柴胡皂苷D對(duì)阿霉素治療小鼠肝癌的靶向?qū)б饔?/h1>
2021-02-03 07:45:22許嚴(yán)偉耿勝男王夢(mèng)琪杜鋼軍
中草藥 2021年3期
許嚴(yán)偉，耿勝男，王夢(mèng)琪，杜鋼軍*
1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451150
2.洛陽市第三人民醫(yī)院，河南 洛陽 471000
3.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南 開封 475000
肝癌是人類疾病死亡的重要原因之一，雖然近年來肝癌診療水平在不斷提高，但多數(shù)肝癌患者臨床確診時(shí)已進(jìn)入中晚期，腫瘤組織對(duì)藥物治療的敏感性差異較大，臨床治療效果不理想[1]。腫瘤靶向治療主要是利用癌細(xì)胞特性或致癌基因設(shè)計(jì)的藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性打擊和殺傷，然而，腫瘤細(xì)胞快速突變一直是傳統(tǒng)化療藥物和腫瘤新靶向治療藥物難以長期有效的主要障礙[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療腫瘤與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)殺死腫瘤細(xì)胞的理念不同，主要是瓦解腫瘤周邊支持腫瘤發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境，從而使腫瘤失去生長的“土壤”，逐漸停止增殖，在延長腫瘤患者生存期和提高生存質(zhì)量方面有獨(dú)特優(yōu)勢[3]。
柴胡Bupleuri Radix在我國作為傳統(tǒng)中藥材，已有2000 多年藥用歷史，很早就已認(rèn)識(shí)到其引藥入肝的特性，現(xiàn)代研究證明柴胡對(duì)拉米呋啶等藥物治療肝病具有引經(jīng)報(bào)使的作用[4]。柴胡皂苷是柴胡中主要的藥理活性成分，其中柴胡皂苷 D（saikosaponin D）是控制柴胡藥材及其制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是柴胡多種功效的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。本研究觀察柴胡皂苷D對(duì)阿霉素治療小鼠肝癌的靶向?qū)б饔?，并探究其可能的靶向?qū)б龣C(jī)制。
1 材料
1.1 細(xì)胞
小鼠肝癌H22細(xì)胞，購于上海細(xì)胞研究所，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。
1.2 動(dòng)物
SPF 級(jí)昆明種雌性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京微通利華試驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）20090002，動(dòng)物飼料合格證號(hào)：41000100003159。光照/黑暗（12 h/12 h）、溫度（23±3）℃飼養(yǎng)于河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲食及飲水。動(dòng)物使用經(jīng)河南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（許可號(hào)為HUSAM2016-288），嚴(yán)格遵守動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)規(guī)定。
1.3 藥品和試劑
柴胡皂苷D（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，湖北萬得化工有限公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco-BRL 公司）；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），美國Sigma 公司；吖啶橙（acridine orange，AO，北京索萊寶科技有限公司）；2′,7′-二 氯 熒 光 黃 雙 乙 酸 鹽（ 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、Mito-Tracker Green 探針（碧云天生物技術(shù)公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；抗小鼠有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic aniontransporting polypeptide 1B1，Oatp1b1）抗體、抗小鼠β-actin 抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；ECL 發(fā)光液、RIPA 裂解液、PVDF 膜、甘氨酸（北京索萊寶科技有限公司）；小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA 試劑盒、小鼠前膠原蛋白I（procollagen I，PCol-I）ELISA 試劑盒、膠原蛋白IV（collagen IV，Col-IV）ELISA 試劑盒、小鼠層黏連蛋白（laminin，LN）ELISA 試劑盒、小鼠透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）ELISA 試劑盒（R&D Systems 公司）；免疫組化試劑盒（Histostain-Plus，上海麥約爾生物科技有限公司）；RIPA（強(qiáng)）細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京賽馳生物科技有限公司）。
1.4 儀器
TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；LGR16-W 型高速冷凍離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；ELX-800UV型酶標(biāo)儀（美國BIO-IEK 公司）；LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司）；BX43顯微圖像分析儀（日本Olympus公司）；IX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；M4 激光全息細(xì)胞成像及分析系統(tǒng)（瑞典Phiab 公司）。
2 方法
2.1 細(xì)胞增殖和攝取阿霉素的檢測
取對(duì)數(shù)生長期的H22細(xì)胞，以5×104/mL 接種于96 孔板，100 μL/孔，每組設(shè)6 個(gè)平行孔。細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，分別單獨(dú)添加含不同質(zhì)量濃度（0.5、1、2、4、8、16 μg/mL）的柴胡皂苷D 或阿霉素以及阿霉素（0.5、1、2、4、8、16 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8、16 μg/mL）的同一培養(yǎng)基，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（添加空白培養(yǎng)基）。吸棄培養(yǎng)基，每孔加含MTT 0.5 mg/mL 的PBS（pH 6.8）100 μL，培養(yǎng)4 h 后棄上清液，每孔加入二甲基亞砜100 μL，振搖5 min，用多功能酶標(biāo)儀570 nm 測定各孔吸光度（A）。計(jì)算細(xì)胞增殖率、生長抑制率以及阿霉素對(duì)H22細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50）。IC50根據(jù)藥物濃度-生長抑制率半對(duì)數(shù)曲線采用GraphPad Prism 8 計(jì)算獲得生長抑制率50%對(duì)應(yīng)的藥物濃度。
細(xì)胞增殖率＝給藥組A值/對(duì)照組A值
生長抑制率＝(對(duì)照組A值－給藥組A值)/對(duì)照組A值
對(duì)于細(xì)胞攝取阿霉素的檢測，細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，添加含不同質(zhì)量濃度柴胡皂苷D（0、2、4、8 μg/mL）和阿霉素（1 μg/mL）的同一培養(yǎng)基，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸取培養(yǎng)基，5000 r/min 離心20 min，取上清用熒光分光光度儀測定A（激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長590 nm），計(jì)算阿霉素含量（以與無柴胡皂苷D 干預(yù)的上清A的比值表示）。
阿霉素?cái)z?。?－阿霉素含量
2.2 激光全息檢測細(xì)胞大小
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，加入6 孔板中3 mL，使每孔細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)。分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D 或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，用激光全息細(xì)胞系統(tǒng)分析細(xì)胞大小。
2.3 AO 染色法檢測細(xì)胞自噬
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在48 孔板中加入細(xì)胞使待測細(xì)胞數(shù)為1×105/孔，分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D 或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，各組均用2%血清誘導(dǎo)自噬，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗2 遍。每孔加入100 μL 含AO（10 μg/mL）染色液，37 ℃避光孵育30 min，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。用Image-pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)橙紅色信號(hào)積分光密度（integral optical density，IOD）值進(jìn)行分析，以累積IOD 代表細(xì)胞自噬水平。
2.4 DCFH-DA 檢測細(xì)胞ROS 水平
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在48 孔板中加入細(xì)胞使待測細(xì)胞數(shù)為1×105/孔，分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)48 h 后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入終濃度為10 μmol/L DCFH-DA 1 mL，37 ℃避光孵育20 min，熒光分光光度計(jì)測定ROS 含量。
2.5 Mito-Tracker Green 檢測細(xì)胞線粒體功能
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在48 孔板中加入細(xì)胞使待測細(xì)胞數(shù)為1×104/孔，分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D 或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入終濃度為50 nmol/L Mito-Tracker Green，37 ℃避光孵育1 h，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。用Image-pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)IOD 值進(jìn)行分析，以累積IOD 代表細(xì)胞線粒體功能。
2.6 Western blotting 印跡法檢測細(xì)胞攝取體Oatp1b1 蛋白的表達(dá)
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在6 孔板中加入3 mL，使每孔細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)。分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D 或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞膜蛋白，蛋白含量測定后與Lodding buffer 按1∶4 混勻，煮沸10 min，冷卻至室溫后上樣到12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)蛋白Marker 相對(duì)分子質(zhì)量切割Oatp1b1 蛋白膠帶，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、抗原封閉、與一抗孵育及與二抗孵育后加入ECL 發(fā)光液（A 與B 比例1∶1），凝膠成像系統(tǒng)顯影拍照并定量蛋白條帶相對(duì)灰度值。
2.7 肝癌H22 實(shí)體瘤小鼠模型制備、分組及給藥
取腹水型肝癌H22小鼠腹水，調(diào)細(xì)胞數(shù)5×105/mL，以0.2 mL/只接種小鼠右側(cè)腋部皮下建立小鼠肝癌實(shí)體瘤模型。將110 只模型小鼠隨即分成4組，分別為模型組（25 只）、阿霉素組（30 只）、柴胡皂苷D 組（25 只）、阿霉素＋柴胡皂苷D 聯(lián)合組（30 只）。腫瘤接種后次日給藥，對(duì)照組ig 0.5%的CMC-Na 0.2 mL/10 g，每日1 次；阿霉素組尾iv給予阿霉素8 mg/kg，每周1 次；柴胡皂苷D 組ig柴胡皂苷D（0.5% CMC-Na 混懸）20 mg/kg（根據(jù)藥效學(xué)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果得到的最佳劑量），每日1 次；阿霉素＋柴胡皂苷D聯(lián)合組給予阿霉素和柴胡皂苷D，給藥途徑和劑量同相應(yīng)單一藥物組。治療時(shí)間為3 周。治療期間各組每日監(jiān)測小鼠體質(zhì)量1 次。第22 天，阿霉素組和聯(lián)合給藥組分別隨機(jī)取5 只小鼠用于檢測瘤組織對(duì)阿霉素的攝取情況；每組取5 只小鼠用于檢測瘤組織的血管通透性；另每組頸椎脫臼處死小鼠10 只，剝離腫瘤，稱瘤質(zhì)量，取瘤組織制備組織勻漿，檢測TGF-β1 水平和細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平；每組剩余10 只小鼠觀察90 d 內(nèi)的小鼠存活情況。
腫瘤體積＝長徑×寬徑2/2
2.8 瘤組織對(duì)阿霉素?cái)z取檢測
阿霉素組和聯(lián)合給藥組小鼠尾iv阿霉素30 min后頸椎脫臼處死小鼠，剝離腫瘤，稱質(zhì)量后按組織質(zhì)量與PBS 容積比1∶5 研磨成組織勻漿，5000 r/min 離心20 min。組織沉淀按原始組織質(zhì)量與酸性乙醇溶液（0.3 mol/L 鹽酸-無水乙醇比例3∶7）容積比1∶3 混勻震蕩24 h，5000 r/min 離心20 min取上清，熒光分光光度儀（激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長590 nm）測定A，計(jì)算阿霉素含量，結(jié)果以每克瘤組織中阿霉素的含量表示阿霉素?cái)z取情況。
2.9 瘤組織TGF-β1 和細(xì)胞外基質(zhì)分泌檢測
稱取各組腫瘤組織，按組織質(zhì)量與PBS 容積比1∶5 研磨成組織勻漿，5000 r/min 離心20 min 取上清，按ELISA 試劑盒說明書操作，測定TGF-β1、PCol-I、Col-IV、LN 和HA 的含量。
2.10 瘤組織血管通透性檢測
各組肝癌H22實(shí)體瘤小鼠尾iv 伊文斯蘭50 mg/kg 30 min 后頸椎脫臼處死，剝離腫瘤，稱質(zhì)量后按組織質(zhì)量與PBS 容積比1∶5 研磨成組織勻漿，再按組織勻漿容積與25%的甲酰胺容積比1∶4 混勻震蕩24 h，5000 r/min 離心20 min 取上清，紫外分光光度儀620 nm 處測定A，按伊文斯蘭標(biāo)準(zhǔn)線計(jì)算伊文斯蘭組織含量，結(jié)果以每克瘤組織中的伊文斯蘭含量表示血管通透性。
2.11 統(tǒng)計(jì)方法
采用GraphPad Prism 8 軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；生存時(shí)間采用Kaplan-Meier 存活分析，P＜0.05 表示有顯著性差異。
3 結(jié)果
3.1 柴胡皂苷D 對(duì)H22細(xì)胞活性及阿霉素抑制細(xì)胞增殖的影響
與對(duì)照組（未經(jīng)藥物處理）比較，阿霉素呈劑量相關(guān)性抑制H22細(xì)胞生長，0.5～16 μg/mL 柴胡皂苷D 不影響H22肝癌細(xì)胞增殖（圖1-A），但能增強(qiáng)阿霉素的細(xì)胞增殖抑制作用（圖1-B、C），促進(jìn)細(xì)胞攝取阿霉素（圖1-D），增加H22細(xì)胞體積（圖2），阻止阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞變小，柴胡皂苷D 質(zhì)量濃度8 μg/mL 作用最佳。
3.2 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞ROS 水平及線粒體功能的影響
與對(duì)照組比較，1 μg/mL 阿霉素明顯升高H22細(xì)胞ROS 水平，柴胡皂苷D 在2～8 μg/mL 內(nèi)呈劑量相關(guān)性地降低H22細(xì)胞ROS 水平，恢復(fù)阿霉素升高的細(xì)胞ROS 水平（圖3）。與對(duì)照組比較，1 μg/mL阿霉素明顯降低H22細(xì)胞線粒體功能，柴胡皂苷在2～8 μg/mL 內(nèi)呈劑量相關(guān)性地增強(qiáng)H22細(xì)胞線粒體功能，恢復(fù)阿霉素降低的細(xì)胞線粒體功能（圖4）。
3.3 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞自噬及攝取體蛋白Oatp1b1 表達(dá)的影響
與對(duì)照組比較，1 μg/mL 阿霉素明顯抑制AO 標(biāo)記（橙黃→紅）的H22細(xì)胞自噬；柴胡皂苷D 在2～8 μg/mL 內(nèi)呈劑量相關(guān)性地抑制H22細(xì)胞自噬，并可逆轉(zhuǎn)阿霉素抑制H22細(xì)胞自噬的作用（圖5）。與對(duì)照組比較，1 μg/mL 阿霉素明顯促進(jìn)H22細(xì)胞攝取體蛋白Oatp1b1 的表達(dá)；柴胡皂苷D 在2～8 μg/mL內(nèi)呈劑量相關(guān)性地增加H22細(xì)胞Oatp1b1 的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)阿霉素抑制H22細(xì)胞Oatp1b1 的表達(dá)（圖6）。
3.4 柴胡皂苷D 對(duì)小鼠H22肝癌實(shí)體瘤生長及阿霉素治療效果的影響
與模型組比較，阿霉素明顯抑制小鼠H22肝癌實(shí)體瘤生長，柴胡皂苷D 對(duì)小鼠H22肝癌實(shí)體瘤生長無明顯影響，但可增加瘤組織攝取阿霉素和阿霉素對(duì)肝癌實(shí)體瘤的治療效果，延長阿霉素治療荷瘤小鼠的生存時(shí)間（圖7）。
圖1 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞增殖 (A)、阿霉素的細(xì)胞增殖抑制作用 (B、C) 及細(xì)胞攝取阿霉素 (D) 的影響 (±s,n=6)Fig.1 Effects of saponin D on H22 cell proliferation (A),proliferation inhibition of adriamycin (B,C) and cell uptake of adriamycin (D) (±s,n=6)
3.5 柴胡皂苷D 對(duì)小鼠H22肝癌實(shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)的影響
與模型組比較，阿霉素明顯增加小鼠H22肝癌實(shí)體瘤HA、LN、PCol-I、Col-IV 等細(xì)胞外基質(zhì)的分泌；柴胡皂苷D 明顯降低小鼠H22肝癌實(shí)體瘤以上細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，改善阿霉素組H22肝癌實(shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)沉積（圖8）。
3.6 柴胡皂苷 D 對(duì)小鼠 H22 肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 分泌及血管通透性的影響
與模型組比較，阿霉素明顯增加小鼠H22肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 的分泌；柴胡皂苷D 可明顯減少H22肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 的分泌，逆轉(zhuǎn)阿霉素組H22肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 分泌的增加。與模型組比較，阿霉素明顯增加小鼠H22肝癌實(shí)體瘤血管通透性；柴胡皂苷D 可明顯降低小鼠H22肝癌實(shí)體瘤血管通透性，逆轉(zhuǎn)阿霉素組小鼠H22肝癌實(shí)體瘤血管通透性的增加（圖9）。
4 討論
柴胡為傘形科草本植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，入肝膽經(jīng)，有解表退熱、疏肝解郁、升陽舉陷的功能，主治以胸脅脹痛、寒熱往來、頭痛目眩等為主的外感和內(nèi)傷病癥，其引藥入肝作用自古就被中醫(yī)藥界所認(rèn)識(shí)[6]。柴胡氣味俱薄，能引胃氣上升發(fā)散表熱；同時(shí)柴胡味薄兼苦，可通可泄，有疏通腸胃的功能，是調(diào)節(jié)機(jī)體氣機(jī)升降的重要藥物，《本經(jīng)》謂其與大黃一樣有“推陳致新”之功[7]。葛文靜等[8]發(fā)現(xiàn)，將柴胡加入到肝病治療藥物組方中能將藥物引入肝臟，因而增強(qiáng)肝病治療效果。曾有研究證明，柴胡皂苷D 能抑制人乳腺癌SK-BR-3 細(xì)胞[9]、人結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞[10]和人肝癌HepG2 細(xì)胞[11]增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[12]。本研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D 對(duì)抗腫瘤藥阿霉素治療小鼠肝癌體內(nèi)外均有促進(jìn)細(xì)胞攝取阿霉素的靶向?qū)б饔?，為柴胡皂苷D 作為柴胡引經(jīng)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。
圖2 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞大小的影響 (±s,n=3)Fig.2 Effect of saikosaponin D on H22 cell size (±s,n=3)
圖3 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞ROS 的影響 (±s,n=3)Fig.3 Effect of saikosaponin D on ROS in H22 cells (±s,n=3)
圖4 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞線粒體功能的影響 (±s,n=3)Fig.4 Effect of saikosaponin D on mitochondrial function in H22 cell (±s,n=3)
肝癌在中醫(yī)學(xué)古籍中屬于“肝積”“黃疸”“鼓脹”等范疇，其癥狀描述與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的肝癌臨床表現(xiàn)有諸多類似之處，同時(shí)認(rèn)為肝郁氣滯是其基本病機(jī)[13]。我國學(xué)者基于中醫(yī)理論的“十一臟皆取決于膽”和“膽主樞機(jī)”提出“少陽樞機(jī)不利為導(dǎo)致肝癌的核心病機(jī)”的觀點(diǎn)，主張肝癌當(dāng)從少陽論治[14]。臨床觀察證實(shí)了疏肝解郁治療方法能夠提高肝癌患者的有效率和生存率，減輕放化療給肝癌患者帶來的不良反應(yīng)及心理抑郁，兼有改善肝功能和調(diào)節(jié)免疫功能等作用[15]。周仲瑛教授基于臨床實(shí)踐提出“癌毒蓄積是肝癌發(fā)生、發(fā)展及加重的關(guān)鍵”，認(rèn)為肝氣郁結(jié)是肝癌發(fā)病的起始，繼而形成濕、熱、瘀互結(jié)的肝脾腎虧虛局面，最終導(dǎo)致癌毒蓄積引發(fā)肝癌[16]。臨床上“虛-郁-滯”病機(jī)貫穿肝癌全程，肝癌患者常出現(xiàn)口苦、咽干、心煩喜嘔、胸脅苦滿、不欲飲食等肝郁氣滯的“正虛、邪實(shí)”現(xiàn)象[17]。因此，肝癌治療的關(guān)鍵應(yīng)首重理氣解郁，同時(shí)運(yùn)用清熱利濕、活血化瘀等抗癌解毒之法。柴胡為最常用疏肝解郁中藥，兼?zhèn)鋾惩鈾C(jī)功能，與中醫(yī)肝癌治療原則非常符合。有研究表明，柴胡皂苷能調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞的失衡和抑制炎性細(xì)胞因子分泌減輕大鼠抑郁癥狀[18]，證實(shí)了柴胡及其活性成分柴胡皂苷的解郁作用。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷D 可減少肝癌實(shí)體瘤小鼠瘤組織TGF-β1 的分泌、降低小鼠腫瘤血管通透性，在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)體內(nèi)外對(duì)肝癌細(xì)胞生長均無影響，但能增加阿霉素對(duì)荷瘤小鼠的治療效果，提示柴胡皂苷D 與一般疏肝解郁藥物一樣，單獨(dú)治療癌癥難以顯效，需與抗癌藥物聯(lián)用才能發(fā)揮作用。
圖5 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞自噬的影響 (±s,n=3)Fig.5 Effect of saikosaponin D on autophagy in H22 cells (±s,n=3)
圖6 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞Oatp1b1 蛋白表達(dá)的影響(±s,n=3)Fig.6 Effect of saikosaponin D on protein expression of Oatp1b1 in H22 cells (±s,n=3)
靶向治療理念對(duì)肝癌治療藥物的研發(fā)起了很大推動(dòng)作用，由于癌癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)的癌癥驅(qū)動(dòng)基因已達(dá)500 多種，即使同一種癌癥也很難定位統(tǒng)一的驅(qū)動(dòng)基因[19]，傳統(tǒng)化療仍是肝癌等腫瘤的主要治療方法。通過中藥引經(jīng)藥及其活性成分引導(dǎo)腫瘤化療藥物直達(dá)腫瘤部位，從而提高腫瘤化療效果，避免了檢測癌癥驅(qū)動(dòng)基因使用腫瘤靶向藥物的麻煩和高額費(fèi)用，為腫瘤靶向治療提供了簡便、有效的治療方法。柴胡及其活性成分柴胡皂苷作為中藥引經(jīng)藥的代表成為了肝病靶向?qū)б芯康臒狳c(diǎn)之一。有研究表明，柴胡能提高拉米呋啶對(duì)乙肝病毒的治療效果，使肝細(xì)胞損傷明顯恢復(fù)、病理改變趨于正常，且能減少肝臟網(wǎng)狀纖維增生[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷能增加肝內(nèi)蛋白質(zhì)合成，升高肝糖含量，降低大鼠血漿膽固醇、三酰甘油和磷脂水平，加速血液清除膽固醇，為柴胡及其活性成分柴胡皂苷作為肝病治療的引經(jīng)藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[21]。王宗明等[22]發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D 可以抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶基因（mammalian target of rapamycin，mTORC）信號(hào)傳導(dǎo)通路誘發(fā)肝癌細(xì)胞自噬性死亡，黨鋒等[23]研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D 能通過抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和細(xì)胞干性阻止人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480 遷移和侵襲，從另一角度解釋了柴胡引經(jīng)作用的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷D 在體外呈劑量依賴性增加H22細(xì)胞Oatp1b 的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)H22細(xì)胞Oatp1b1 表達(dá)的降低；在體內(nèi)抑制小鼠H22肝癌實(shí)體瘤HA、LN、PCol-I、Col-IV 的分泌，改善阿霉素組H22肝癌實(shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)沉積，為柴胡及其活性成分柴胡皂苷引經(jīng)作用增加了新的機(jī)制。
圖7 柴胡皂苷D 對(duì)H22 肝癌實(shí)體瘤生長及阿霉素治療效果的影響Fig.7 Effect of saikosaponin D on tumor growth in H22 solid tumor-bearing mice and therapeutic action of doxorubicin
圖8 柴胡皂苷D 對(duì)H22 肝癌實(shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)的影響(±s,n=10)Fig.8 Effect of saikosaponin D on extracellular matrix of H22 solid tumor (±s,n=10)
腫瘤的發(fā)生發(fā)展和腫瘤微環(huán)境密不可分，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular Matrix，ECM）可為腫瘤細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支架及細(xì)胞因子和生長因子，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和分化，與臨床不良預(yù)后相關(guān)[24]。自噬是細(xì)胞利用溶酶體對(duì)自身細(xì)胞器進(jìn)行分解，從而回收利用大分子物質(zhì)的一種高度保守細(xì)胞生物學(xué)行為，有利于細(xì)胞適應(yīng)不利的生活環(huán)境、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，雖然在已完成惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞中對(duì)維持腫瘤細(xì)胞基礎(chǔ)代謝和保持細(xì)胞活性起重要作用，其功能的維持也是機(jī)體阻止腫瘤發(fā)生的重要途徑。有研究表明，自噬與ECM 的合成和降解失衡密切相關(guān)，細(xì)胞自噬功能降低導(dǎo)致的線粒體功能受損是ECM 累積的一個(gè)重要機(jī)制[25]。梁曉強(qiáng)等[26]證明了柴胡的引經(jīng)作用與其抑制ECM 纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）有關(guān)，為中藥引經(jīng)藥靶向ECM 提供了依據(jù)。結(jié)合體外研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D 能增加細(xì)胞自噬和改善線粒體功能的結(jié)果，認(rèn)為柴胡皂苷D 維持自噬和線粒體功能，繼而促進(jìn)Oatp1b1 的表達(dá)和降低腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而增加化療藥物在腫瘤部位的分布應(yīng)該是其引經(jīng)的重要機(jī)制。
圖9 柴胡皂苷D 對(duì)H22 肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 分泌及血管通透性的影響Fig.9 Effect of saikosaponin D on TGF-β1 secretion and vascular permeability in H22 solid tumor-bearing mice
綜上所述，柴胡皂苷D 能維持細(xì)胞自噬和線粒體功能，促進(jìn)Oatp1b1 的表達(dá)和降低腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而對(duì)阿霉素治療小鼠肝癌起到靶向?qū)б饔?。柴胡皂苷D 的這種靶向?qū)б饔脤?duì)肝癌化療藥物可能具有普遍性，有可能成為簡單有效的肝癌化療藥物靶向?qū)бぞ吲c輔助材料。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突
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許嚴(yán)偉，耿勝男，王夢(mèng)琪，杜鋼軍*
1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451150
2.洛陽市第三人民醫(yī)院，河南 洛陽 471000
3.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南 開封 475000
肝癌是人類疾病死亡的重要原因之一，雖然近年來肝癌診療水平在不斷提高，但多數(shù)肝癌患者臨床確診時(shí)已進(jìn)入中晚期，腫瘤組織對(duì)藥物治療的敏感性差異較大，臨床治療效果不理想[1]。腫瘤靶向治療主要是利用癌細(xì)胞特性或致癌基因設(shè)計(jì)的藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性打擊和殺傷，然而，腫瘤細(xì)胞快速突變一直是傳統(tǒng)化療藥物和腫瘤新靶向治療藥物難以長期有效的主要障礙[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療腫瘤與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)殺死腫瘤細(xì)胞的理念不同，主要是瓦解腫瘤周邊支持腫瘤發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境，從而使腫瘤失去生長的“土壤”，逐漸停止增殖，在延長腫瘤患者生存期和提高生存質(zhì)量方面有獨(dú)特優(yōu)勢[3]。
柴胡Bupleuri Radix在我國作為傳統(tǒng)中藥材，已有2000 多年藥用歷史，很早就已認(rèn)識(shí)到其引藥入肝的特性，現(xiàn)代研究證明柴胡對(duì)拉米呋啶等藥物治療肝病具有引經(jīng)報(bào)使的作用[4]。柴胡皂苷是柴胡中主要的藥理活性成分，其中柴胡皂苷 D（saikosaponin D）是控制柴胡藥材及其制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是柴胡多種功效的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。本研究觀察柴胡皂苷D對(duì)阿霉素治療小鼠肝癌的靶向?qū)б饔?，并探究其可能的靶向?qū)б龣C(jī)制。
1 材料
1.1 細(xì)胞
小鼠肝癌H22細(xì)胞，購于上海細(xì)胞研究所，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。
1.2 動(dòng)物
SPF 級(jí)昆明種雌性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京微通利華試驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）20090002，動(dòng)物飼料合格證號(hào)：41000100003159。光照/黑暗（12 h/12 h）、溫度（23±3）℃飼養(yǎng)于河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲食及飲水。動(dòng)物使用經(jīng)河南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（許可號(hào)為HUSAM2016-288），嚴(yán)格遵守動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)規(guī)定。
1.3 藥品和試劑
柴胡皂苷D（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，湖北萬得化工有限公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco-BRL 公司）；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），美國Sigma 公司；吖啶橙（acridine orange，AO，北京索萊寶科技有限公司）；2′,7′-二 氯 熒 光 黃 雙 乙 酸 鹽（ 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、Mito-Tracker Green 探針（碧云天生物技術(shù)公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；抗小鼠有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic aniontransporting polypeptide 1B1，Oatp1b1）抗體、抗小鼠β-actin 抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；ECL 發(fā)光液、RIPA 裂解液、PVDF 膜、甘氨酸（北京索萊寶科技有限公司）；小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA 試劑盒、小鼠前膠原蛋白I（procollagen I，PCol-I）ELISA 試劑盒、膠原蛋白IV（collagen IV，Col-IV）ELISA 試劑盒、小鼠層黏連蛋白（laminin，LN）ELISA 試劑盒、小鼠透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）ELISA 試劑盒（R&D Systems 公司）；免疫組化試劑盒（Histostain-Plus，上海麥約爾生物科技有限公司）；RIPA（強(qiáng)）細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京賽馳生物科技有限公司）。
1.4 儀器
TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；LGR16-W 型高速冷凍離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；ELX-800UV型酶標(biāo)儀（美國BIO-IEK 公司）；LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司）；BX43顯微圖像分析儀（日本Olympus公司）；IX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；M4 激光全息細(xì)胞成像及分析系統(tǒng)（瑞典Phiab 公司）。
2 方法
2.1 細(xì)胞增殖和攝取阿霉素的檢測
取對(duì)數(shù)生長期的H22細(xì)胞，以5×104/mL 接種于96 孔板，100 μL/孔，每組設(shè)6 個(gè)平行孔。細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，分別單獨(dú)添加含不同質(zhì)量濃度（0.5、1、2、4、8、16 μg/mL）的柴胡皂苷D 或阿霉素以及阿霉素（0.5、1、2、4、8、16 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8、16 μg/mL）的同一培養(yǎng)基，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（添加空白培養(yǎng)基）。吸棄培養(yǎng)基，每孔加含MTT 0.5 mg/mL 的PBS（pH 6.8）100 μL，培養(yǎng)4 h 后棄上清液，每孔加入二甲基亞砜100 μL，振搖5 min，用多功能酶標(biāo)儀570 nm 測定各孔吸光度（A）。計(jì)算細(xì)胞增殖率、生長抑制率以及阿霉素對(duì)H22細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50）。IC50根據(jù)藥物濃度-生長抑制率半對(duì)數(shù)曲線采用GraphPad Prism 8 計(jì)算獲得生長抑制率50%對(duì)應(yīng)的藥物濃度。
細(xì)胞增殖率＝給藥組A值/對(duì)照組A值
生長抑制率＝(對(duì)照組A值－給藥組A值)/對(duì)照組A值
對(duì)于細(xì)胞攝取阿霉素的檢測，細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，添加含不同質(zhì)量濃度柴胡皂苷D（0、2、4、8 μg/mL）和阿霉素（1 μg/mL）的同一培養(yǎng)基，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸取培養(yǎng)基，5000 r/min 離心20 min，取上清用熒光分光光度儀測定A（激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長590 nm），計(jì)算阿霉素含量（以與無柴胡皂苷D 干預(yù)的上清A的比值表示）。
阿霉素?cái)z?。?－阿霉素含量
2.2 激光全息檢測細(xì)胞大小
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，加入6 孔板中3 mL，使每孔細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)。分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D 或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，用激光全息細(xì)胞系統(tǒng)分析細(xì)胞大小。
2.3 AO 染色法檢測細(xì)胞自噬
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在48 孔板中加入細(xì)胞使待測細(xì)胞數(shù)為1×105/孔，分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D 或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，各組均用2%血清誘導(dǎo)自噬，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗2 遍。每孔加入100 μL 含AO（10 μg/mL）染色液，37 ℃避光孵育30 min，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。用Image-pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)橙紅色信號(hào)積分光密度（integral optical density，IOD）值進(jìn)行分析，以累積IOD 代表細(xì)胞自噬水平。
2.4 DCFH-DA 檢測細(xì)胞ROS 水平
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在48 孔板中加入細(xì)胞使待測細(xì)胞數(shù)為1×105/孔，分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)48 h 后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入終濃度為10 μmol/L DCFH-DA 1 mL，37 ℃避光孵育20 min，熒光分光光度計(jì)測定ROS 含量。
2.5 Mito-Tracker Green 檢測細(xì)胞線粒體功能
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在48 孔板中加入細(xì)胞使待測細(xì)胞數(shù)為1×104/孔，分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D 或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入終濃度為50 nmol/L Mito-Tracker Green，37 ℃避光孵育1 h，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。用Image-pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)IOD 值進(jìn)行分析，以累積IOD 代表細(xì)胞線粒體功能。
2.6 Western blotting 印跡法檢測細(xì)胞攝取體Oatp1b1 蛋白的表達(dá)
取對(duì)數(shù)生長期H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在6 孔板中加入3 mL，使每孔細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)。分別單獨(dú)加入終質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL 的柴胡皂苷D 或阿霉素（1 μg/mL）及阿霉素（1 μg/mL）聯(lián)合柴胡皂苷D（2、4、8 μg/mL），同時(shí)設(shè)置未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞膜蛋白，蛋白含量測定后與Lodding buffer 按1∶4 混勻，煮沸10 min，冷卻至室溫后上樣到12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)蛋白Marker 相對(duì)分子質(zhì)量切割Oatp1b1 蛋白膠帶，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、抗原封閉、與一抗孵育及與二抗孵育后加入ECL 發(fā)光液（A 與B 比例1∶1），凝膠成像系統(tǒng)顯影拍照并定量蛋白條帶相對(duì)灰度值。
2.7 肝癌H22 實(shí)體瘤小鼠模型制備、分組及給藥
取腹水型肝癌H22小鼠腹水，調(diào)細(xì)胞數(shù)5×105/mL，以0.2 mL/只接種小鼠右側(cè)腋部皮下建立小鼠肝癌實(shí)體瘤模型。將110 只模型小鼠隨即分成4組，分別為模型組（25 只）、阿霉素組（30 只）、柴胡皂苷D 組（25 只）、阿霉素＋柴胡皂苷D 聯(lián)合組（30 只）。腫瘤接種后次日給藥，對(duì)照組ig 0.5%的CMC-Na 0.2 mL/10 g，每日1 次；阿霉素組尾iv給予阿霉素8 mg/kg，每周1 次；柴胡皂苷D 組ig柴胡皂苷D（0.5% CMC-Na 混懸）20 mg/kg（根據(jù)藥效學(xué)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果得到的最佳劑量），每日1 次；阿霉素＋柴胡皂苷D聯(lián)合組給予阿霉素和柴胡皂苷D，給藥途徑和劑量同相應(yīng)單一藥物組。治療時(shí)間為3 周。治療期間各組每日監(jiān)測小鼠體質(zhì)量1 次。第22 天，阿霉素組和聯(lián)合給藥組分別隨機(jī)取5 只小鼠用于檢測瘤組織對(duì)阿霉素的攝取情況；每組取5 只小鼠用于檢測瘤組織的血管通透性；另每組頸椎脫臼處死小鼠10 只，剝離腫瘤，稱瘤質(zhì)量，取瘤組織制備組織勻漿，檢測TGF-β1 水平和細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平；每組剩余10 只小鼠觀察90 d 內(nèi)的小鼠存活情況。
腫瘤體積＝長徑×寬徑2/2
2.8 瘤組織對(duì)阿霉素?cái)z取檢測
阿霉素組和聯(lián)合給藥組小鼠尾iv阿霉素30 min后頸椎脫臼處死小鼠，剝離腫瘤，稱質(zhì)量后按組織質(zhì)量與PBS 容積比1∶5 研磨成組織勻漿，5000 r/min 離心20 min。組織沉淀按原始組織質(zhì)量與酸性乙醇溶液（0.3 mol/L 鹽酸-無水乙醇比例3∶7）容積比1∶3 混勻震蕩24 h，5000 r/min 離心20 min取上清，熒光分光光度儀（激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長590 nm）測定A，計(jì)算阿霉素含量，結(jié)果以每克瘤組織中阿霉素的含量表示阿霉素?cái)z取情況。
2.9 瘤組織TGF-β1 和細(xì)胞外基質(zhì)分泌檢測
稱取各組腫瘤組織，按組織質(zhì)量與PBS 容積比1∶5 研磨成組織勻漿，5000 r/min 離心20 min 取上清，按ELISA 試劑盒說明書操作，測定TGF-β1、PCol-I、Col-IV、LN 和HA 的含量。
2.10 瘤組織血管通透性檢測
各組肝癌H22實(shí)體瘤小鼠尾iv 伊文斯蘭50 mg/kg 30 min 后頸椎脫臼處死，剝離腫瘤，稱質(zhì)量后按組織質(zhì)量與PBS 容積比1∶5 研磨成組織勻漿，再按組織勻漿容積與25%的甲酰胺容積比1∶4 混勻震蕩24 h，5000 r/min 離心20 min 取上清，紫外分光光度儀620 nm 處測定A，按伊文斯蘭標(biāo)準(zhǔn)線計(jì)算伊文斯蘭組織含量，結(jié)果以每克瘤組織中的伊文斯蘭含量表示血管通透性。
2.11 統(tǒng)計(jì)方法
采用GraphPad Prism 8 軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；生存時(shí)間采用Kaplan-Meier 存活分析，P＜0.05 表示有顯著性差異。
3 結(jié)果
3.1 柴胡皂苷D 對(duì)H22細(xì)胞活性及阿霉素抑制細(xì)胞增殖的影響
與對(duì)照組（未經(jīng)藥物處理）比較，阿霉素呈劑量相關(guān)性抑制H22細(xì)胞生長，0.5～16 μg/mL 柴胡皂苷D 不影響H22肝癌細(xì)胞增殖（圖1-A），但能增強(qiáng)阿霉素的細(xì)胞增殖抑制作用（圖1-B、C），促進(jìn)細(xì)胞攝取阿霉素（圖1-D），增加H22細(xì)胞體積（圖2），阻止阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞變小，柴胡皂苷D 質(zhì)量濃度8 μg/mL 作用最佳。
3.2 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞ROS 水平及線粒體功能的影響
與對(duì)照組比較，1 μg/mL 阿霉素明顯升高H22細(xì)胞ROS 水平，柴胡皂苷D 在2～8 μg/mL 內(nèi)呈劑量相關(guān)性地降低H22細(xì)胞ROS 水平，恢復(fù)阿霉素升高的細(xì)胞ROS 水平（圖3）。與對(duì)照組比較，1 μg/mL阿霉素明顯降低H22細(xì)胞線粒體功能，柴胡皂苷在2～8 μg/mL 內(nèi)呈劑量相關(guān)性地增強(qiáng)H22細(xì)胞線粒體功能，恢復(fù)阿霉素降低的細(xì)胞線粒體功能（圖4）。
3.3 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞自噬及攝取體蛋白Oatp1b1 表達(dá)的影響
與對(duì)照組比較，1 μg/mL 阿霉素明顯抑制AO 標(biāo)記（橙黃→紅）的H22細(xì)胞自噬；柴胡皂苷D 在2～8 μg/mL 內(nèi)呈劑量相關(guān)性地抑制H22細(xì)胞自噬，并可逆轉(zhuǎn)阿霉素抑制H22細(xì)胞自噬的作用（圖5）。與對(duì)照組比較，1 μg/mL 阿霉素明顯促進(jìn)H22細(xì)胞攝取體蛋白Oatp1b1 的表達(dá)；柴胡皂苷D 在2～8 μg/mL內(nèi)呈劑量相關(guān)性地增加H22細(xì)胞Oatp1b1 的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)阿霉素抑制H22細(xì)胞Oatp1b1 的表達(dá)（圖6）。
3.4 柴胡皂苷D 對(duì)小鼠H22肝癌實(shí)體瘤生長及阿霉素治療效果的影響
與模型組比較，阿霉素明顯抑制小鼠H22肝癌實(shí)體瘤生長，柴胡皂苷D 對(duì)小鼠H22肝癌實(shí)體瘤生長無明顯影響，但可增加瘤組織攝取阿霉素和阿霉素對(duì)肝癌實(shí)體瘤的治療效果，延長阿霉素治療荷瘤小鼠的生存時(shí)間（圖7）。
圖1 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞增殖 (A)、阿霉素的細(xì)胞增殖抑制作用 (B、C) 及細(xì)胞攝取阿霉素 (D) 的影響 (±s,n=6)Fig.1 Effects of saponin D on H22 cell proliferation (A),proliferation inhibition of adriamycin (B,C) and cell uptake of adriamycin (D) (±s,n=6)
3.5 柴胡皂苷D 對(duì)小鼠H22肝癌實(shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)的影響
與模型組比較，阿霉素明顯增加小鼠H22肝癌實(shí)體瘤HA、LN、PCol-I、Col-IV 等細(xì)胞外基質(zhì)的分泌；柴胡皂苷D 明顯降低小鼠H22肝癌實(shí)體瘤以上細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，改善阿霉素組H22肝癌實(shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)沉積（圖8）。
3.6 柴胡皂苷 D 對(duì)小鼠 H22 肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 分泌及血管通透性的影響
與模型組比較，阿霉素明顯增加小鼠H22肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 的分泌；柴胡皂苷D 可明顯減少H22肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 的分泌，逆轉(zhuǎn)阿霉素組H22肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 分泌的增加。與模型組比較，阿霉素明顯增加小鼠H22肝癌實(shí)體瘤血管通透性；柴胡皂苷D 可明顯降低小鼠H22肝癌實(shí)體瘤血管通透性，逆轉(zhuǎn)阿霉素組小鼠H22肝癌實(shí)體瘤血管通透性的增加（圖9）。
4 討論
柴胡為傘形科草本植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，入肝膽經(jīng)，有解表退熱、疏肝解郁、升陽舉陷的功能，主治以胸脅脹痛、寒熱往來、頭痛目眩等為主的外感和內(nèi)傷病癥，其引藥入肝作用自古就被中醫(yī)藥界所認(rèn)識(shí)[6]。柴胡氣味俱薄，能引胃氣上升發(fā)散表熱；同時(shí)柴胡味薄兼苦，可通可泄，有疏通腸胃的功能，是調(diào)節(jié)機(jī)體氣機(jī)升降的重要藥物，《本經(jīng)》謂其與大黃一樣有“推陳致新”之功[7]。葛文靜等[8]發(fā)現(xiàn)，將柴胡加入到肝病治療藥物組方中能將藥物引入肝臟，因而增強(qiáng)肝病治療效果。曾有研究證明，柴胡皂苷D 能抑制人乳腺癌SK-BR-3 細(xì)胞[9]、人結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞[10]和人肝癌HepG2 細(xì)胞[11]增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[12]。本研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D 對(duì)抗腫瘤藥阿霉素治療小鼠肝癌體內(nèi)外均有促進(jìn)細(xì)胞攝取阿霉素的靶向?qū)б饔?，為柴胡皂苷D 作為柴胡引經(jīng)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。
圖2 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞大小的影響 (±s,n=3)Fig.2 Effect of saikosaponin D on H22 cell size (±s,n=3)
圖3 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞ROS 的影響 (±s,n=3)Fig.3 Effect of saikosaponin D on ROS in H22 cells (±s,n=3)
圖4 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞線粒體功能的影響 (±s,n=3)Fig.4 Effect of saikosaponin D on mitochondrial function in H22 cell (±s,n=3)
肝癌在中醫(yī)學(xué)古籍中屬于“肝積”“黃疸”“鼓脹”等范疇，其癥狀描述與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的肝癌臨床表現(xiàn)有諸多類似之處，同時(shí)認(rèn)為肝郁氣滯是其基本病機(jī)[13]。我國學(xué)者基于中醫(yī)理論的“十一臟皆取決于膽”和“膽主樞機(jī)”提出“少陽樞機(jī)不利為導(dǎo)致肝癌的核心病機(jī)”的觀點(diǎn)，主張肝癌當(dāng)從少陽論治[14]。臨床觀察證實(shí)了疏肝解郁治療方法能夠提高肝癌患者的有效率和生存率，減輕放化療給肝癌患者帶來的不良反應(yīng)及心理抑郁，兼有改善肝功能和調(diào)節(jié)免疫功能等作用[15]。周仲瑛教授基于臨床實(shí)踐提出“癌毒蓄積是肝癌發(fā)生、發(fā)展及加重的關(guān)鍵”，認(rèn)為肝氣郁結(jié)是肝癌發(fā)病的起始，繼而形成濕、熱、瘀互結(jié)的肝脾腎虧虛局面，最終導(dǎo)致癌毒蓄積引發(fā)肝癌[16]。臨床上“虛-郁-滯”病機(jī)貫穿肝癌全程，肝癌患者常出現(xiàn)口苦、咽干、心煩喜嘔、胸脅苦滿、不欲飲食等肝郁氣滯的“正虛、邪實(shí)”現(xiàn)象[17]。因此，肝癌治療的關(guān)鍵應(yīng)首重理氣解郁，同時(shí)運(yùn)用清熱利濕、活血化瘀等抗癌解毒之法。柴胡為最常用疏肝解郁中藥，兼?zhèn)鋾惩鈾C(jī)功能，與中醫(yī)肝癌治療原則非常符合。有研究表明，柴胡皂苷能調(diào)節(jié)Th17/Treg 細(xì)胞的失衡和抑制炎性細(xì)胞因子分泌減輕大鼠抑郁癥狀[18]，證實(shí)了柴胡及其活性成分柴胡皂苷的解郁作用。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷D 可減少肝癌實(shí)體瘤小鼠瘤組織TGF-β1 的分泌、降低小鼠腫瘤血管通透性，在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)體內(nèi)外對(duì)肝癌細(xì)胞生長均無影響，但能增加阿霉素對(duì)荷瘤小鼠的治療效果，提示柴胡皂苷D 與一般疏肝解郁藥物一樣，單獨(dú)治療癌癥難以顯效，需與抗癌藥物聯(lián)用才能發(fā)揮作用。
圖5 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞自噬的影響 (±s,n=3)Fig.5 Effect of saikosaponin D on autophagy in H22 cells (±s,n=3)
圖6 柴胡皂苷D 對(duì)H22 細(xì)胞Oatp1b1 蛋白表達(dá)的影響(±s,n=3)Fig.6 Effect of saikosaponin D on protein expression of Oatp1b1 in H22 cells (±s,n=3)
靶向治療理念對(duì)肝癌治療藥物的研發(fā)起了很大推動(dòng)作用，由于癌癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)的癌癥驅(qū)動(dòng)基因已達(dá)500 多種，即使同一種癌癥也很難定位統(tǒng)一的驅(qū)動(dòng)基因[19]，傳統(tǒng)化療仍是肝癌等腫瘤的主要治療方法。通過中藥引經(jīng)藥及其活性成分引導(dǎo)腫瘤化療藥物直達(dá)腫瘤部位，從而提高腫瘤化療效果，避免了檢測癌癥驅(qū)動(dòng)基因使用腫瘤靶向藥物的麻煩和高額費(fèi)用，為腫瘤靶向治療提供了簡便、有效的治療方法。柴胡及其活性成分柴胡皂苷作為中藥引經(jīng)藥的代表成為了肝病靶向?qū)б芯康臒狳c(diǎn)之一。有研究表明，柴胡能提高拉米呋啶對(duì)乙肝病毒的治療效果，使肝細(xì)胞損傷明顯恢復(fù)、病理改變趨于正常，且能減少肝臟網(wǎng)狀纖維增生[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷能增加肝內(nèi)蛋白質(zhì)合成，升高肝糖含量，降低大鼠血漿膽固醇、三酰甘油和磷脂水平，加速血液清除膽固醇，為柴胡及其活性成分柴胡皂苷作為肝病治療的引經(jīng)藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[21]。王宗明等[22]發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D 可以抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶基因（mammalian target of rapamycin，mTORC）信號(hào)傳導(dǎo)通路誘發(fā)肝癌細(xì)胞自噬性死亡，黨鋒等[23]研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D 能通過抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和細(xì)胞干性阻止人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480 遷移和侵襲，從另一角度解釋了柴胡引經(jīng)作用的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷D 在體外呈劑量依賴性增加H22細(xì)胞Oatp1b 的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)H22細(xì)胞Oatp1b1 表達(dá)的降低；在體內(nèi)抑制小鼠H22肝癌實(shí)體瘤HA、LN、PCol-I、Col-IV 的分泌，改善阿霉素組H22肝癌實(shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)沉積，為柴胡及其活性成分柴胡皂苷引經(jīng)作用增加了新的機(jī)制。
圖7 柴胡皂苷D 對(duì)H22 肝癌實(shí)體瘤生長及阿霉素治療效果的影響Fig.7 Effect of saikosaponin D on tumor growth in H22 solid tumor-bearing mice and therapeutic action of doxorubicin
圖8 柴胡皂苷D 對(duì)H22 肝癌實(shí)體瘤細(xì)胞外基質(zhì)的影響(±s,n=10)Fig.8 Effect of saikosaponin D on extracellular matrix of H22 solid tumor (±s,n=10)
腫瘤的發(fā)生發(fā)展和腫瘤微環(huán)境密不可分，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular Matrix，ECM）可為腫瘤細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支架及細(xì)胞因子和生長因子，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和分化，與臨床不良預(yù)后相關(guān)[24]。自噬是細(xì)胞利用溶酶體對(duì)自身細(xì)胞器進(jìn)行分解，從而回收利用大分子物質(zhì)的一種高度保守細(xì)胞生物學(xué)行為，有利于細(xì)胞適應(yīng)不利的生活環(huán)境、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，雖然在已完成惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞中對(duì)維持腫瘤細(xì)胞基礎(chǔ)代謝和保持細(xì)胞活性起重要作用，其功能的維持也是機(jī)體阻止腫瘤發(fā)生的重要途徑。有研究表明，自噬與ECM 的合成和降解失衡密切相關(guān)，細(xì)胞自噬功能降低導(dǎo)致的線粒體功能受損是ECM 累積的一個(gè)重要機(jī)制[25]。梁曉強(qiáng)等[26]證明了柴胡的引經(jīng)作用與其抑制ECM 纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）有關(guān)，為中藥引經(jīng)藥靶向ECM 提供了依據(jù)。結(jié)合體外研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D 能增加細(xì)胞自噬和改善線粒體功能的結(jié)果，認(rèn)為柴胡皂苷D 維持自噬和線粒體功能，繼而促進(jìn)Oatp1b1 的表達(dá)和降低腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而增加化療藥物在腫瘤部位的分布應(yīng)該是其引經(jīng)的重要機(jī)制。
圖9 柴胡皂苷D 對(duì)H22 肝癌實(shí)體瘤組織TGF-β1 分泌及血管通透性的影響Fig.9 Effect of saikosaponin D on TGF-β1 secretion and vascular permeability in H22 solid tumor-bearing mice
綜上所述，柴胡皂苷D 能維持細(xì)胞自噬和線粒體功能，促進(jìn)Oatp1b1 的表達(dá)和降低腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而對(duì)阿霉素治療小鼠肝癌起到靶向?qū)б饔?。柴胡皂苷D 的這種靶向?qū)б饔脤?duì)肝癌化療藥物可能具有普遍性，有可能成為簡單有效的肝癌化療藥物靶向?qū)бぞ吲c輔助材料。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突
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