張勝男，安 娜，歐陽(yáng)翔英△，劉穎君，王雪奎

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，1.牙周科，2.綜合二科 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

牙周炎是由菌斑微生物引起的牙齒周?chē)С纸M織的慢性感染性疾病，最終導(dǎo)致牙周膜纖維破壞、臨床附著喪失及牙槽骨吸收。牙周組織再生是具有分化潛能的細(xì)胞分化，進(jìn)一步形成新的牙槽骨、牙骨質(zhì)及牙周膜。牙周膜細(xì)胞可以產(chǎn)生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白，形成牙周韌帶及纖維，以固定牙骨質(zhì)與牙槽骨的連接，并使牙周韌帶在損傷后得以再生[1]。除了產(chǎn)生膠原外，牙周膜細(xì)胞還可產(chǎn)生礦化組織，表達(dá)高水平的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和成骨相關(guān)蛋白，形成礦化結(jié)節(jié)[2]。在不同藥物或物理刺激的研究中，牙周膜細(xì)胞因其潛在的多向分化能力而被廣泛應(yīng)用，以促進(jìn)牙周再生[3-6]。

生長(zhǎng)停滯基因于1988年被發(fā)現(xiàn)，因在饑餓的小鼠成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)而得名[7]，生長(zhǎng)停滯特異性蛋白6(growth arrest-specific protein 6，Gas6)是其中的第6個(gè)成員，是一種相對(duì)分子質(zhì)量為75×103的分泌蛋白，屬于維生素K依賴(lài)蛋白家族[8]。本課題組前期關(guān)注了Gas6及其受體在心血管疾病中的作用，發(fā)現(xiàn)Gas6可以抑制牙齦卟啉單胞菌脂多糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)[9]。也有其他研究發(fā)現(xiàn)Gas6的主要受體——AXL受體酪氨酸激酶(AXL)與血管內(nèi)皮中的周細(xì)胞(pericytes)成骨分化有關(guān)，且AXL在周細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的表達(dá)受到調(diào)控[10]。Gas6在骨細(xì)胞中也有廣泛表達(dá)[11]。此外，Gas6還可促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞遷移及增殖[12-13]。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cell，hPDLCs)購(gòu)自上海賽百慷公司(產(chǎn)品編號(hào)：HUM-iCell-m001)，完全α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，成骨誘導(dǎo)液(組分：維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)Corning公司，細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)自日本Dojindo公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，ALP染色試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司，rhGas6購(gòu)自Sino Biological 公司，RNA提取劑Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，Universal SYBR Green master mix試劑購(gòu)自美國(guó)Roche公司。siRNA由上海吉瑪基因設(shè)計(jì)，PCR引物由六合華大基因合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) hPDLCs自購(gòu)得后加入完全α-MEM培養(yǎng)基[含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素]，培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿，恒溫培養(yǎng)箱[37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2]培養(yǎng)至3～7代用于后續(xù)研究。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將hPDLCs懸液100 μL接種于96孔培養(yǎng)皿中，2×103個(gè)/孔，孵箱孵育24 h后加入不同濃度的rhGas6，分別于0、24、48、72 h后加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h后取培養(yǎng)基至另一96孔板中，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)光密度。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將hPDLCs接種于96孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后加入不同濃度的rhGas6，于實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀下做劃痕，分別于24、48、72 h后拍照記錄。收集各重復(fù)組的圖像，應(yīng)用ImageJ 9.0 軟件對(duì)愈合面積百分比進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將hPDLCs接種于24孔直徑3 μm Transwell小室中(2×104個(gè)細(xì)胞/孔)， 上室為無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，下室為含800 μg/L rhGas6完全培養(yǎng)基500 μL，24 h后棄培養(yǎng)基，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定液室溫固定30 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫溶液37 ℃染色5 min，PBS沖洗3次，顯微鏡下觀察小室薄膜下方細(xì)胞并拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5成骨誘導(dǎo) 將hPDLCs接種于6孔板(2×104細(xì)胞/ cm2)中，匯合至70%后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(α-MEM，50 mg/L維生素C，50 mg/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)并加入不同濃度的rhGas6，誘導(dǎo)5 d。

1.2.6轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 按照Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，使用siRNA敲低hPDLCsGas6表達(dá)水平，方法如下：按每孔5 μL Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑加入含125 μL Opti-MEM培養(yǎng)液的EP管A中，震動(dòng)混合2～3 s。將5 μg的siRNA加入含125 μL Opti-MEM培養(yǎng)液的EP管B中，輕輕混合。陰性對(duì)照組使用隨意片段的siRNA。將EP管B中的液體加入EP管A，輕輕混勻，室溫靜置15 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體，加入培養(yǎng)孔，培養(yǎng)基補(bǔ)足至2 mL，過(guò)夜后棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.7ALP染色 12孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基下培養(yǎng)至7 d、14 d，棄培養(yǎng)液，使用PBS沖洗3次；使用4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min；按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制工作液，混勻后避光保存；棄固定液，Milli-Q水沖洗，每孔加入500 μL工作液，室溫避光10～30 min。每隔5 min觀察顯色結(jié)果，達(dá)到最佳顯色結(jié)果時(shí)，及時(shí)洗凈顯色液，Milli-Q水沖洗終止顯色，待孔板風(fēng)干后掃描，Image J 9.0量化分析色素點(diǎn)。

我向工地疾走。疾走的路上，有一幕在我腦子里反復(fù)出現(xiàn)。昨晚，李大頭給我們開(kāi)過(guò)會(huì)后，走出了我們的住所。他隨身帶了一把活口鉗子，那鉗子把長(zhǎng)，斜插在他的褲兜里，鉗子把露出一小截。

1.2.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Runx2、ALPmRNA的表達(dá) 在轉(zhuǎn)染及外源性rhGas6刺激后，分別用Trizol 試劑提取總RNA，檢測(cè)濃度后用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用10 μL 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(real-time PCR)反應(yīng)體系，500 ng cDNA模板。循環(huán)條件為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用2-ΔΔCt法檢測(cè)Runx2/ALPmRNA的表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并在圖例中具體說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差展示，兩組之間差異性檢驗(yàn)使用非配對(duì)t檢驗(yàn)，分組大于2組的差異性檢驗(yàn)使用單因素方差分析，多組間比較采用Bonferroni法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以完全培養(yǎng)基條件下的hPDLCs為對(duì)照組，加入濃度分別為200、400、600、800 μg/L rhGas6為實(shí)驗(yàn)組，在加入刺激后0、24、48、72 h測(cè)光密度值(圖1A)。結(jié)果顯示，在加入不同濃度rhGas6后的24、48、72 h，各濃度組與對(duì)照組之間光密度值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不同濃度組間光密度差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明rhGas6對(duì)hPDLCs增殖無(wú)顯著影響。

2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以完全培養(yǎng)基條件下的hPDLCs為對(duì)照組，加入濃度分別為200、400、600、800 μg/L rhGas6為實(shí)驗(yàn)組，重復(fù)3次計(jì)算愈合面積(圖1B)。24 h后， 800 μg/L濃度組的愈合面積百分比(31.06%±13.70%)大于對(duì)照組(21.79%±9.51%)及其他濃度組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在48、72 h各組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

800 μg/L rhGas6組在鏡下觀察到穿過(guò)小室膜到達(dá)下室的hPDLCs細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組(2.53±0.15vs. 1.03±0.26，P<0.01，圖2)，說(shuō)明800 μg/L濃度的外源性rhGas6能促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的遷移。

2.4 外源性rhGas6對(duì)hPDLCs Runx2以及ALP mRNA表達(dá)的影響

以正常誘導(dǎo)組為對(duì)照組，不同濃度rhGas6組為實(shí)驗(yàn)組，成骨誘導(dǎo)5 d后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后real-time PCR 檢測(cè)ALP及Runx2的mRNA表達(dá)水平(圖3)。加入rhGas6后，Runx2和ALP的mRNA表達(dá)增加，并且都顯示出濃度依賴(lài)性，即隨著rhGas6的濃度增加，Runx2和ALP的mRNA表達(dá)水平逐漸增加。在800 μg/L組Runx2的mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(1.60±0.30vs. 0.91±0.10，P<0.01)，在600、800 μg/L組ALP的mRNA表達(dá)量(1.95±0.52和2.81±0.61)均顯著高于對(duì)照組(0.86±0.12，P<0.05，P<0.001)。

圖1 加入不同濃度rhGas6后hPDLCs細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(A)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(B)

A, control(0 μg/L rhGas6); B, 800 μg/L rhGas6; C, number of cells.

圖3 加入rhGas6后Runx2(A)、ALP(B)mRNA表達(dá)水平

2.5 Gas6基因敲低效率驗(yàn)證

利用siRNA 敲低hPDLCs 的Gas6基因，以下調(diào)Gas6基因細(xì)胞組作為敲低組，轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA序列組為敲低對(duì)照組，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后real-time PCR 檢測(cè)Gas6基因表達(dá)水平(圖4)。結(jié)果顯示，Gas6敲低組Gas6基因表達(dá)水平顯著低于敲低對(duì)照組(0.38±0.08vs. 0.94±0.08，P<0.01)， 敲低效率為59%。

2.6 敲低Gas6基因?qū)PDLCs Runx2以及ALP mRNA表達(dá)情況的影響

利用siRNA 敲低hPDLCs的Gas6基因，以下調(diào)Gas6基因細(xì)胞組作為敲低組，轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA序列組為敲低對(duì)照組，不加任何刺激為對(duì)照組，成骨誘導(dǎo)5 d后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后real-time PCR檢測(cè)ALP及Runx2的mRNA表達(dá)水平(圖5)。Gas6敲低組ALP基因表達(dá)(0.39±0.07)顯著低于對(duì)照組(0.92±0.14，P<0.01)及敲低對(duì)照組(0.78±0.12，P<0.05)，但Runx2基因表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)。從反向說(shuō)明Gas6基因?qū)LPmRNA表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用。

si-CTR, si-RNA-control; si-Gas6, si-RNA-Gas6.

NC, normal control(osteogenic induction); si-CTR, si-RNA-control; si-Gas6, si-RNA-Gas6.

2.7 敲低Gas6基因?qū)PDLCs礦化結(jié)節(jié)形成的影響

利用siRNA敲低hPDLCs的Gas6基因，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后進(jìn)行ALP染色以觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，并應(yīng)用ImageJ 9.0軟件進(jìn)行色素量化分析(圖6)。結(jié)果可見(jiàn)，成骨誘導(dǎo)7 d后，Gas6敲低組礦化結(jié)節(jié)染色顯著低于誘導(dǎo)對(duì)照組(0.25±0.04vs. 1.00±0.11，P<0.001)，說(shuō)明Gas6敲低組成骨礦化能力減弱；誘導(dǎo)14 d后，Gas6敲低組染色程度低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.86±0.04vs. 1.00±0.16，P>0.05)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)rhGas6作為一種外源性刺激，對(duì)hPDLCs增殖無(wú)影響，能使hPDLCs的遷移能力增強(qiáng)，ALP、Runx2基因表達(dá)量增多，敲低Gas6基因后，ALP基因表達(dá)顯著降低，礦化結(jié)節(jié)形成能力顯著降低，從反向說(shuō)明Gas6基因具有促進(jìn)hPDLCsALP基因表達(dá)和礦化的作用。

Gas6是一種相對(duì)分子質(zhì)量為75×103的分泌型蛋白，屬于維生素K依賴(lài)蛋白家族，通過(guò)自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。Tyro3、AXL、Mer三者合稱(chēng)為T(mén)AM受體，TAM受體是具有胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸受體激酶，為單通道跨膜蛋白。Gas6結(jié)合TAM受體后激活下游信號(hào)，通過(guò)這些信號(hào)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)Gas6對(duì)hPDLCs具有促早期成骨作用。ALP、Runx2是成骨相關(guān)重要指標(biāo)，Runx2是誘導(dǎo)不成熟骨細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[15]。成骨誘導(dǎo)下敲低Gas6基因或加入rhGas6，牙周膜細(xì)胞ALP、Runx2基因表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生有顯著變化，能夠證明Gas6在牙周膜細(xì)胞中存在促早期成骨作用。Gas6/TAM促進(jìn)其他細(xì)胞成骨的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。然而，在心血管研究領(lǐng)域，Gas6/AXL具有抑制血管內(nèi)皮周細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用。有學(xué)者報(bào)道，上調(diào)Gas6/AXL后，血管平滑肌細(xì)胞凋亡減少，血管鈣化減少[16]，利用miRNA-34a下調(diào)AXL后，血管平滑肌細(xì)胞鈣化增加[17]，礦化的血管內(nèi)皮周細(xì)胞中AXL表達(dá)水平較低[10]。上述研究均提示Gas6/AXL在血管鈣化中具有抑制鈣化的作用，與本研究中Gas6促進(jìn)牙周膜細(xì)胞成骨分化的作用相反，可能是由于Gas6在不同組織中的作用有所不同。

NC, normal control(osteogenic induction); si-CTR, si-RNA-control; si-Gas6, si-RNA-Gas6; ALP, alkaline phosphatase. A, 7 d；B, 14 d.

本研究中rhGas6對(duì)hPDLCs增殖無(wú)影響，但可以增強(qiáng)hPDLCs的遷移能力,這與其他研究中Gas6促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移不完全一致。有研究表明，過(guò)表達(dá)Gas6后，膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移能力增強(qiáng)[13];加入rhGas6后，可以促進(jìn)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移[12]。Gas6蛋白激活A(yù)XL后，通過(guò)多種機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，AXL磷酸化部位與胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3kinase，PI3K)結(jié)合，下游蛋白激酶B(protein kinase B， Akt)抑制促凋亡蛋白Bad的活性[18]，磷酸化核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)增加抗凋亡蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達(dá)[19]。位于AXL下游的P38蛋白(p38 MAPK)和熱休克蛋白25是肌動(dòng)蛋白重構(gòu)的調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用[20]，PI3K/Akt、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)也是Gas6促進(jìn)腫瘤細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的可能通路[12-13]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過(guò)AXL基因敲低、Akt通路抑制劑來(lái)驗(yàn)證AXL在hPDLCs遷移中的影響。

近年來(lái)不乏不同藥物、脈沖超聲等對(duì)hPDLCs成骨分化的影響及機(jī)制的研究[3, 21-22]，但實(shí)驗(yàn)均建立在hPDLCs健康狀態(tài)的基礎(chǔ)上，炎癥條件下對(duì)hPDLCs成骨分化影響的相關(guān)研究較少。本研究關(guān)注的Gas6/AXL系統(tǒng)，除與細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)外，在多種組織中均與組織細(xì)胞炎癥損傷密切相關(guān)，我們前期關(guān)注了Gas6及其受體在心血管疾病中的作用，發(fā)現(xiàn)Gas6可以抑制牙齦卟啉單胞菌脂多糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)[9]。觀察牙周炎癥條件下，Gas6能否促進(jìn)hPDLCs遷移及成骨分化具有重要意義。

綜上所述，本研究通過(guò)敲低Gas6基因和加入外源性rhGas6，觀察到在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基下，hPDLCs成骨相關(guān)蛋白的基因表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生有顯著變化，提示Gas6在hPDLCs成骨分化中發(fā)揮作用。同時(shí)外源性rhGas6作為一種刺激，對(duì)hPDLCs增殖并無(wú)影響。對(duì)于該蛋白的進(jìn)一步研究有可能為牙周組織再生提供新的治療思路。