李佳川，李思穎

西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

腎功能損傷是高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）臨床最常見并發(fā)癥之一，體內(nèi)血尿酸產(chǎn)生過多或腎臟排泄尿酸減少，尿酸鹽達(dá)過飽和狀態(tài)而沉積于腎間質(zhì)和輸尿管，從而引起腎臟病變[1]。HUA腎功能損傷主要病理學(xué)改變?yōu)槁阅I間質(zhì)、腎小管病變，并伴有局部炎癥反應(yīng)發(fā)生[2]。近年來，HUA并發(fā)的腎功能損傷發(fā)病率呈升高趨勢，男性患者多于女性，其發(fā)病隱匿，早期無明顯臨床癥狀。臨床上常用的化學(xué)藥物多為別嘌醇、非布司他和苯溴馬隆等[3]，通過抑制尿酸生成和促進(jìn)尿酸排泄來改善尿酸代謝，但對并發(fā)的腎功能損傷尚無確切療效。糖尿病、HUA 等代謝性疾病是中醫(yī)藥防治的優(yōu)勢病種，中醫(yī)藥及少數(shù)民族醫(yī)藥對其相關(guān)并發(fā)癥具有較好的臨床治療優(yōu)勢。

藤茶，又稱莓茶、龍須茶、客家白茶，由顯齒蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang 的嫩枝葉加工而成，具有清熱解毒、活血通絡(luò)的功效[4]，主要分布于四川、貴州、湖南、湖北、廣西等少數(shù)民族地區(qū)[5-6]，具有藥食同源之性。藤茶含有黃酮類[7]、多糖類[8]、酚類[9]、氨基酸[10]等多種活性成分，其黃酮類成分含量最為豐富，主要有二氫楊梅素、藤茶素、槲皮素、楊梅素等，其中二氫楊梅素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)35%，被認(rèn)為是藤茶發(fā)揮保健功效的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[11-12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藤茶及其總黃酮部位具有抗氧化[13]、降血壓[14]、調(diào)血脂[15]、抗動脈粥樣硬化[16]、心血管保護(hù)[17]、抗肝癌[18]等藥理作用。課題組前期通過對藤茶民族習(xí)用地區(qū)大量走訪和臨床實(shí)踐反饋后發(fā)現(xiàn)，藤茶作為藥食兩用植物，在多個少數(shù)民族地區(qū)均有治療痛風(fēng)和慢性腎炎的民間習(xí)用和文獻(xiàn)記載情況[19]，但其治療HUA 腎功能損傷的作用機(jī)制相關(guān)研究較少。因此，本研究采用分子對接技術(shù)，綜合藤茶總黃酮中代表性活性成分，深入探討藥物組分與尿酸生成和排泄相關(guān)蛋白靶點(diǎn)的相互作用，并建立腺嘌呤聯(lián)合乙胺丁醇致HUA 腎功能損傷大鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證，系統(tǒng)探討藤茶總黃酮提取物對HUA腎功損傷的保護(hù)作用，以期為少數(shù)民族地區(qū)藥食資源藤茶的進(jìn)一步保健開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性Wister 大鼠50 只，7 周齡，體質(zhì)量200～220 g，購于四川省成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物研究中心，許可證號SCXK（川）2015-030。動物飼養(yǎng)于西南民族大學(xué)藥學(xué)院SPF 級動物實(shí)驗(yàn)室，溫度（24±2）℃，相對濕度（55±5）%，每12 小時晝夜間斷性照明，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2019-05）。

1.2 藥材

藤茶藥材市售，產(chǎn)地湖南省張家界市，經(jīng)西南民族大學(xué)顧健教授鑒定為葡萄科植物顯齒蛇葡萄A.grossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang的干燥嫩枝葉。藤茶粉碎后過40 目篩，稱取適量干燥藤茶，按1∶10 加入蒸餾水，于100 ℃回流提取2 次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓蒸發(fā)濃縮得浸膏。將浸膏用D-101 大孔樹脂吸附，水洗近無色后，用95%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得純化物，干燥即得藤茶總黃酮（total flavonoids fromA.grossedentata，AGTF）。以二氫楊梅素為對照品，采用AlCl3比色法測定AGTF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.16%。

1.3 藥品與試劑

別嘌醇片（批號20181206，國藥準(zhǔn)字H34021248，規(guī)格0.1 g/片）購自合肥九聯(lián)制藥有限公司；二氫楊梅素對照品（批號MUST-14013108，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自成都曼思特生物科技有限公司；腺嘌呤（批號D1915072，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸乙胺丁醇片（批號T19B030，規(guī)格0.25 g/片）購自杭州民生藥業(yè)有限公司；尿酸試劑盒（批號20190407）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）試劑盒（批號20190330）、腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）試劑盒（批號20190403）、肌酐試劑盒（批號20191021）、尿素氮試劑盒（批號20191022）均購自南京建成生物工程研究所；尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體1（uric acid reabsorption transporter 1，URAT1）抗體（批號bs-10357R）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9（glucose transporter 9，GLUT9）抗體（批號bs-13388R）、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2（adenosine triphosphate binding cassette transporter G2，ABCG2）抗體（批號bs-0662R）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（批號bs10802R）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體（批號bs0812R）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗體（批號bs23660R)、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抗體（批號bs0086R）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（批號bs0295G-HRP）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；蘇木素染液（批號G1005-1）、伊紅染液（批號G1001）購自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體（批號00083126）購自美國Proteintech 公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、BCA 蛋白定量檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

CYT5M 型多功能全波長酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；H165-W 型高速微量離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Mini-Sub Cell GT Cell 型水平電泳系統(tǒng)、ChemiDoc 免染蛋白印跡系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)（常州郊區(qū)中威電子儀器廠）；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；BA400 型數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2 方法

2.1 AGTF 主要活性成分與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的分子對接

尿酸代謝涉及尿酸生成（即嘌呤分解代謝）與尿酸排泄等多個途徑。XOD 和ADA 是尿酸生成途徑中的重要靶蛋白，也是抗HUA 藥物設(shè)計的關(guān)鍵靶點(diǎn)；URAT1、GLUT9 和ABCG2 是促尿酸排泄藥物作用的靶點(diǎn)[20-22]。以上靶點(diǎn)對AGTF 潛在藥效物質(zhì)的篩選及臨床診斷、治療具有重要意義。根據(jù)文獻(xiàn)報道[11-23]，將藤茶總黃酮提取物中發(fā)揮藥理作用的主要活性成分二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素和藤茶素作為配體，以URAT1、GLUT9、ABCG2、XOD和ADA 蛋白為受體，分別進(jìn)行分子對接，并以臨床上降尿酸首選藥物黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇作為陽性對照[24]。

2.1.1 化合物的處理 運(yùn)用 PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載或Chemdraw 軟件繪制二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素和藤茶素的2D 結(jié)構(gòu)，采用PyRx 軟件對化合物分子進(jìn)行能量最小化，保存為pdb 格式，作為配體備用。

2.1.2 蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測與篩選 在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中分別檢索URAT1、GLUT9、ABCG2、XOD 和ADA 的蛋白質(zhì)序列，并利用SWISS-MODEL 同源建模平臺（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測所有蛋白質(zhì)序列的三維蛋白結(jié)構(gòu)。通過SAVES v5.0 在線平臺（https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）對預(yù)測出的三維蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行評分，根據(jù)Verify分析和Ramachandran圖立體化學(xué)質(zhì)量評估的數(shù)據(jù)，篩選出評分高的模型作為預(yù)測的靶蛋白結(jié)構(gòu)。

2.1.3 受體蛋白的準(zhǔn)備 利用AutoDock Tools 軟件，對篩選出的靶蛋白除水、加氫、添加原子電荷、設(shè)置原子類型，存為pdbqt 格式，作為受體備用。

2.1.4 分子對接 運(yùn)用PyRx 軟件中的AutoDock Vina 將化合物與受體蛋白分別進(jìn)行分子對接，并對對接結(jié)果進(jìn)行分析。

2.2 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 分組、造模和給藥 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大鼠隨機(jī)分成對照組、模型組、別嘌醇（50 mg/kg，別嘌醇溶于蒸餾水配制成0.5%溶液）組和AGTF（0.25、0.50 g/kg，AGTF 溶于蒸餾水分別配成質(zhì)量濃度為25、50 mg/mL 的溶液）組，每組10 只。腺嘌呤和鹽酸乙胺丁醇溶于蒸餾水配制成1%腺嘌呤、2.5%鹽酸乙胺丁醇的混懸液，除對照組ig 等體積生理鹽水外，其余各組ig 混懸液（10 mL/kg）[25]，1 次/d，連續(xù)14 d。于造模第8 天，各給藥組ig 藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig 等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)14 d。

2.2.2 AGTF 對大鼠血清中XOD、ADA 活性和尿酸、肌酐、尿素氮水平的影響 大鼠禁食不禁水24 h，末次給藥1 h 后ip 10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，腹主動脈取血，分離血清，按試劑盒說明書檢測血清中XOD 和ADA 活性和尿酸、肌酐、尿素氮水平。

2.2.3 AGTF 對大鼠腎臟組織病理變化的影響 大鼠脫頸椎處死，分離大鼠腎臟組織，用冰生理鹽水沖洗，濾紙拭干后稱定質(zhì)量，計算腎臟指數(shù)；取部分腎臟組織以4%多聚甲醛固定，脫水、修剪、包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察腎臟組織的病理變化。

2.2.4 AGTF 對大鼠腎臟組織URAT1、GLUT9、ABCG2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β 蛋白表達(dá)的影響 采用免疫組化法檢測腎臟組織URAT1、GLUT9、ABCG2 蛋白表達(dá)[26]；取剩余腎臟組織于液氮中凍存，采用Western blotting 法檢測腎臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β 蛋白的表達(dá)[27]。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析。結(jié)果以表示，數(shù)據(jù)用單因數(shù)方差分析進(jìn)行組間比較。

3 結(jié)果

3.1 AGTF 主要活性成分與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果

結(jié)合能小于0 則配體與受體可以自由結(jié)合，結(jié)合能越低表明受體與配體間的親和力越大，二者發(fā)生相互作用的可能性越高。如表1 所示，二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素、藤茶素和別嘌醇與抗HUA 靶點(diǎn)蛋白的對接結(jié)合能均小于0，表明AGTF 主要活性成分均與URAT1、GLUT9、ABCG2、ADA、XOD 受體蛋白有較好的結(jié)合活性，能較穩(wěn)定地自發(fā)結(jié)合，且結(jié)合作用優(yōu)于別嘌醇。AGTF 中含量最高的二氫楊梅素與各靶蛋白的對接模式如圖1、2 所示，二氫楊梅素與各受體蛋白通過范德華力、氫鍵等多個價鍵結(jié)合，表明二氫楊梅素與受體蛋白的結(jié)合具有較高的穩(wěn)定性。

表1 藤茶總黃酮主要活性成分和別嘌醇與疾病蛋白靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果Table 1 Molecular docking of allopurinol and main active components of AGTF with disease protein targets

圖1 二氫楊梅素與受體蛋白的活性結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 Active binding sites of dihydromyricetin with receptor protein

圖2 二氫楊梅素與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的分子對接模式Fig.2 Molecular docking patterns of dihydromyricetin and disease-related targets

3.2 AGTF 對HUA 大鼠一般情況及腎臟指數(shù)的影響

對照組大鼠體態(tài)正常、精神狀態(tài)良好、活動自如、行動敏捷，無不良癥狀。模型組大鼠排尿增多、毛色較暗且粗糙、體形明顯消瘦，部分大鼠死亡。各給藥組大鼠表現(xiàn)介于對照組和模型組之間。如表2 所示，與對照組比較，模型組大鼠的腎臟指數(shù)明顯增加（P＜0.01），腎臟指數(shù)升高93.71%，表明腺嘌呤聯(lián)用乙胺丁醇可成功誘導(dǎo)大鼠腎功能損傷。與模型組比較，AGTF 能夠明顯降低HUA 大鼠的腎臟指數(shù)（P＜0.01），表明AGTF 對HUA 大鼠具有一定保護(hù)作用。

3.3 AGTF 對HUA 大鼠血清中尿酸水平、XOD 和ADA 活性的影響

如表3 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中尿酸水平、XOD 和ADA 活性均明顯升高（P＜0.01），表明模型大鼠尿酸代謝異常。與模型組比較，AGTF 組大鼠血清尿酸水平、XOD 和ADA 活性均明顯降低（P＜0.05、0.01），表明AGTF 具有改善尿酸代謝和抗HUA 作用。

表2 AGTF 對HUA 大鼠腎臟指數(shù)的影響 ()Table 2 Effect of AGTF on renal index in HUA rats

表2 AGTF 對HUA 大鼠腎臟指數(shù)的影響 ()Table 2 Effect of AGTF on renal index in HUA rats

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05##P＜0.01，下表同*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group,same as belows

組別 劑量/(g·kg-1) 腎臟指數(shù)/(mg·g-1)對照 — 07.90±0.18模型 — 15.30±0.94**別嘌醇 0.05 15.72±0.46 AGTF 0.50 11.60±0.36##0.25 10.51±0.44##

3.4 AGTF 對HUA 大鼠血清中肌酐和尿素氮水平的影響

如表4 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中肌酐和尿素氮水平均明顯升高（P＜0.01），表明模型大鼠腎功能異常。與模型組比較，AGTF 組大鼠血清中肌酐和尿素氮水平均明顯降低（P＜0.01），表明AGTF 能有效改善HUA 大鼠腎功能損傷，保護(hù)腎臟。

表3 AGTF 對HUA 大鼠血清中尿酸水平、XOD 和ADA 活性的影響 ()Table 3 Effect of AGTF on uric acid level,XOD and ADA activities in serum of HUA rats ()

表3 AGTF 對HUA 大鼠血清中尿酸水平、XOD 和ADA 活性的影響 ()Table 3 Effect of AGTF on uric acid level,XOD and ADA activities in serum of HUA rats ()

組別 劑量/(g·kg-1) 尿酸/(μmol·L-1) XOD/(U·L-1) ADA/(U·mL-1)對照 — 040.87±4.64 12.97±0.15 15.06±0.44模型 — 112.08±6.09** 21.13±0.42** 19.59±1.04**別嘌醇 0.05 055.28±5.60## 14.08±0.20## 16.45±0.65##AGTF 0.50 066.87±4.85## 16.30±0.39## 17.22±0.50##0.25 074.37±4.02## 16.79±0.38## 17.86±0.54#

表4 AGTF 對HUA 大鼠血清中肌酐和尿素氮水平的影響()Table 4 Effect of AGTF on creatinine and urea nitrogen levels in serum of HUA rats ()

表4 AGTF 對HUA 大鼠血清中肌酐和尿素氮水平的影響()Table 4 Effect of AGTF on creatinine and urea nitrogen levels in serum of HUA rats ()

組別 劑量/(g·kg-1) 肌酐/(μmol·L-1)尿素氮/(mmol·L-1)對照 — 31.20±3.39 06.30±0.12模型 — 63.21±5.38** 11.09±0.29**別嘌醇 0.05 60.78±2.68 10.53±0.21#AGTF 0.50 33.86±5.67## 08.24±0.22##0.25 38.49±6.50## 09.38±0.33##

3.5 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織病理變化的影響

如圖3 所示，模型組大鼠腎小球基底膜增厚，腎小管結(jié)構(gòu)壞死，間質(zhì)內(nèi)纖維組織增生。AGTF 組大鼠腎臟組織被膜較為完整，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界較為清晰，腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管排列較為整齊，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死的情況相較于模型組較少，偶見腎小管管腔內(nèi)少量中性粒細(xì)胞滲出，病變區(qū)域間質(zhì)內(nèi)纖維組織增生的情況有所減少，病變程度較模型組輕。

圖3 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織病理變化的影響 (HE,×100)Fig.3 Effect of AGTF on pathological change of renal tissue in HUA rats (HE,× 100)

3.6 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織相關(guān)炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

如圖4 和表5 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），表明HUA 伴有局部炎癥反應(yīng)。與模型組比較，AGTF 組大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05、0.01），表明AGTF 能抑制促炎癥因子合成與釋放，減少腎臟間質(zhì)纖維化的形成，有效保護(hù)腎臟組織。

圖4 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of AGTF on expressions of TNF-α,IL-1β,IL-6,and TGF-β in HUA rats

表5 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β 蛋白表達(dá)的影響 ()Table 5 Effect of AGTF on expressions of TNF-α,IL-1β,IL-6,and TGF-β in kidney of HUA rats ()

表5 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β 蛋白表達(dá)的影響 ()Table 5 Effect of AGTF on expressions of TNF-α,IL-1β,IL-6,and TGF-β in kidney of HUA rats ()

組別 劑量/(g·kg-1) 蛋白相對表達(dá)量TNF-α IL-1β IL-6 TGF-β對照 — 0.34±0.07 0.21±0.06 0.32±0.06 0.43±0.05模型 — 1.00±0** 1.00±0** 1.00±0** 1.00±0**別嘌醇 0.05 0.57±0.11## 0.48±0.08## 0.57±0.11## 0.63±0.13##AGTF 0.50 0.39±0.09## 0.35±0.13## 0.36±0.12## 0.53±0.08##0.25 0.82±0.06# 0.64±0.14## 0.70±0.09## 0.76±0.12##

3.7 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織URAT1、GLUT9和ABCG2 蛋白表達(dá)的影響

由圖5～7 和表6 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織尿酸鹽重吸收相關(guān)蛋白URAT1、GLUT9 表達(dá)顯著升高（P＜0.05、0.01），促進(jìn)尿酸鹽排泄相關(guān)蛋白ABCG2 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，AGTF 組大鼠腎臟組織URAT1、GLUT9 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05、0.01），ABCG2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05、0.01），表明AGTF能夠通過抑制尿酸鹽在腎臟的重吸收，促進(jìn)尿酸排泄，從而減輕尿酸鹽沉積對腎臟組織的損傷，起到保護(hù)腎臟組織的作用。

圖5 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織URAT1 蛋白表達(dá)的影響 (×400)Fig.5 Effect of AGTF on expression of URAT1 in kidney of HUA rats (× 400)

圖6 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織GLUT9 蛋白表達(dá)的影響 (×400)Fig.6 Effect of AGTF on expression of GLUT9 in kidney of HUA rats (× 400)

圖7 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織ABCG2 蛋白表達(dá)的影響 (×400)Fig.7 Effect of AGTF on expression of ABCG2 in kidney of HUA rats (× 400)

表6 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織URAT1、GLUT9 和ABCG2 蛋白表達(dá)的影響 ()Table 6 Effect of AGTF on expressions of URAT1,GLUT9,and ABCG2 in kidney of HUA rats ()

表6 AGTF 對HUA 大鼠腎臟組織URAT1、GLUT9 和ABCG2 蛋白表達(dá)的影響 ()Table 6 Effect of AGTF on expressions of URAT1,GLUT9,and ABCG2 in kidney of HUA rats ()

組別 劑量/(g·kg-1) 吸光度值URAT1 GLUT9 ABCG2對照 — 0.248 9±0.004 5 0.232 0±0.003 4 0.244 2±0.003 7模型 — 0.259 2±0.004 6* 0.246 4±0.004 8** 0.237 1±0.005 6**別嘌醇 0.05 0.241 6±0.002 0## 0.235 8±0.001 7# 0.251 8±0.007 6##AGTF 0.50 0.245 9±0.003 0## 0.238 0±0.003 0# 0.250 0±0.005 2#0.25 0.249 0±0.003 5# 0.237 8±0.006 0# 0.251 8±0.005 6##

4 討論

近年來，由于飲食習(xí)慣和生活條件的改變，人們大量攝入高嘌呤食物，HUA 患病率逐年增加，成為僅次于糖尿病嚴(yán)重危害人類健康的“第四高”。腎功能損傷是HUA 臨床最常見并發(fā)癥之一，尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物[28]，尿酸的生成與排泄之間的失衡是直接誘導(dǎo)HUA 腎功能損傷的主要原因，維持正常的血尿酸水平對預(yù)防腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的臨床意義。藤茶作為多民族地區(qū)藥食保健資源具有豐富的活性成分，其開發(fā)價值較大。

XOD 和ADA 是尿酸生成途徑中的重要靶蛋白，在嘌呤分解代謝過程中發(fā)揮著重要作用，抑制其活性可以有效控制血清尿酸水平。腎臟是尿酸排泄的主要器官[29-30]，由于尿酸不能自由通過細(xì)胞膜，腎小管上皮細(xì)胞上的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1、GLUT9 和ABCG2 參與尿酸鹽的分泌與重吸收，為腎臟調(diào)節(jié)尿酸代謝的重要靶點(diǎn)[31]。本研究將AGTF主要活性成分與 HUA的5個潛在治療靶點(diǎn)（URAT1、GLUT9、ABCG2、XOD、ADA）進(jìn)行分子對接模擬，結(jié)果顯示AGTF 中主要活性成分二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素和藤茶素與疾病相關(guān)靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合活性，表明這些成分可能是AGTF 中改善HUA 及其腎功能損傷的潛在藥效物質(zhì)。其中，藤茶素的對接得分最高，其次是二氫楊梅素，目前對藤茶素的藥理活性研究較少，而二氫楊梅素作為AGTF 的主要活性成分，除了在降血糖、調(diào)血脂、抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、保肝護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)等方面具有較好的藥理活性[32-33]，還能夠顯著降低小鼠血清中尿酸水平，具有保護(hù)和治療腎臟損傷的作用[34]。對接結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，別嘌醇與5 個受體蛋白都能自由結(jié)合，其中與XOD 靶點(diǎn)的結(jié)合能最小，表明別嘌醇與XOD 的相互作用最強(qiáng)，與其能夠抑制XOD 從而減少尿酸產(chǎn)生的報道一致[35]。與別嘌醇的對接結(jié)果相比，AGTF 的主要活性成分與5 個受體蛋白發(fā)生相互作用的可能性均高于別嘌醇，提示AGTF 在抗HUA 及其腎功能損傷方面具有潛在的臨床應(yīng)用價值，AGTF 可能通過二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素和藤茶素等活性成分作用于URAT1、GLUT9、ABCG2、ADA 和XOD 靶點(diǎn)，發(fā)揮治療HUA 腎功能損傷的藥效作用，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

基于分子對接結(jié)果，本研究采用腺嘌呤和乙胺丁醇復(fù)合建立大鼠HUA 腎功能損傷模型，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了AGTF 對HUA 腎功能損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。結(jié)果表明，AGTF 組大鼠血清中XOD、ADA 活性和尿酸、肌酐、尿素氮水平均顯著降低，腎臟組織病理學(xué)改變明顯減輕，表明AGTF具有較好的降低血尿酸水平、改善尿酸代謝、減輕高尿酸鹽沉積對腎臟組織損傷的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1、GLUT9 和ABCG2 表達(dá)，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β 蛋白表達(dá)等途徑有關(guān)。AGTF 一方面能明顯抑制URAT1、GLUT9 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，阻礙腎近曲小管尿酸鹽的重吸收；另一方面通過上調(diào)ABCG2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)腎近曲小管外側(cè)膜上的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)速率，促進(jìn)腎臟尿酸鹽的排泄，協(xié)同降低尿酸水平、減少尿酸鹽在腎小管的沉積，從而減輕腎功能損傷。過多的尿酸鹽在腎臟的堆積會刺激腎小管上皮細(xì)胞，促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，AGTF 能夠顯著降低大鼠腎臟中TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β 的蛋白表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎功能，延緩腎臟間質(zhì)纖維化。

綜上所述，本研究通過分子對接技術(shù)結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AGFT 不僅能夠調(diào)節(jié)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1、GLUT9 和ABCG2 的表達(dá)，降低大鼠血清中尿酸代謝相關(guān)指標(biāo)水平，有效改善HUA 和腎臟病理反應(yīng)，同時還能抑制腎臟炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對HUA 腎功能損傷的保護(hù)作用。與分子對接結(jié)果一致，AGTF 能夠直接作用于XOD、ADA、URAT1、GLUT9、ABCG2 關(guān)鍵靶蛋白，從而發(fā)揮其治療作用，表明分子對接結(jié)果具有可靠性和合理性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突