馬 穎，董瑞瑞，Benjamin T.Fuller，魏書亞

1.北京科技大學(xué)，北京 100083 2.Department of Archaeology and Heritage Studies,School of Culture and Society,Aarhus University, Moesg?rd Allé 20,DK-8270,H?jbjerg,Denmark

引 言

近年來，考古遺址出土的人和動(dòng)物骨骼逐漸得到了越來越多考古學(xué)家的重視。除了傳統(tǒng)體質(zhì)人類學(xué)、形態(tài)學(xué)等工作的開展，更多自然學(xué)科，包括古DNA、古蛋白學(xué)、地球化學(xué)等方法的介入，極大的豐富了考古學(xué)相關(guān)研究。這其中，針對(duì)人和動(dòng)物骨骼提取的骨膠原進(jìn)行的穩(wěn)定同位素分析是重建古代先民食譜，古營養(yǎng)以及古環(huán)境的重要手段[1]。

在考古學(xué)中，一般以人骨膠原的δ15N值高于同一個(gè)考古學(xué)地點(diǎn)的草食性動(dòng)物骨膠原的δ15N值的程度，來估算人類營養(yǎng)位置或動(dòng)物蛋白在人類飲食中的比例[2]。這些基于骨膠原的穩(wěn)定同位素分析，整合了樣品中所有含氮實(shí)體，盡管可以提供很多信息，但也存在一定的問題。這些大分子的δ15N值常受到多種因素的影響。例如，當(dāng)研究個(gè)體受到疾病、創(chuàng)傷、生長過快、饑餓、懷孕等各種生理壓力的影響時(shí)，其氮的代謝會(huì)出現(xiàn)異常，因此會(huì)導(dǎo)致我們做出錯(cuò)誤的判斷[3]。

在一些特殊的環(huán)境下，如干旱地區(qū)，動(dòng)植物的δ15N含量異常豐富，這就使得基于氮同位素的營養(yǎng)位置解釋變得模棱兩可[4]。同時(shí)，農(nóng)作物的施肥也會(huì)對(duì)動(dòng)植物的δ15N值產(chǎn)生極大影響[5]。這種對(duì)農(nóng)作物δ15N值的影響會(huì)導(dǎo)致食用施肥作物的人的骨膠原δ15N值遠(yuǎn)高于食用未經(jīng)施肥農(nóng)作物的草食動(dòng)物的骨膠原δ15N值，從而導(dǎo)致對(duì)飲食中動(dòng)物蛋白攝入的高估。

鑒于此，對(duì)考古學(xué)而言，目前急需一種更有力的手段精細(xì)對(duì)古代食譜的研究。而基于單分子氨基酸的同位素分析技術(shù)可在分子水平上對(duì)膠原蛋白進(jìn)行分析，并能克服大分子同位素固有的不確定性，對(duì)古代先民營養(yǎng)級(jí)位置進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，展現(xiàn)了極大的潛力可用于古代食譜的重建研究。

本研究對(duì)考古遺址出土的人和動(dòng)物骨骼開展基于單分子氨基酸氮同位素分析的嘗試性研究，以期能獲取古代先民精確的營養(yǎng)級(jí)信息，了解古代先民食物結(jié)構(gòu)差異，從而為進(jìn)一步討論人類等級(jí)分化，社會(huì)階層出現(xiàn)等考古學(xué)問題提供新的見解。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品及考古遺址背景

選取突尼斯迦太基城凡達(dá)里奇墓地出土的人和動(dòng)物骨骼，共計(jì)14例樣品，其中人骨骨骼10具，動(dòng)物樣品4具，詳細(xì)取樣信息見表1。該遺址位于北非突尼斯迦太基城北城墻外向西200 m處，根據(jù)墓葬出土陶器和錢幣特征，推測該墓地的使用年代在5世紀(jì)中期至6世紀(jì)早期，為迦太基汪達(dá)爾時(shí)期的墓葬群[6]。

表1 突尼斯迦太基城凡達(dá)里奇墓地出土人和動(dòng)物樣品信息Table 1 Sampling information of human and faunal skeletons excavated from Vandalic cemetery in Carthage,Tunisia

樣品的年齡估計(jì)和性別判定由體質(zhì)人類學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法確定[7]。實(shí)驗(yàn)選擇肋骨和長骨碎片進(jìn)行膠原蛋白提取和同位素分析。動(dòng)物遺骸，包括牛，豬，羊等種屬，用作同位素基線，便于與人類結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2 樣品處理

每個(gè)個(gè)體稱取300～500 mg骨樣，噴砂槍去除骨樣表面污染后，5 ℃下置于0.5 mol·L-1HCl溶液浸泡，每隔2～3 d換新鮮酸液，直至骨樣松軟、無明顯氣泡為止。再用去離子水洗至中性，在0.01 mol·L-1的HCl溶液下70 ℃明膠化48 h，熱濾，經(jīng)過Millipore Amicon Ultra filter超濾后收集分子量>30 K的溶液，冷凍干燥，收集明膠化的骨膠原。最后稱重，計(jì)算膠原蛋白提取率。

骨膠原水解根據(jù)文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行改進(jìn)[8]。稱取約1.0 mg膠原蛋白并加入0.5 mL 6N HCl，110 ℃加熱20 h，將膠原蛋白水解成單個(gè)氨基酸。水解后，將溶液在60 ℃氮?dú)庀麓蹈?，加?00 μL 0.1 N HCl，-60 ℃下保存。我們在Corr等提出的N-乙?；惐?NAIP)衍生化方法上進(jìn)行了較小的修改[9]。用1.8 mL乙酸乙酯將樣品提取到GC樣品瓶中，并在冰箱(4 ℃)中放置過夜。室溫下吹干后，將NAIP重新溶解在二氯甲烷中并調(diào)節(jié)至所需體積。每個(gè)樣品中加入正亮氨酸(500 μL，0.2 mg·mL-1)作為內(nèi)標(biāo)。

1.3 方法

樣品骨膠原C和N元素含量及穩(wěn)定同位素的測試儀器為Flash EA 2112元素分析儀串聯(lián)Thermo-Finnigan Delta XP穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀。

單分子氨基酸氮同位素比值在通過GC Combustion Ⅲ接口與Delta V Plus同位素比質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)(GC-C-IRMS)連接的Agilent 6890N氣相色譜儀上進(jìn)行[10]。

測樣采用序列樣品，由一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，兩個(gè)質(zhì)量控制樣品和四至五個(gè)樣品組成。每個(gè)樣品的報(bào)告值是一式三份測定的平均δ15N值。與這些三次重復(fù)分析相關(guān)的平均誤差為0.6σ。衍生氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的平均誤差為±0.9‰。

2 結(jié)果與討論

所有樣品的骨膠原蛋白提取率均>1%，原子C∶N在2.9～3.6之間，保存質(zhì)量良好。樣品骨膠原穩(wěn)定碳、氮同位素與單分子氨基酸氮同位素分析結(jié)果詳見表2。對(duì)樣品骨膠原δ13C和δ15N繪制散點(diǎn)圖，如圖1所示。

圖1 狄奧多西墓地出土人和動(dòng)物樣品骨膠原碳、氮同位素值散點(diǎn)圖Fig.1 Bulk collagen δ13C and δ15N results from the Carthage Vandalic cemetery,Tunisia

表2 骨膠原穩(wěn)定同位素及單分子氨基酸同位素測試結(jié)果Table 2 Bulk isotopic information and amino acids nitrogen isotopic results of human and faunal samples

四個(gè)陸生動(dòng)物的δ13C值在-20.7‰～-21.9‰之間，δ15N值在6.1‰～8.3‰，相差不大。牛和羊的δ15N值較為接近，體現(xiàn)了較為明顯的食草類動(dòng)物特性。豬的δ15N值較牛和羊高近2‰，豬是雜食性動(dòng)物，其可能攝入了一定量動(dòng)物蛋白而導(dǎo)致其氮同位素值有所富集。10個(gè)人的δ13C值均值為-19.6‰±0.5‰，分布在-18.8‰～-20.9‰之間，這說明該遺址居民主要以C3類食物為主。人的δ15N值平均值為11.1‰±1.3‰，較高的δ15N值表明該遺址先民飲食攝入有大量的動(dòng)物蛋白。δ15N值在8.7‰～13‰之間，表明不同個(gè)體存在較大差異，最高的個(gè)體與最低的個(gè)體δ15N值相差3.3‰，顯示先民在肉食資源的獲取方式上顯著不同。個(gè)體Aus01具有明顯最高δ15N值13‰,有可能攝取了一定比例的水生/海洋蛋白，但也無法排除是否由其他高N背景值的地區(qū)遷徙而來的可能。

在骨膠原的20種氨基酸中，我們獲得了4種必要氨基酸(苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和賴氨酸)(Phe，Val，Leu，Lys)和7種非必要氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸，羥脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)(Ala，Gly，Ser，Pro，Hyp，Asx，Glx)。圖2所示具有代表性的樣品(Aus105：羊)的色譜保留時(shí)間圖。所有氨基酸均通過氣相色譜進(jìn)行基線分離，由于本研究主要考察兩種氨基酸(苯丙氨酸和谷氨酸)的氮同位素值，所以僅在此報(bào)道δ15Nphe和δ15NGlu值。

圖2 代表性(Aus105：羊)樣品的色譜分離及保留時(shí)間圖Fig.2 Representative GC-C-IRMS chromatogram showing the individual bone collagen amino acids separated and retention times (Sample:Aus 105，sheep)TPAA=((δ15NGlu-δ15NPhe+8.4)/7.6)+1[13]

人和動(dòng)物的δ15Nphe在9.4‰～10.7‰之間，平均值為10.5‰±0.7‰，并不存在明顯不同。這表明，人和陸生動(dòng)物的食物源相似，因?yàn)楸奖彼岬摩?5N值在食物和消費(fèi)者間的富集非常小，僅0.4‰。而δ15NGlu值差異顯著，在8.8‰～16.7‰間，均值為14‰±2.5‰。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室飼喂實(shí)驗(yàn)和田間生態(tài)研究的結(jié)果，δ15NGlu值隨著營養(yǎng)級(jí)升高而遞增[11]。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，C3類植物和C4類植物Δ15NGlu-Phe值具有顯著差異，一般C3類植物在-8.4‰左右，而C4類植物在0.4‰左右。不同生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)體的營養(yǎng)級(jí)位置可基于特定的方程而進(jìn)行量化[12]。其中，陸地C3類生態(tài)系統(tǒng)的計(jì)算方程式可表達(dá)為

基于上述公式對(duì)個(gè)體營養(yǎng)級(jí)的判斷相比于全組分骨膠原氮同位素比值具有更大的優(yōu)勢，因?yàn)樗麄儫o需利用初級(jí)生產(chǎn)者，即食物網(wǎng)基底的植物的δ15N進(jìn)行表征，而是利用了單個(gè)生物體內(nèi)兩個(gè)氨基酸之間的同位素間距。因此，通過關(guān)注這些特殊的氨基酸，即可更精確的估算每種生物營養(yǎng)級(jí)位置并重建食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)。根據(jù)陸地C3類生態(tài)系統(tǒng)的計(jì)算方程式，對(duì)本遺址樣品進(jìn)行營養(yǎng)級(jí)位置估算，并對(duì)每個(gè)樣本繪制δ15Nphe和δ15NGlu交叉參數(shù)分布圖。詳見圖3。

圖3 人和動(dòng)物樣品苯丙氨酸和谷氨酸的氮同位素值散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of δ15NGlu and δ15NGlu values for the human and fauna samples

可以看出，食草類動(dòng)物牛和羊的營養(yǎng)級(jí)位置在2左右(牛為2.0，羊稍低為1.8)，符合生物學(xué)預(yù)期的營養(yǎng)級(jí)位置。豬的營養(yǎng)級(jí)位置在2.1，僅微高于食草類動(dòng)物，表明豬的飲食中蛋白的成分應(yīng)該非常少。人的營養(yǎng)級(jí)位置從2.0到3.0，個(gè)體間差異較大。1個(gè)個(gè)體(Aus 16)具有最低的數(shù)值2.1，落于食草動(dòng)物和豬的數(shù)值間，表明該個(gè)體應(yīng)處于營養(yǎng)級(jí)的最低端，基本沒有動(dòng)物性蛋白的攝入。絕大多數(shù)個(gè)體營養(yǎng)級(jí)位于2.9左右，表明這群個(gè)體攝入了相當(dāng)高的肉食資源，位于陸生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的頂端。有2～3個(gè)個(gè)體在2.6～2.7間，表明這些個(gè)體攝入的肉食蛋白比例相對(duì)低于其他個(gè)體(除Aus16)。

將利用δ15NPhe和δ15NGlu值計(jì)算出的營養(yǎng)級(jí)位置與應(yīng)到個(gè)體骨膠原穩(wěn)定氮同位素值進(jìn)行對(duì)比(見圖4)。以個(gè)體Aus1和Aus36為例，其δ15N值分別為13‰和10.6‰，相差近2.4‰。若僅用骨膠原δ15N值對(duì)其蛋白攝入情況進(jìn)行判斷，會(huì)認(rèn)為這兩個(gè)個(gè)體對(duì)肉食資源的攝取可能存在一定的差異。然而其苯丙氨酸和谷氨酸的氮同位素值表明其在營養(yǎng)級(jí)中都處于相同的位置2.9。而Aus16和Aus23兩個(gè)個(gè)體則存在正好相反的情況。這兩個(gè)個(gè)體具有非常接近的骨膠原δ15N值，分別為8.7‰和8.9‰，暗示其應(yīng)該有著相似的蛋白攝入。然而單分子氨基酸氮同位素δ15NPhe和δ15NGlu值表明，其處于營養(yǎng)級(jí)的不同位置，2.0和2.6，即對(duì)肉食蛋白的攝入存在顯著差異。Aus16個(gè)體為單純的素食者，而Aus23個(gè)體攝入了相當(dāng)量的動(dòng)物性蛋白。

圖4 人和動(dòng)物樣品營養(yǎng)級(jí)位置與骨膠原氮同位素值散點(diǎn)圖Fig.4 Bulk δ15N values vs.trophic position for the human and fauna samples

根據(jù)骨膠原δ15N值對(duì)營養(yǎng)級(jí)情況進(jìn)行的判斷與由單分子氨基酸δ15NPhe和δ15NGlu值得出的結(jié)果存在一定程度的差異。前文所講，骨膠原δ15N值是個(gè)體組成所有氨基酸δ15N值的整合，而個(gè)體間由于生理代謝或其他原因造成的差異往往被抵消，得不到應(yīng)有的體現(xiàn)[14]。因此，僅利用骨膠原δ15N值分析個(gè)體蛋白攝入情況及判斷其營養(yǎng)級(jí)位置可能會(huì)與個(gè)體真實(shí)的情況有較大的出入。以往的研究中，很多不同社會(huì)等級(jí)或不同性別、貧富差距的人群間，其骨膠原δ15N值并沒有發(fā)現(xiàn)顯著不同[15]。而本研究結(jié)果表明，僅利用骨膠原δ15N值可能在一定程度上忽略了個(gè)體食譜結(jié)構(gòu)的差異，從而導(dǎo)致先民食譜的均一性。本研究結(jié)果對(duì)探尋人群食譜差異的研究提供了新的思路和證據(jù)，利用基于單分子氨基酸的同位素分析將提供個(gè)體更為準(zhǔn)確的營養(yǎng)級(jí)位置信息，進(jìn)一步提高對(duì)不同人群食譜結(jié)構(gòu)差異研究的分辨率。

3 結(jié) 論

通過對(duì)突尼斯迦太基凡達(dá)里奇墓地出土人和動(dòng)物骨骼進(jìn)行骨膠原穩(wěn)定碳氮同位素和單分子氨基酸同位素分析。研究表明，利用單分子氨基酸氮同位素比值對(duì)古代先民所處營養(yǎng)級(jí)位置能做出更為準(zhǔn)確的判斷，在揭示古代人類食譜差異上具有不可比擬的優(yōu)勢。對(duì)考古遺址出土人和動(dòng)物骨骼開展該分析將極大提高古代食譜重建工作的分辨率，為精細(xì)化研究古代人群及社會(huì)提供重要依據(jù)。