范俊平，肖 盟，王京嵐，陳 雨，張 棟，夏 鵬，柯帆航，趙 靜，楊燕麗，孫雪峰，趙 穎，徐英春

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 1呼吸與危重癥醫(yī)學科 2檢驗科 3腎內科，北京 100730 4中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院臨床醫(yī)學八年制，北京 100730

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)已成為肆虐全球的大流行性疾病，與2009年的H1N1流感疫情相比，此次疫情的危重癥患者比率明顯升高，約5%需轉入ICU治療[1]。危重癥COVID-19患者，特別是轉入ICU的患者易繼發(fā)感染，預后較差[2-3]。對繼發(fā)感染者呼吸道標本進行涂片、培養(yǎng)、分離和鑒定以明確病原體是治療的關鍵，亦可減少不必要的抗生素尤其是廣譜抗生素的使用[4]。但傳統(tǒng)病原菌培養(yǎng)方法靈敏度差、耗時長，而重癥患者病情變化快，對檢測的時限性要求高，傳統(tǒng)檢測方法難以滿足。近年來，雖然包括新一代測序技術在內的分子病原學診斷得到快速發(fā)展，但由于呼吸道本身存在定植病原體，分子技術檢測過于敏感，難以準確區(qū)分定植和致病病原體。此外，分子檢測手段常需外送標本，耗時亦較久，限制了其廣泛應用[5]。

梅里埃診斷的Biofire Filmarray下呼吸道試劑盒(pneumonia panel,PN)是一種新開發(fā)的商業(yè)化病原學診斷技術，其將巢式多重PCR(nested multiplex PCR)與實時PCR(real-time PCR)相結合，可在同一試劑盒中執(zhí)行核酸提取、擴增、檢測和數(shù)據(jù)分析整個過程，并提供半定量報告。該試劑盒涵蓋18種常見細菌性病原體、9種病毒和7種耐藥基因(表1)，其應用已得到美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)的批準[6]。作為一種床旁檢測技術(point-of-care testing,POCT)，Biofire Filmarray PN樣品準備時間僅數(shù)分鐘，約1 h即可出檢測結果，是一種方便快捷的下呼吸道病原學檢測手段。本研究旨在探討B(tài)iofire Filmarry PN在危重癥COVID-19繼發(fā)感染患者病原體檢測中的應用效果。

表1 Biofire Filmarray下呼吸道試劑盒檢測靶標分類

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究為回顧性分析。回顧性收集并分析2020年2月至4月武漢同濟醫(yī)院中法新區(qū)收入ICU(北京協(xié)和醫(yī)院援鄂醫(yī)療隊整建制接管該ICU病房)且接受下呼吸道病原學檢測的危重癥COVID-19患者的臨床資料。所有患者均經口咽或鼻咽拭子PCR檢測確診為COVID-19，經臨床表現(xiàn)及影像學表現(xiàn)確定為重型/危重型。

本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會審批(審批號：ZS-2326)。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集

通過醫(yī)院信息系統(tǒng)收集患者基線資料、治療和預后信息，包括性別、年齡、基礎疾病、起病癥狀、危重癥評分等。

1.2.2 標本獲取和送檢

患者轉入ICU后，由臨床醫(yī)生決定采集下呼吸道病原學的指征和時機，由有經驗的呼吸與危重癥醫(yī)學科醫(yī)師使用Ambu Scope床旁支氣管鏡系統(tǒng)對患者進行支氣管鏡檢查，選取影像有提示或有膿性分泌物的部位進行灌洗，獲取支氣管肺泡灌洗液后立即送檢。2020年3月之前因臨床微生物實驗室無法使用，僅采用Biofire Filmarray PN(梅里埃診斷中國公司免費捐贈)進行檢測，之后同一份標本同時送檢Biofire Filmarray PN及微生物實驗室進行普通培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)學處理

采用Microsoft Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)描述和整理，氧合指數(shù)、采集標本距轉入ICU時間等計量資料符合正態(tài)性分布，以均數(shù)±標準差表示；年齡為偏態(tài)分布計量資料，以中位數(shù)(四分位數(shù))表示；性別、合并疾病、臨床癥狀所占比率等計數(shù)資料以頻數(shù)(百分率)表示。

2 結果

2.1 一般臨床資料

共21例符合納入標準的危重癥COVID-19患者入選本研究。其中，男性12例(57.1%)，女性9例(42.9%)；中位年齡66(53,80)歲；合并高血壓10例(47.6%)，糖尿病5例(23.8%)，腦血管病4例(19.1%)，冠心病3例(14.3%)，慢性呼吸系統(tǒng)疾病2例(9.5%)；起病癥狀分別為發(fā)熱18例(85.7%)，呼吸困難15例(71.4%)，咳嗽14例(66.7%)，乏力11例(52.4%)，咳痰10例(47.6%)，肌痛6例(28.6%)；入ICU時急性生理學和慢性健康狀況評分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)評分為(14.1±4.4)分，序貫器官衰竭評分(sequential organ failure assessment,SOFA)為(5.9±2.2)分，氧合指數(shù)為(129.2±79.8) mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。

21例患者均行氣管插管及機械通氣，均接受廣譜抗生素治療。共送檢下呼吸道標本54份，均為肺泡灌洗液，包括Biofire Filmarray PN 檢測33份(61.1%)，普通培養(yǎng)21份(38.9%)，其中19對(38份)為“背靠背”送檢Biofire Filmarray PN和普通培養(yǎng)。獲取各標本的時間距起病時間為(44.9±15.5)d，距插管時間為(20.6±11.7)d，距轉入ICU時間為(16.4±11.1)d。

2.2 下呼吸道標本培養(yǎng)回報結果

Biofire Filmarray PN組結果回報時間約為1 h，21例患者中共20例32份回報陽性，陽性率為97.0%(32/33)。其中30份回報病原體大于1種，回報病原體共計74例次，包括鮑曼不動桿菌復合體29例次(39.2%)，銅綠假單胞菌21例次(28.4%)，肺炎克雷伯菌16例次(21.6%)，大腸桿菌5例次(6.8%)，陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌及呼吸道合胞病毒各1例次(1.4%)。半定量分析顯示，細菌性病原體≥107拷貝數(shù)/mL 28例次(38.4%)，106拷貝數(shù)/mL 18例次(24.7%)，105拷貝數(shù)/mL 14例次(19.2%)，104拷貝數(shù)/mL 13例次(17.8%)。耐藥基因共56例次，其中 CTX-M 24例次(42.9%)、KPC 19例次(33.9%)、NDM 10例次(17.9%)、IMP 2例次(3.6%)、VIM 1例次(1.8%)(表2)。

表2 Biofire Filmarray PN組下呼吸道標本病原體回報結果半定量分析(n)

共14例患者21份標本送檢普通培養(yǎng)，該組結果回報時間約為3 d，其中11例患者16份標本回報陽性，陽性率為76.2%(16/21)。其中3份回報病原體大于1種，檢出病原體19例次，包括銅綠假單胞菌8例次(42.1%)，鮑曼不動桿菌6例次(31.6%)，嗜麥芽窄食單胞菌4例次(21.1%)，粘金黃桿菌1例次(5.3%)。半定量分析顯示，“+++ ”10例次，“++”8例次，“+”1例次(表3)。

表3 普通培養(yǎng)組下呼吸道標本病原體回報結果半定量分析(n)

2.3 Biofire Filmarray下呼吸道試劑盒組和普通培養(yǎng)組結果一致性分析

因Biofire Filmarray PN組每份標本陽性結果多大于1種，故僅列出拷貝數(shù)最高的病原體及其拷貝數(shù)；普通培養(yǎng)組則列出鑒定的最高菌量的菌株和菌量(表4)。兩組對比發(fā)現(xiàn)，19對(38份)“背靠背”送檢標本中，Biofire Filmarray PN組和普通培養(yǎng)組結果吻合者為15對，一致率為78.9%(15/19)。在不一致的4對標本中，3例普通培養(yǎng)結果為陰性，Biofire Filmarray PN檢測為陽性，另1例普通培養(yǎng)為嗜麥芽窄食單胞菌，該菌不在Biofire Filmarray PN的檢測靶標內(檢出大腸桿菌)。此外，普通培養(yǎng)組未分離到肺炎克雷伯菌，Biofire Filmarray PN組則回報16例肺炎克雷伯菌陽性，但拷貝數(shù)均相對較低。另Biofire Filmarray PN組檢出大腸桿菌、陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌及呼吸道合胞病毒各1例。

表4 Biofire Filmarray PN組和普通培養(yǎng)組結果一致性評價

3 討論

本研究中，21例危重癥COVID-19患者共送檢下呼吸道標本54份，包括Biofire Filmarray PN組檢測33份(61.1%)、普通培養(yǎng)組21份(38.9%)，其中19對(38份)為“背靠背”送檢。兩種方法均有較多陽性結果回報。19對“背靠背”送檢標本中，Biofire Filmarray PN組和普通培養(yǎng)組結果的一致率為78.9%(15/19)。

既往研究顯示，流感所致危重癥患者可繼發(fā)其他病原體感染，繼發(fā)感染亦是ICU流感患者死亡的重要原因[7-8]。COVID-19疫情暴發(fā)以來，轉入ICU的患者中，13.5%～44%存在明確的繼發(fā)感染[9]。其最常見的感染類型是細菌和真菌性肺炎，分離出的病原體包括泛耐藥鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯桿菌、產超廣譜β內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBL)的銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、粘質沙雷氏菌以及煙曲霉、黃曲霉、白色念珠菌和光滑念珠菌等真菌性病原體[10]。由于普通培養(yǎng)靈敏度低、耗時長，不能滿足臨床的需求。

Biofire Filmarray PN是一種基于分子技術的病原診斷新技術，該試劑盒已獲得美國FDA批準用于輔助診斷下呼吸道感染，具有耗時短、檢測速度快的優(yōu)勢。Gadsby等[11]研究表明，病原學診斷的快慢可影響下呼吸道感染患者的治療決策，特別是在危重癥患者中，早期病原學診斷可能有助于改善患者的預后。本研究首次在中國危重癥COVID-19患者的病原學檢測中使用Biofire Filmarray PN。結果顯示，Biofire Filmarray PN組結果回報時間約為1 h，而普通培養(yǎng)組結果回報時間則約為3 d，提示Biofire Filmarray PN在檢測時效性方面具有絕對優(yōu)勢。

本研究Biofire Filmarray PN組送檢的21例患者中，20例(95.3%)回報陽性，普通培養(yǎng)組14例患者中，11例(78.6%)回報陽性，提示危重癥COVID-19患者合并繼發(fā)感染較常見。在檢出病原體類別方面，Biofire Filmarray PN和普通培養(yǎng)均證實鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌是轉入ICU的危重癥COVID-19患者最常合并的下呼吸道病原體；此外，Biofire Filmarray PN亦檢出了較高比率的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌，這與既往文獻[10]報道相符。在檢出耐藥基因方面，主要為ESBL相關的耐藥基因(CTX-M)以及耐碳青霉烯腸桿菌相關耐藥基因(KPC和NDM)，提示耐藥菌株的存在是ICU值得持續(xù)關注的問題。

在Biofire Filmarray PN與普通培養(yǎng)結果一致性方面，Buchan等[6]比較了259例成年患者的肺泡灌洗液標本培養(yǎng)結果，Biofire Filmarray PN與普通培養(yǎng)法針對15種靶標病原體回報結果的陽性一致率(positive percent agreement)為96.2%，陰性一致率(negative percent agreement)為98.1%。進一步研究發(fā)現(xiàn)70.7%的患者有基于Biofire Filmarray PN檢測結果調整抗生素的潛力，48.2%的患者可據(jù)此停用或降級抗生素，抗生素使用日平均可減少6.2 d。另一項研究評價了51例轉入ICU患者的59份呼吸道吸取物或肺泡灌洗液標本回報結果，Biofire Filmarray PN檢出的最常見細菌性病原體為鮑曼不動桿菌(10.2%)、肺炎克雷伯菌(16.9%)、銅綠假單胞菌(11.9%)，另有27.1%標本檢出了病毒；與普通培養(yǎng)結果的陽性一致率為90%，陰性一致率為97.4%[12]。本研究結果顯示，Biofire Filmarray PN和普通培養(yǎng)結果的一致率為78.9%。不一致的4對標本中，3例普通培養(yǎng)為陰性，Biofire Filmarray PN檢測為陽性，另1例普通培養(yǎng)為嗜麥芽窄食單胞菌，該菌不在Biofire Filmarray PN的靶標內。另Biofire Filmarray PN檢出大腸桿菌、陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌及呼吸道合胞病毒各1例。本研究結果提示Biofire Filmarray PN可能是檢測危重癥COVID-19患者繼發(fā)感染病原體的理想方法。Biofire Filmarray PN和普通培養(yǎng)結果的一致率低于既往報道的結果，可能與樣本量較小，普通培養(yǎng)靈敏度低等有關。

由于定性檢測的限制，Biofire Filmarray PN無法明確KPC等耐藥基因，而普通培養(yǎng)則可用抗生素敏感實驗來評價耐藥菌的存在。由于方法不同，目前二者無法進行直接比較。本研究分離到的病原體多數(shù)為多重耐藥菌，即使未分離到耐藥菌或相應耐藥表型，若Biofire Filmarray PN提示耐藥基因存在，仍需警惕抗生素對耐藥菌的被動篩選，最終導致耐碳青霉烯類腸桿菌等耐藥病原體的感染。因此，Biofire Filmarray PN的耐藥基因檢測一方面可起到警示作用，提醒臨床醫(yī)生盡可能避免或減少不必要的廣譜抗生素使用；另一方面，耐藥基因的存在與耐藥菌株高度相關，耐藥菌株的流行可能導致院內感染高發(fā)，對耐藥基因的快速檢測有助于監(jiān)測院內感染，加快和促進院感防控措施的實施。

本研究局限性：第一，樣本量較小，采用兩種方法“背靠背”檢測的標本僅19對，一方面無法進行針對特定病原體的比較，另一方面在一致性評價時，僅可粗略對比Biofire Filmarray PN組最高拷貝數(shù)的病原體與普通培養(yǎng)組的結果。第二，Biofire Filmarray PN靶標僅覆蓋臨床常見的下呼吸道病原體，不含真菌性病原體，可能導致檢測結果無法全面反映危重癥患者繼發(fā)感染的病原體類型。第三，僅針對病原體回報情況進行比較，未評估檢測結果對抗生素藥物方案調整及患者預后的影響。COVID-19疫情期間廣譜抗生素的廣泛使用和CT等影像學評估手段的缺乏使得病原學檢測結果的解讀和使用存在明顯限制。有待后續(xù)開展更多診斷學研究，進一步證實Biofire Filmarray PN檢測的準確性、有效性，并評價其在患者臨床結局改善中的作用。

綜上，危重癥COVID-19患者繼發(fā)感染較常見，病原體可能以鮑曼不動桿菌復合體、銅綠假單胞菌多見。Biofire Filmarray PN可用于此類患者的下呼吸道病原學診斷，有助于臨床策略的選擇，但其靈敏度和準確度仍需大樣本研究進一步驗證。

作者貢獻：范俊平、肖盟負責撰寫并修改論文；徐英春、王京嵐負責研究設計，修改論文；陳雨、張棟負責Biofire Filmarray PN的檢測和數(shù)據(jù)整理；趙靜、楊燕麗、孫雪峰、夏鵬參與標本采集、送檢和臨床信息整理；趙穎、柯帆航參與倫理申請和部分文稿撰寫。

志謝：感謝生物梅里埃公司的無私捐贈，感謝王皓峰先生等對本研究的支持和貢獻。

利益沖突：無