李 雪，王 麗，劉光憲*，涂宗財(cái)

1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江西 南昌 330200 2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022

引 言

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開(kāi)與其糖基化反應(yīng)之間存在較大的相關(guān)性，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)的有化學(xué)試劑[1-2](尿素、二硫蘇糖醇等)、超聲波[3]、動(dòng)態(tài)高壓微射流[4]等，Yang等[3]研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲波可以促進(jìn)卵清蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊，提高糖基化反應(yīng)程度；Zhong等[4]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)高壓微射流在80 MPa以下時(shí)會(huì)使β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)；Huang等[2]研究發(fā)現(xiàn)二硫蘇糖醇可使卵白蛋白的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，糖基化位點(diǎn)從7個(gè)增加至12個(gè)。但是尚未見(jiàn)研究尿素對(duì)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)糖基化產(chǎn)物影響的報(bào)道。

由于大部分蛋白質(zhì)都具有熒光特性，在外力作用或與其他物質(zhì)作用后，其熒光特性和高級(jí)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變。Tang等[5]采用光譜技術(shù)測(cè)定了不同條件下云扁豆蛋白與葡糖糖反應(yīng)的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的變化；Anjana Roy等[6]通過(guò)熒光光譜和圓二光譜分析了葡糖糖修飾血紅素蛋白前后的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)變化；Zhong等[7]采用紫外分析和內(nèi)源熒光光譜分析法，研究了動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)β-乳球蛋白與低聚半乳糖糖基化反應(yīng)前后構(gòu)象的變化，因此，可以運(yùn)用蛋白質(zhì)的光譜學(xué)特性分析不同尿素濃度對(duì)蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物的影響。

血清白蛋白是脊椎動(dòng)物的血漿和血清中含量最高的一種可溶于水的大分子蛋白[8]，含量高達(dá)40 mg·mL-1，約占血漿中總蛋白的52%～62%，具有維持血液滲透壓、調(diào)節(jié)血液pH及轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸、氨基酸、金屬離子、類固醇、藥物等多種物質(zhì)的生理功能[9-10]。其中，BSA是牛血液和牛奶中常見(jiàn)的一種球狀蛋白，其序列與人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)具有76%的同源性，是由583個(gè)氨基酸殘基組成的單肽鏈，是一種常用的模式蛋白，可作為動(dòng)物來(lái)源的代表蛋白[11]。故本文選用BSA為模式蛋白，開(kāi)展相關(guān)研究可為其他動(dòng)物蛋白的糖基化改性提供理論參考。尿素常作為非蛋白氮原料添加至動(dòng)物飼料中，因此，本研究的開(kāi)展可為探索尿素對(duì)動(dòng)物體內(nèi)甚至是人體內(nèi)新陳代謝的影響提供理論支撐。

首先采用不同濃度尿素誘導(dǎo)BSA結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的展開(kāi)，再與葡萄糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)，基于三維熒光光譜、同步熒光光譜、內(nèi)源熒光光譜和紫外光譜技術(shù)分析不同濃度尿素誘導(dǎo)對(duì)BSA糖基化反應(yīng)產(chǎn)物空間結(jié)構(gòu)的影響，揭示尿素對(duì)BSA糖基化的作用規(guī)律，為基于尿素導(dǎo)致的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)對(duì)蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的影響提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑及儀器

BSA、D-葡萄糖均購(gòu)于Sigma化學(xué)試劑公司；尿素、Tris-HCl均為國(guó)產(chǎn)分純。

U-2910紫外光譜掃描儀，日本HITACHI公司；F-7000熒光光譜掃描儀，日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

用pH為7.4濃度為0.05 mol·L-1的Tris-HCl溶液配置成100 mg·mL-1的BSA溶液，用同濃度的Tris-HCl溶液配置尿素溶液，濃度分別為0，1，2，3，4，5，6和7 mol·L-1，尿素濃度0 mol·L-1為本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；在15 mL的離心管中加入0.1 mL BSA溶液，將不同濃度尿素溶液等體積分別加入離心管混合均勻，37 ℃水浴2 h后加入與蛋白質(zhì)量比為1∶1的葡萄糖，60 ℃水浴3 h，樣品制備完成，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 自由氨基的測(cè)定

采用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)法測(cè)定BSA糖基化產(chǎn)物中自由氨基的含量，OPA試劑的配制方法參照文獻(xiàn)[12]。取200 μL樣品溶液，加入配好的OPA試劑溶液4.0 mL，混勻，35 ℃避光反應(yīng)2 min，于340 nm處測(cè)定其吸光值，空白采用200 μL蒸餾水。以賴氨酸做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中自由氨基的含量。

1.2.3 內(nèi)源熒光光譜分析

對(duì)不同濃度尿素處理的BSA糖基化樣品溶液(1 mg·mL-1)進(jìn)行內(nèi)源熒光光譜分析。內(nèi)源熒光參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為300～500 nm，掃描速度為240 nm·min-1，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm。

1.2.4 同步熒光光譜分析

對(duì)不同濃度尿素處理的BSA糖基化樣品溶液(1 mg·mL-1)進(jìn)行同步熒光熒光光譜分析。固定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的間隔為Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，在25 ℃下掃描同步熒光光譜。

1.2.5 紫外光譜分析

對(duì)不同濃度尿素處理的BSA糖基化樣品溶液(1 mg·mL-1)進(jìn)行紫外掃描，掃描范圍為190～450 nm，掃描速度為200 nm·min-1，狹縫寬度為1.50 nm。

1.2.6 三維熒光光譜分析

對(duì)不同濃度尿素處理的BSA和3 mol·L-1尿素濃度處理的糖基化BSA樣品溶液(1 mg·mL-1)進(jìn)行三維熒光熒光光譜分析。三維熒光分析的參數(shù)為激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍：200～600 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍：200～600 nm，掃描速率為12 000 nm·min-1，狹縫寬為5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 自由氨基含量變化

BSA的糖基化反應(yīng)是葡萄糖分子的羰基與蛋白質(zhì)分子的氨基通過(guò)共價(jià)鍵相互交聯(lián)而形成的糖蛋白化學(xué)反應(yīng)，因此BSA自由氨基含量的變化可以反映其糖基化程度。從圖1可以看出，經(jīng)過(guò)不同濃度尿素處理的BSA，其糖基化產(chǎn)物的自由氨基含量均顯著下降。這說(shuō)明尿素處理可使BSA分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的伸展，使BSA分子中的氨基暴露在蛋白質(zhì)分子表面，葡萄糖的羰基更易與BSA分子中的氨基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)了BSA與葡萄糖的糖基化反應(yīng)。故經(jīng)過(guò)尿素處理的BSA，其糖基化產(chǎn)物中的自由氨基含量均顯著下降。從圖1還可看出，在尿素濃度為3 mol·L-1時(shí)，BSA糖基化產(chǎn)物的自由氨基含量降至最低為8.75 mg·kg-1，糖基化程度達(dá)到最大。而高濃度尿素(4～7 mol·L-1)處理的BSA糖基化產(chǎn)物的自由氨基含量高于尿素濃度為3 mol·L-1時(shí)的自由氨基含量，可能是由于高濃度的尿素對(duì)BSA的糖基化反應(yīng)形成了空間位阻，阻礙了葡萄糖分子與BSA分子的共價(jià)交聯(lián)。

圖1 不同濃度尿素處理的BSA糖基化產(chǎn)物的自由氨基含量分析Fig.1 The free amino group content of glycosylation of BSA treated with different concentrations of urea

2.2 內(nèi)源熒光光譜分析

BSA的內(nèi)源性熒光主要來(lái)自分子內(nèi)部的色氨酸殘基(Trp)、酪氨酸殘基(Tyr)和苯丙氨酸殘基(Phe)，其中BSA分子中Trp殘基的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Tyr殘基和Phe殘基，因此可以用BSA分子中的Trp殘基作為內(nèi)源熒光探針來(lái)分析不同尿素濃度對(duì)BSA糖基化產(chǎn)物內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的影響。

從圖2可以看出，尿素的加入使BSA糖基化產(chǎn)物的內(nèi)源熒光強(qiáng)度顯著下降，且隨著尿素濃度的增加BSA糖基化產(chǎn)物的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度呈逐漸降低的趨勢(shì)。BSA有兩個(gè)色氨酸殘基Trp134和Trp213(如圖3所示)，其中Trp213位于BSA分子疏水腔內(nèi)，而Trp134位于BSA分子表面[13]，因此引起B(yǎng)SA糖基化產(chǎn)物內(nèi)源性熒光強(qiáng)度顯著下降的原因可能是由于尿素誘導(dǎo)后的BSA發(fā)生了去折疊，降低了Trp殘基之間的能量傳遞，導(dǎo)致BSA分子疏水腔內(nèi)的Trp213外翻至分子表面，且隨著尿素濃度的增加，Trp213逐漸暴露于溶劑中，從而發(fā)生熒光猝滅，使得糖基化產(chǎn)物的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度顯著下降。從圖2還可以看出尿素濃度為1～4 mol·L-1時(shí)，BSA糖基化產(chǎn)物的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了輕微的藍(lán)移(從340到336 nm)，這是由于BSA與葡萄糖糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后，Trp所處的微環(huán)境發(fā)生變化，疏水性增加，使得BSA糖基化產(chǎn)物的最大發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移。此外，與對(duì)照樣品對(duì)比，當(dāng)尿素濃度大于4 mol·L-1，最大發(fā)射波長(zhǎng)逐漸發(fā)生紅移，從336 nm紅移至340 nm，這可能是由于高濃度的尿素處理使得Trp殘基周圍環(huán)境的疏水性降低，親水性增加，BSA分子已經(jīng)完全伸展變形，使Trp殘基完全暴露于溶劑中。

圖2 不同濃度尿素處理的BSA糖基化產(chǎn)物的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of glycosylation of BSA treated with different concentrations of ureaa→b：0，1，2，3，4，5，6，7 mol·L-1

圖3 BSA的空間結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The space structure of BSA

2.3 同步熒光光譜分析

蛋白質(zhì)的同步熒光光譜已被廣泛用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，是一種快速、靈敏、無(wú)損的分析方法，可用來(lái)研究蛋白質(zhì)分子中發(fā)色基團(tuán)空間結(jié)構(gòu)的變化以及周圍微環(huán)境的變化。由于內(nèi)源熒光無(wú)法區(qū)分BSA分子中Trp殘基和Tyr殘基的熒光光譜，因此，采用同步熒光光譜法測(cè)定不同濃度尿素處理的BSA糖基化樣品空間結(jié)構(gòu)的變化。Δλ=15 nm同步熒光光譜顯示BSA糖基化產(chǎn)物中Tyr殘基的光譜特征，Δλ=60 nm所得到的同步熒光光譜圖顯示BSA糖基化產(chǎn)物中Trp殘基的熒光光譜特征，其殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與BSA糖基化產(chǎn)物所處的環(huán)境極性有關(guān)，如果最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生改變，說(shuō)明殘基所處的微環(huán)境發(fā)生改變。圖4為不同濃度尿素處理對(duì)BSA糖基化產(chǎn)物同步熒光強(qiáng)度的影響。如圖4(a)所示，在BSA濃度固定在1 mg·mL-1時(shí)，隨著尿素濃度的增加，1～3 mol·L-1尿素濃度處理后BSA最大發(fā)射波長(zhǎng)的強(qiáng)度高于未加尿素對(duì)照組，而4～7 mol·L-1的尿素濃度處理后的BSA最大發(fā)射波長(zhǎng)的強(qiáng)度低于未加尿素對(duì)照組，且Tyr殘基的特征熒光光譜峰位置發(fā)生藍(lán)移，說(shuō)明經(jīng)過(guò)4～7 mol·L-1尿素處理之后的BSA糖基化產(chǎn)物的Tyr殘基所在的微環(huán)境發(fā)生改變，疏水性增加，親水性降低。對(duì)比圖4(a)和(b)可知，Trp殘基的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Tyr殘基的熒光強(qiáng)度，而且相比Tyr殘基的熒光強(qiáng)度，Trp殘基的熒光強(qiáng)度下降更為顯著，表明尿素與BSA的結(jié)合點(diǎn)更接近于Trp殘基，但同時(shí)Trp殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)略有藍(lán)移，說(shuō)明其附近的疏水性發(fā)生一定程度地增強(qiáng)，極性減小，疏水性增加，BSA分子發(fā)生去折疊，Trp殘基由分子內(nèi)部展開(kāi)至蛋白質(zhì)表面。

圖4 不同濃度尿素處理的BSA糖基化產(chǎn)物的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra after glycosylation of BSA in different urea treatments(a)：Δλ=15 nm,(a→b):1，2，3，0，4，5，6，7 mol·L-1;(b)：Δλ=60 nm，(a→b):0，1，2，3，4，5，6，7 mol·L-1

2.4 紫外光譜掃描分析

紫外掃描分析是一種簡(jiǎn)單易行的分析蛋白質(zhì)空間構(gòu)象變化的方法[14]。BSA在紫外區(qū)(190～450 nm)有紫外吸收，這與BSA分子中的芳香族氨基酸Trp，Tyr和Phe具有密切的關(guān)系。因此，可采用紫外掃描的方法來(lái)研究不同濃度尿素處理對(duì)BSA糖基化產(chǎn)物空間結(jié)構(gòu)的影響。由圖5可知，經(jīng)尿素處理后的BSA糖基化產(chǎn)物的紫外吸收值均大于對(duì)照組，而且3 mol·L-1尿素濃度處理后的BSA糖基化產(chǎn)物的紫外吸收值均大于其他濃度，說(shuō)明尿素的加入，在不同程度上打開(kāi)了BSA的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，使BSA分子內(nèi)部的芳香族氨基酸殘基暴露于蛋白質(zhì)表面；也可能是尿素處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，從而有利于BSA與葡萄糖發(fā)生羰胺縮合反應(yīng)，產(chǎn)生較多的糖基化產(chǎn)物羥甲基糠醛，其在278 nm附近也有紫外吸收[15]，且在3 mol·L-1的尿素濃度時(shí)最有利于糖基化產(chǎn)物的生成，此結(jié)果與上述自由氨基含量的測(cè)定結(jié)果一致。

圖5 不同濃度尿素處理BSA糖基化樣品的紫外掃描光譜Fig.5 Ultraviolet scanning spectra after glycosylation of BSA in different urea treatmentsa→b:3，4，5，7，6，2，1，0 mol·L-1

2.5 尿素對(duì)BSA三維熒光光譜的影響

從糖基化樣品(尿素添加量為3 mol·L-1)的三維熒光光譜圖(圖6)和表1分析可發(fā)現(xiàn)，糖基化后BSA的熒光峰Ex/Em出現(xiàn)在280/370，與未糖基化反應(yīng)的BSA和3 mol·L-1尿素濃度處理的BSA相比，其三維熒光有顯著差異，最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了5和10 nm的藍(lán)移，該現(xiàn)象表明經(jīng)過(guò)尿素處理的BSA糖基化產(chǎn)物的肽鏈骨架發(fā)生了空間構(gòu)象變化，其高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，BSA環(huán)境的疏水性增加，極性減小，該結(jié)果與同步熒光的研究結(jié)果一致。

表1 典型三維熒光峰Table 1 Typical three-dimensional fluorescence peaks

圖6 不同濃度尿素處理的BSA和糖基化BSA產(chǎn)物的三維熒光光譜圖Fig.6 3D fluorescence spectra after glycosylation of BSA and BSA in different urea treatments

3 結(jié) 論

利用光譜技術(shù)來(lái)研究不同尿素濃度對(duì)BSA糖基化反應(yīng)產(chǎn)物空間結(jié)構(gòu)的影響，得到以下結(jié)論：

(1)通過(guò)內(nèi)源熒光光譜分析可以看出，尿素的加入會(huì)使BSA分子去折疊從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)，導(dǎo)致其糖基化產(chǎn)物的內(nèi)源性熒光發(fā)生猝滅。

(2)通過(guò)同步熒光光譜分析得出BSA與尿素的結(jié)合點(diǎn)更接近于Trp殘基。

(3)通過(guò)自由氨基和紫外吸收光譜分析得出BSA分子在尿素的誘導(dǎo)下緊密的空間結(jié)構(gòu)變得松散，芳香族氨基酸暴露至表面，可促進(jìn)糖基化反應(yīng)進(jìn)行，且3 mol·L-1尿素濃度下最有利與糖基化產(chǎn)物的生成。

(4)通過(guò)三維熒光光譜分析得出隨著尿素濃度的增加，BSA的最大發(fā)射波長(zhǎng)先紅移再藍(lán)移，經(jīng)3 mol·L-1尿素誘導(dǎo)的BSA糖基化產(chǎn)物的肽鏈骨架的空間構(gòu)象發(fā)生變化。