劉志東，陳金鵬,，周稼榮，周思雨，劉 毅,，劉素香,，任 濤,，田成旺,*，陳常青,*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193

2.天津藥物研究院，天津 300301

3.天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300301

4.釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300301

流感病毒性肺炎是由流感病毒性上呼吸道感染向下蔓延所致，流感并發(fā)的肺炎可分為原發(fā)性流感病毒性肺炎、繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎和混合性肺炎[1-2]。流感病毒性肺炎多發(fā)于老人、兒童等免疫力低下者，早期表現(xiàn)流感癥狀，病情進(jìn)展迅速，病死率較高[3]。由于流感病毒的抗原變異能力極強(qiáng)，臨床上主要以對癥治療為主，抗病毒等其他治療手段為輔[4]。中醫(yī)藥對流感病毒性肺炎有較好的治療作用[5]。小兒升麻方源自孫思邈的《備急千金要方》，由升麻、射干、生姜、陳皮4 味藥組成，為治療熱毒、咽塞的經(jīng)典方藥[6]。本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠的治療作用，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究小兒升麻方治療流感病毒性肺炎的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究材料

中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計算研究平臺（ TCMIP ， http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/home/login/login.html）；Genecard 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/cgi/input.pl）；OmicsBean 數(shù)據(jù)庫（http://www.omicsbean.cn/）；Venny 2.1.0 在線軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；Cytoscape 3.7.0 軟件。

1.2 動物

普通級昆明小鼠190 只，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，合格證號0042219。動物在18～22 ℃，40%～60%濕度的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動物實(shí)驗(yàn)遵循天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理規(guī)定，符合3R 原則。

1.3 病毒

FM1 流感病毒株，由安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所引進(jìn)。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)雞胚接種，收集48 h 尿囊液，測定血凝效價（1∶1024），于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥品

小兒升麻方浸膏（每克含生藥6.302 g）由天津藥物研究院提供，實(shí)驗(yàn)前將浸膏配制成質(zhì)量濃度為1.89 g/mL（以生藥量計）的母液。

2 方法

2.1 小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠的影響

2.1.1 測定小兒升麻方的最大給藥量 取小鼠10只，雌雄各半，禁食12 h 后ig 0.5 mL 小兒升麻方母液（47.25 g/kg）。觀察7 d，如無死亡，計算小鼠的最大給藥量倍數(shù)。

最大給藥量倍數(shù)＝250×小鼠耐受量/成人每日用量

2.1.2 測定FM1 流感病毒尿囊液的半數(shù)致死量（lethal dose，LD50） 取小鼠60 只，雌雄各半，隨機(jī)分為6 個不同稀釋倍數(shù)（1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6）病毒組，每組10只。小鼠在乙醚麻醉下，經(jīng)鼻滴入0.03 mL FM1 流感病毒尿囊液，觀察小鼠死亡情況，第14 天按Reed-Muench 法計算LD50。

2.1.3 分組與給藥 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，取小鼠60 只，雌雄各半，隨機(jī)分為對照組，模型組，小兒升麻方低、中、高劑量（1.75、3.50、7.00 g/kg）組，生理鹽水組，每組10 只。將小兒升麻方母液稀釋成質(zhì)量濃度為0.175、0.350、0.700 g/mL 的溶液，分別用作小兒升麻方低、中、高劑量組給藥。除對照組和模型組外，各給藥組ig 相應(yīng)藥物（10 μL/g），生理鹽水組ig 等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)6 d。于給藥第2 天，除對照組外，其余各組小鼠經(jīng)鼻滴入0.03 mL FM1 流感病毒尿囊液（尿囊液稀釋5244 倍，病毒感染量為15 LD50）。給藥結(jié)束后，小鼠禁食禁水24 h，稱定質(zhì)量，脫頸椎處死，取出肺組織，測定肺指數(shù)。

肺指數(shù)＝小鼠肺質(zhì)量/體質(zhì)量

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

在TCMIP 數(shù)據(jù)庫[7]中查找小兒升麻方各藥材成分和靶點(diǎn)信息，在Genecards 數(shù)據(jù)庫[8]以“流感病毒性肺炎”為關(guān)鍵詞搜索相關(guān)靶點(diǎn)，通過Venny 2.1.0 在線軟件[9]與小兒升麻方化學(xué)成分的靶點(diǎn)映射篩選出共同靶點(diǎn)作為研究靶點(diǎn)。借助OmicsBean 分析平臺[10]與STRING 數(shù)據(jù)庫[11]對共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物過程分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.0 軟件進(jìn)行可視化處理，篩選出核心靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

3 結(jié)果

3.1 體內(nèi)抗流感病毒性肺炎實(shí)驗(yàn)

3.1.1 小兒升麻方最大給藥量的確定 小鼠ig 小兒升麻方（47.25 g/kg）7 d 內(nèi)未出現(xiàn)死亡，小兒升麻方的給藥劑量相當(dāng)于人臨床用量的112.49 倍，表明其安全范圍較大、毒性較小。

3.1.2 FM1 流感病毒尿囊液對小鼠的LD50FM1流感病毒尿囊液對小鼠的LD50為4.895，即尿囊液稀釋78 660 倍時能使50%小鼠死亡。

3.1.3 小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠肺指數(shù)的影響 如表1 所示，與模型組比較，小兒升麻方高劑量組可明顯降低流感病毒性肺炎小鼠肺指數(shù)（P＜0.05），表明7.00 g/kg 小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠有一定治療作用。

表1 小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠肺指數(shù)的影響Table 1 Effect of Xiaoer Shengma Formula on lung index of mice with influenza virus pneumonia

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.2.1 小兒升麻方中藥材、成分和靶點(diǎn)的預(yù)測 通過借助TCMIP 數(shù)據(jù)庫，篩選出小兒升麻方化學(xué)成分217 個，其中陳皮化學(xué)成分44 個、升麻化學(xué)成分24 個、射干化學(xué)成分25 個、生姜化學(xué)成分124個。小兒升麻方的候選靶點(diǎn)共有1098 個。

3.2.2 流感病毒相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 通過Genecards數(shù)據(jù)庫共搜集到流感病毒性肺炎相關(guān)靶點(diǎn)1308 個，與小兒升麻方1098 個候選靶點(diǎn)在Venny 2.1.0 中映射篩選出69 個共同靶點(diǎn)。

3.2.3 共同靶點(diǎn)的GO 分析和KEGG 信號通路富集分析 利用OmicsBean 分析平臺對共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，P＜0.5 前10 條如圖1 所示，生物過程主要涉及細(xì)胞活化（B 細(xì)胞和T 細(xì)胞的分化）、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、生物過程的負(fù)調(diào)控等過程；細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外小泡、細(xì)胞外細(xì)胞器等過程；分子功能主要涉及RNA 結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合等過程。

將69 個共同靶點(diǎn)輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫中，得到88 條通路（錯誤發(fā)生率＜0.01），對其進(jìn)行KEGG 分析并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，通過OmicsBean 分析平臺對錯誤發(fā)生率排名前10 的通路進(jìn)行可視化處理，如圖2 所示，主要有麻疹、結(jié)核、軍團(tuán)菌病、百日咳、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、人巨細(xì)胞病毒感染、弓形蟲病、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、致病性大腸桿菌感染等通路。

圖1 共同靶點(diǎn)的GO 富集分析Fig.1 GO enrichment analysis of common targets

圖2 共同靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析的前10 條通路Fig.2 Top 10 pathways for enrichment analysis of common target KEGG pathway

圖3 共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of common targets

3.2.4 小兒升麻方靶點(diǎn)PPI分析 將69個共同靶點(diǎn)蛋白輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共有68 個節(jié)點(diǎn)，483 條相互作用關(guān)系，平均度值為14.2。將PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 中，度值降序排列篩選出大于平均度值的核心靶點(diǎn)24 個，如圖3 所示，包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine-threonine kinase 1，AKT1）、白蛋白（albumin，ALB)、熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α，HSP90AA1）、β-肌動蛋白（β-actin，ACTB）、雌激素受體（estrogen receptor，ESR1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF、熱休克蛋白8（heat shock protein 8，HSPA8）、α-烯醇酶（α-enolase，ENO1）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）、前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）、細(xì)胞色素C（ cytochrome C ， CYCS ）、 白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL1-β）、延伸因子1-α1（elongation factor 1-α1，EEF1A1）等。

為了進(jìn)一步了解PPI 網(wǎng)絡(luò)的生物作用，使用Cytoscape 3.7.0 軟件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行Cluster 模塊分析，共獲得4 個Cluster 模塊，對4 個模塊進(jìn)行富集分析，如圖4 所示，Cluster 1 主要與氮化合物代謝過程的正負(fù)調(diào)控、細(xì)胞凋亡過程、化學(xué)反應(yīng)、代謝過程的負(fù)調(diào)控等生物過程有關(guān)；Cluster 2 主要與谷胱甘肽代謝、癌癥中的中央碳代謝、脂肪細(xì)胞因子信號通路、IgG Fc 受體（Fc γ receptors，F(xiàn)cγR）介導(dǎo)的吞噬作用等通路過程相關(guān)；Cluster 3主要與病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯有關(guān)；Cluster 4 主要與調(diào)控細(xì)胞生長、DNA 合成、mRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過程有關(guān)。

圖4 共同靶點(diǎn)Cluster 模塊的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of common target Cluster module

圖5 小兒升麻方“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.5 “Herbs-compound-target-pathway” network of Xiaoer Shengma Formula

3.2.5 小兒升麻方“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 小兒升麻方“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”如圖5 所示，該網(wǎng)絡(luò)有20 306 條邊，且構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)度分布服從冪分布[P(χ)＝30.660χ-0.947（r2＝0.714）]，表明小兒升麻方網(wǎng)絡(luò)為無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)。特征路徑長度2.746，即網(wǎng)絡(luò)路徑長度為3 步，大多數(shù)靶點(diǎn)的聯(lián)系密切，表明該網(wǎng)絡(luò)具有較快的傳播速度和較小的反應(yīng)時間，具有小世界性質(zhì)。網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.500，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)目6.467，網(wǎng)絡(luò)中心度0.411，提示小兒升麻方“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)具有無標(biāo)度、小范圍的結(jié)構(gòu)體系。網(wǎng)絡(luò)中既存在一個分子與多個靶點(diǎn)的相互作用，也存在不同分子作用于同一個靶點(diǎn)的現(xiàn)象，顯示了小兒升麻方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，初步闡釋了小兒升麻方清熱解毒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

4 討論

中醫(yī)對病毒性肺炎有著豐富的診治經(jīng)驗(yàn)[12]，隨著中醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的交流與相互滲透，中醫(yī)在流感病毒性肺炎的早期干預(yù)、恢復(fù)期調(diào)理和預(yù)后改善均具有明顯優(yōu)勢[13]。中醫(yī)認(rèn)為病毒性肺炎的病因?yàn)橥飧小耙哽濉敝畾?，病位由表及里，多遵從上、中、下三焦和衛(wèi)氣營血傳變規(guī)律。疫癘之氣容易兼夾濕熱，侵襲肺衛(wèi)，尤其是素體脾胃虛弱者；若正不勝邪，邪毒入里化熱，傷津耗液，甚者灼營動血，直傳心包，發(fā)為危候。小兒升麻方中生姜、陳皮性溫可散寒，升麻、射干性寒可解郁熱。小兒升麻方以疏風(fēng)寒、清內(nèi)熱、祛燥濕、助化痰、解熱毒為主要治法，在疏風(fēng)解表的基礎(chǔ)上，兼顧扶助正氣、清熱、理氣化痰，治療流感病毒性肺炎。

本研究考察了小兒升麻方對流感病毒性肺炎小鼠的治療作用，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[14-16]探討小兒升麻方抗流感病毒性肺炎的作用機(jī)制。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析表明，GAPDH、AKT1、ALB、HSP90AA1、ACTB、ESR1、IL-6、TNF、HSPA8、ENO1、CASP3、PTGS2、CYCS、IL1B、EEF1A1 等炎癥相關(guān)蛋白均具有較高的度值，處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置，可能是小兒升麻方發(fā)揮抗流感病毒性肺炎作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中，AKT1 可被多種上游細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子等激活，在細(xì)胞增殖、存活和凋亡中發(fā)揮著重要作用；TNF-α 和IL-6 是重要的促炎因子，參與機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等多種病理過程?；凇八幉?成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)，升麻中的升麻醇（cimigenol）[17]、升麻素苷（cimicifugoside）、26-脫氧升麻苷（7,8-didehydro-27-deoxyactein），射干中的射干醛（belamcandal）[18]、28-去乙?；涓扇?8-deacetylbelamcandal）[19]、野鳶尾黃素（irigenin）、鳶尾黃酮甲素（iristectorigenin A）、鳶尾苷元（tectorigenin）、5,6,7,4′-四羥基-8-甲氧基異黃酮（5,6,7,4′-tetrahydroxy-8-methoxyisoflavone）、5,6,7,3′-四羥基-4′-甲氧基異黃酮 （ 5,6,7,3′-tetrahydroxy-4′-methoxyisoflavone），陳皮中的β-谷甾醇（β-sitosterol），生姜中的龍腦（borneol）等成分，可能通過作用于CYCS、CASP3、HSP90AA1、EEF1A1、膜聯(lián)蛋白A2（annexin A2，ANXA2）、PTGS2、HSPA8、ESR1、IL-6、ACTB、TNF、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NFKB1）、GAPDH、糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，NR3C1）、ENO1、熱休克蛋白β1（heat shock protein β1，HSPB1）、IL-1β 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，影響C 型凝集素受體[20]、IL-17[21]、TNF[22]、人巨細(xì)胞病毒感染[23]等通路發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用[24]。研究表明，流感病毒侵入呼吸道上皮細(xì)胞后被吞噬，感染細(xì)胞識別病毒RNA，激活細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，導(dǎo)致大范圍的組織損傷、全身炎癥反應(yīng)綜合征[25-27]。因此，在抗病毒基礎(chǔ)上聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)治療已成為研究焦點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)抗病毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小兒升麻方對流感病毒性肺炎有潛在的治療作用，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示了其抗流感病毒性肺炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用通路，發(fā)現(xiàn)小兒升麻方可能通過升麻醇、射干醛、野鳶尾黃素、鳶尾黃酮甲素等化學(xué)成分，作用于AKT1、TNF、IL-6、ESR1、NR3C1 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程，發(fā)揮抗流感病毒性肺炎作用，為小兒升麻方的臨床應(yīng)用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突