mm/min，記錄粘接界面開裂時的最大載荷力，并計算剪切強(qiáng)度[最大載荷力(N)/粘接面積(mm2)]。

體視顯微鏡下(40倍)評估斷裂模式，可分為粘接劑內(nèi)斷裂、牙體組織斷裂、復(fù)合樹脂內(nèi)斷裂和混合斷裂(前三種失敗模式的任意組合)。

1.6 掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察

每組取3個試樣，垂直于粘接界面切割開，待觀察面依次使用400、600、1 000和2 000目碳化硅水砂紙進(jìn)行拋光，再用37%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的磷酸酸蝕待觀察面10 s，沖洗30 s后浸入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))次氯酸鈉溶液中2 min[15]，在70%、80%、90%、99%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中系列脫水各5 min[16]。噴金后于SEM(JEOL JSM-7900F，JEOL公司，日本)下觀察粘接界面[17]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。用三因素方差分析法分析不同粘接系統(tǒng)、唾液污染和儲存條件對剪切強(qiáng)度的影響，以及這三個因素間的相互作用，采用Tukey-Kramer檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 乳牙牙釉質(zhì)粘接

2.1.1剪切粘接強(qiáng)度 三因素方差分析結(jié)果顯示，粘接系統(tǒng)(F=72.88,P<0.001)和唾液污染(F=51.61,P<0.001)對乳牙釉質(zhì)的剪切強(qiáng)度均有顯著影響，粘接系統(tǒng)與唾液污染間的相互作用差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.92,P= 0.010)。儲存條件對乳牙釉質(zhì)的剪切強(qiáng)度沒有顯著影響(F=0.00,P= 0.952，表1)。Tukey檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，全酸蝕粘接劑SL組無污染條件下的即刻剪切粘接強(qiáng)度為(28.92±1.83) MPa，唾液污染條件下的即刻剪切粘接強(qiáng)度為(26.14±5.17) MPa，顯著高于3種自酸蝕粘接劑，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。無污染條件下3種自酸蝕粘接劑的即刻粘接強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)差異。EO有污染組的即刻剪切粘接強(qiáng)度為(11.88±3.17) MPa，顯著低于其無污染組的即刻剪切粘接強(qiáng)度(19.57±3.89 MPa)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。全酸蝕粘接劑SL組無污染老化后剪切粘接強(qiáng)度為(27.27±3.03) MPa，有污染老化后剪切粘接強(qiáng)度為(24.86±5.41) MPa，顯著高于3種自酸蝕粘接劑，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。EO組有污染老化后剪切粘接強(qiáng)度為(11.90±3.98) MPa，顯著低于其無污染的老化后剪切粘接強(qiáng)度(19.01±5.03) MPa和SE組有污染的老化后剪切粘接強(qiáng)度(17.72±4.13) MPa，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.1.2斷裂模式 對乳牙釉質(zhì)，SE、EO和SBU組的主要斷裂模式是粘接劑內(nèi)斷裂，SL組的主要斷裂模式是釉質(zhì)內(nèi)斷裂(圖2)。

2.1.3SEM觀察 SEM結(jié)果顯示SL、SE和SBU的粘接即刻及老化處理組中，一過性唾液污染即刻吹干處理后，復(fù)合樹脂及牙釉質(zhì)之間仍粘接緊密，未見裂隙。EO組中，一過性唾液污染即刻吹干處理后，在即刻組中的粘接界面可觀察到明顯的裂隙(圖3)。

2.2 乳牙牙本質(zhì)粘接

2.2.1剪切粘接強(qiáng)度 三因素方差分析結(jié)果為：粘接系統(tǒng)(F=32.56,P<0.001)和唾液污染(F=20.72,P<0.001)對乳牙牙本質(zhì)的剪切強(qiáng)度均有顯著影響，粘接系統(tǒng)與儲存條件之間的相互作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.97，P<0.001)。儲存條件對乳牙牙本質(zhì)的剪切強(qiáng)度沒有顯著影響(F=1.60，P= 0.207，表2)。Tukey檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EO組有污染的即刻剪切粘接強(qiáng)度(12.99±2.66) MPa顯著低于其無污染的即刻剪切粘接強(qiáng)度(18.63±3.61) MPa，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。全酸蝕粘接劑SL組無污染老化后的剪切粘接強(qiáng)度為(14.31±1.97) MPa，有污染老化后的剪切粘接強(qiáng)度為(12.83±4.03) MPa，顯著低于3種自酸蝕粘接系統(tǒng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。EO組無污染老化后剪切粘接強(qiáng)度為(14.41±2.68) MPa，顯著低于SE無污染組的老化后剪切粘接強(qiáng)度(21.10±4.40) MPa和SBU無污染組的老化后剪切粘接強(qiáng)度(22.27±5.43) MPa，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。EO組有污染老化后剪切粘接強(qiáng)度為(10.93±2.18) MPa，顯著低于SE組有污染老化后剪切粘接強(qiáng)度(19.56±3.64) MPa和SBU組有污染老化后剪切粘接強(qiáng)度(20.60±5.11) MPa，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 乳牙釉質(zhì)剪切強(qiáng)度結(jié)果的三因素方差分析

I, initial; T, thermal cycling; N, non-contaminated; C, contaminated; SL, AdperTM Single Bond Plus; SE, Clearfil SE Bond; EO, AdperTM Easy One; SBU, Scotchbond Universal.

2.2.2斷裂模式 對乳牙牙本質(zhì)，SL和EO組的主要斷裂模式是粘接劑內(nèi)斷裂，SE和SBU組的主要斷裂模式是牙本質(zhì)內(nèi)斷裂(圖4)。

2.2.3SEM觀察 SEM結(jié)果顯示，SL和SE的各組中，牙本質(zhì)小管內(nèi)有致密的樹脂突，長度超過50 μm；SBU的各組中，牙本質(zhì)小管內(nèi)樹脂突長度超過50 μm，但密集程度較SL和SE組低。在這3種粘接劑的粘接即刻及老化處理組中，一過性唾液污染后，可觀察到復(fù)合樹脂及牙本質(zhì)之間仍粘接緊密，未見裂隙。EO組中，牙本質(zhì)小管內(nèi)樹脂突較細(xì)短，且稀疏；一過性唾液污染后，在即刻組中的粘接界面可觀察到明顯的裂隙(圖5)。

A, B, resin-enamel interfaces with salivary contamination were observed by SEM after 5 000 thermal cycles in 5 ℃ and 55 ℃, representative SEM images of SL group at magnifications of ×500 and ×1 500; C, D, representative SEM images of SE group at magnifications of ×500 and ×1 500; E, F, representative SEM images of EO group at magnifications of ×500 and ×1 500; G, H, representative SEM images of SBU group at magnifications of ×500 and ×1 500. SL, AdperTM Single Bond Plus; SE, Clearfil SE Bond; EO, AdperTM Easy One; SBU, Scotchbond Universal; SEM, scanning electron microscope.

表2 乳牙牙本質(zhì)剪切強(qiáng)度結(jié)果的三因素方差分析

I, initial; T, thermal cycling; N, non-contaminated; C, contaminated; SL, AdperTM Single Bond Plus; SE, Clearfil SE Bond; EO, AdperTM Easy One; SBU, Scotchbond Universal.

3 討論

在研究樣本建立過程中，獲得釉質(zhì)研究試樣后進(jìn)行少量打磨，主要是為了消除釉質(zhì)表面污染對于實(shí)驗(yàn)的不良影響，同時也符合臨床實(shí)際操作流程。微拉伸測試的斷裂模式分為粘接劑的破壞即粘接界面斷裂、牙體組織斷裂、樹脂內(nèi)聚破壞導(dǎo)致的樹脂斷裂，以及這幾種方式的混合破壞。本實(shí)驗(yàn)中最主要的界面斷裂模式為粘接界面斷裂，這提示了數(shù)據(jù)更高的可信度[18]。

根據(jù)既往研究方法，本研究采用全酸蝕粘接劑作為對照，用于評估被測試粘接劑的粘接性能[2-3]。Silverstone等[19]和Sumikawa等[20]發(fā)現(xiàn)釉質(zhì)表面經(jīng)磷酸處理后會產(chǎn)生Silverstone Ⅱ型樣式，可提供更強(qiáng)的粘接力。本研究再次證實(shí)，全酸蝕粘接系統(tǒng)為乳牙釉質(zhì)提供了更強(qiáng)的粘接力，并認(rèn)為主要?dú)w因于35%(體積分?jǐn)?shù))磷酸(pH = 0.6)的酸度高于SE(pH = 2.0)、EO(pH = 2.4)和SBU(pH = 2.7)，可與釉質(zhì)形成更大的表面微鎖結(jié)力。

對于乳牙牙本質(zhì)粘接，本研究發(fā)現(xiàn)被稱作“金標(biāo)準(zhǔn)”的自酸蝕粘接劑SE和通用型粘接劑SBU(以自酸蝕模式使用)的粘接性能優(yōu)于一步法自酸蝕粘接劑EO和全酸蝕粘接劑SL。大多數(shù)自酸蝕粘接劑中含有一種以上可產(chǎn)生化學(xué)粘接的功能性單體，SE和SBU中含有10-甲基丙烯酰氧基癸基磷酸二氫鹽，EO和SBU中還含有甲基丙烯酸酯改性的聚鏈烯酸共聚物[2]。既往研究顯示，10-甲基丙烯酰氧基癸基磷酸二氫鹽能夠增加自酸蝕粘接劑對乳牙牙本質(zhì)的粘接耐久性[10]。本研究中EO對牙本質(zhì)的粘接耐久性不夠理想可能的原因有：(1)乳牙牙本質(zhì)小管的直徑與恒牙相近，但密度高于恒牙[21-22]，粘接時易受到牙本質(zhì)小管液滲出的影響。甲基丙烯酸羥乙酯作為粘接劑中常用的一種溶劑，可以改善牙本質(zhì)表面的潤濕性，但高濃度的甲基丙烯酸羥乙酯會限制水分的蒸發(fā)，從而降低粘接強(qiáng)度[9]。EO含有較高濃度的甲基丙烯酸羥乙酯，Werle等[23]發(fā)現(xiàn)，延長粘接劑的吹干時間可增加EO的粘接強(qiáng)度。(2)在含有高濃度甲基丙烯酸羥乙酯的粘接劑固化后，牙本質(zhì)小管液仍可通過滲透作用進(jìn)入粘接界面，增加水潴留，使粘接界面易發(fā)生水解[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)水浴循環(huán)后EO的剪切粘接強(qiáng)度較SE和SBU低，這也與Pragasam等[25]的研究一致，即一步法自酸蝕粘接劑對乳牙的封閉性能不及兩步法自酸蝕粘接劑。雖然SBU以自酸蝕模式使用時也為一步法操作，但其粘接性能和兩步法的SE相當(dāng)。

乳牙牙本質(zhì)的礦物質(zhì)含量低于恒牙[26]，粘接混合層也會更快發(fā)生降解[8, 21]。采用全酸蝕粘接系統(tǒng)時，酸蝕深度與粘接劑滲入深度不一致，導(dǎo)致混合層下方的膠原蛋白原纖維暴露，使這一部分更易發(fā)生降解，降低粘接耐久性[27]，因此，當(dāng)臨床上進(jìn)行深齲治療時，用兩步法自酸蝕粘接劑SE或通用型粘接劑SBU來處理牙本質(zhì)可以獲得更好的粘接耐久性。結(jié)合全酸蝕粘接系統(tǒng)對乳牙釉質(zhì)的良好粘接效果和封閉作用，可在窩洞的釉質(zhì)邊緣選擇適當(dāng)預(yù)備斜面，并使用磷酸選擇性酸蝕[25]。

A, B, resin-dentin interfaces with salivary contamination were observed by SEM after 5 000 thermal cycles in 5 ℃ and 55 ℃, representative SEM images of SL group at magnifications of ×500 and ×1 500; C, D, representative SEM images of SE group at magnifications of ×500 and ×1 500; E, F, representative SEM images of EO group at magnifications of ×500 and ×1 500; G, H, representative SEM images of SBU group at magnifications of ×500 and ×1 500. SL, AdperTM Single Bond Plus; SE, Clearfil SE Bond; EO, AdperTM Easy One; SBU, Scotchbond Universal; SEM, scanning electron microscope.

低齡兒童行樹脂充填治療時，即便做到了有效隔濕，仍可出現(xiàn)粘接劑固化后唾液短暫污染粘接界面的情況。目前，對于這種輕度唾液污染的處理方式尚無共識。由于低齡兒童配合程度低，需要短時且有效的處理方式，本研究模擬了發(fā)生輕度唾液污染的臨床情況，并測試了不同的粘接系統(tǒng)在使用簡單的去污染方式(即刻吹干)后的剪切粘接強(qiáng)度，結(jié)果顯示粘接劑光固化后發(fā)生輕度唾液污染，即刻吹干可以恢復(fù)SL、SE和SBU的粘接耐久性，EO的粘接性能受唾液污染的影響較大，SEM結(jié)果顯示其粘接界面上出現(xiàn)明顯的裂隙。

此外，本研究將唾液污染、粘接系統(tǒng)以及儲存條件作為變異因素進(jìn)行三因素方差分析，發(fā)現(xiàn)對于乳牙釉質(zhì)組，粘接系統(tǒng)與唾液污染之間存在交互作用，說明乳牙釉質(zhì)剪切強(qiáng)度在受粘接系統(tǒng)影響的同時，唾液污染也是交互影響因素；對于乳牙牙本質(zhì)組，粘接系統(tǒng)與儲存條件之間存在交互作用，說明乳牙牙本質(zhì)剪切強(qiáng)度在受粘接系統(tǒng)影響的同時，樣本儲存條件是粘接系統(tǒng)作用的交互影響因素。

綜上，通過本研究發(fā)現(xiàn)全酸蝕粘接劑對乳牙釉質(zhì)粘接耐久性更佳，與EO相比，SE和SBU更適用于乳牙牙本質(zhì)粘接。粘接劑光固化后發(fā)生粘接界面輕度唾液污染，采取即刻吹干的方式不會影響SE和SBU的粘接耐久性。