沈珊珊 趙志紅 吳 琴 李 瑞 余家勝 楊佳雯

(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，杭州 310018)

天然維生素K是一類具有2-甲基-1，4-萘醌母體結(jié)構(gòu)的脂溶性維生素，參與人體骨代謝和細(xì)胞生長，具有促進(jìn)凝血、抗骨質(zhì)疏松等重要生理功能[1-3]。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，天然維生素K分為維生素K1(vitamin K1, VK1)和維生素K2(vitamin K2, VK2)兩類[4]。其中VK2又稱甲萘醌，是唯一具有生物活性的維生素K，VK1須在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為VK2才能被人體吸收利用。VK2為系列化合物，根據(jù)母環(huán)C-3位上取代基異戊二烯單位個(gè)數(shù)不同分為14種，以MK-n表示，n即為異戊二烯單元數(shù)量(如圖1所示)。其中以七烯甲萘醌(menatetrenone7, MK-7)的生物活性和生物利用度最優(yōu)[5,6]。近年來相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，VK2具有不同于VK1重要的生物活性和藥用價(jià)值[7]，如防止并逆轉(zhuǎn)心血管鈣化，預(yù)防肝硬化，預(yù)防老年癡呆，降低II型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，預(yù)防靜脈曲張，促進(jìn)人體皮膚健康， 治療原發(fā)性痛經(jīng)等[8,9]。

維生素K2主要由微生物代謝產(chǎn)生，在天然食物中含量較少。隨著其藥用價(jià)值的逐步凸顯，VK2已然成為國際上保健品添加劑的新一代寵兒。1995年，日本首次將VK2作為治療骨質(zhì)疏松藥物應(yīng)用于臨床治療[10]。2008年11月14日是VK2發(fā)展的一個(gè)里程碑。歐洲食品安全局(EFSA)公布了有關(guān)從納豆提取的VK2(MK-7)作為膳食補(bǔ)充劑和食品添加劑的科學(xué)意見[11]。2009年，歐盟通過了2009/345/EC決議，批準(zhǔn)VK2可作為新型食品配料投放市場[12]。美國藥典委員會(huì)發(fā)布的《2015年膳食補(bǔ)充劑剛要》也發(fā)表支持VK2開發(fā)的準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)和準(zhǔn)入評價(jià)結(jié)論[13]。2016年，我國衛(wèi)計(jì)委發(fā)布的《關(guān)于海藻酸鈣等食品添加劑新品種的公告(2016年第8號)》將VK2(MK-7)列入了食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑新品種[14]。VK2作為功能因子的保健產(chǎn)品相關(guān)研發(fā)和生產(chǎn)正蓬勃發(fā)展，方興未艾。

國家衛(wèi)生計(jì)生委《關(guān)于海藻酸鈣等食品添加劑新品種的公告(2016年第8號)》附件3中，有針對調(diào)制乳粉中食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑的VK2(MK-7)的檢測方法。該方法采用異丙醇直接萃取、高效液相色譜定性-定量。操作簡單，檢測快速，但只適用于營養(yǎng)強(qiáng)化劑等基質(zhì)簡單的樣品。另外，保健食品中VK2的檢測方法文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要包括液相色譜-紫外檢測法[15]、液相色譜-熒光檢測法[16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[17]等，所采用的前處理方法與衛(wèi)健委2016年第8號公告中方法基本一致，采用異丙醇等良溶劑直接萃取法。市場上各類保健食品品類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，尤其是脂質(zhì)本底高的樣品，直接萃取法往往萃取不完全且雜質(zhì)干擾嚴(yán)重。另一方面，保健食品中維生素K2添加量一般較高，紫外或二極管陣列檢測器即可滿足靈敏度要求。

現(xiàn)行的國際標(biāo)準(zhǔn)中，VK1的檢測方法已較為詳盡，例如EN 14148-2003[18]、AOAC Official Method 999.15[19]等，但VK2的相關(guān)方法仍是空白，亟待開發(fā)。本實(shí)驗(yàn)針對油基類保健食品，采用酶解法-萃取法去除基底中大量的脂肪。采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器對樣品進(jìn)行分析檢測，減少了有機(jī)試劑的使用，更為環(huán)境友好，并利用保留時(shí)間和光譜圖定性，提升檢測的準(zhǔn)確性。本方法高效、準(zhǔn)確、快速、靈敏，為保健食品中VK2的檢測、質(zhì)控和監(jiān)管提供了技術(shù)支撐，維生素K2化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 維生素K2化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

某品牌維生素K2保健食品(軟膠囊、顆粒劑)，市售；維生素K2(MK-7)標(biāo)準(zhǔn)溶液 ，100 mg/L，美國Sigma-Aldrich公司 ，CAS：2124-57-4；脂肪酶(酶活力≥30 U/mg)，美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇，分析純；碳酸鉀，分析純；正己烷，分析純；氫氧化鉀，分析純；磷酸二氫鉀，分析純；異丙醇、甲醇，色譜純。

Acquity UPLCTM液相色譜儀 ，配二極管陣列(PDA)檢測器 ，美國Waters公司；XS205DU電子分析天平，Mettler Toledo國際有限公司；多管渦旋振蕩器 ，杭州奧盛儀器有限公司；pH計(jì) ， Mettler Toledo國際有限公司；離心機(jī)，Eppendorf國際貿(mào)易有限公司；恒溫水浴振蕩器，北京五洲東方公司；氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；Waters BEH-C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，美國Waters公司。

1.2 方法

色譜柱：Waters BEH-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；柱溫：35℃；流動(dòng)相：甲醇，等度洗脫；流速：0.3 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：2.5 μL。

1.3 溶液配制

1.3.1試劑配制

40% 氫氧化鉀溶液：稱取 20g 氫氧化鉀于100 mL 燒杯中，用20 mL水溶解，冷卻后，加水至50 mL，儲(chǔ)存于聚乙烯瓶中。

磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)：溶解54.0g磷酸二氫鉀于300 mL水中，用40%氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，加水至500 mL。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

分別準(zhǔn)確吸取維生素K2(MK-7)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.100 mL、0.200 mL、0.500 mL、1.00 mL、2.00mL于10 mL棕色容量瓶中，加異丙醇定容至刻度，維生素K2標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液濃度分別為1.00 mg/L、2.00 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L。

1.3.3樣品溶液

取10粒膠囊內(nèi)容物，盡量擠盡，混勻后直接取樣。樣品避光保存，制樣后盡快測定。準(zhǔn)確稱取混勻的試樣1 g(精確到0.001 g)于50 mL離心管中，加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.5) 5 mL,混勻，加入0.3 g脂肪酶，加蓋，渦旋 2 min～3 min，混勻后,置于35±2 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩2 h以上，使其充分酶解。取出酶解好的試樣，分別加入10 mL乙醇及1 g碳酸鉀，混勻后加入10 mL正己烷和10 mL水，渦旋提取10 min，6000 r/min離心5 min，靜置分層，轉(zhuǎn)移上清液至100 mL旋蒸瓶中，向下層液再加入10 mL正己烷。重復(fù)操作1次，合并上清液。將上述正己烷提取液N2吹或旋蒸至干，用異丙醇轉(zhuǎn)移并定容至10 mL，搖勻，0.2 μm濾膜過濾，即得樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 維生素K2穩(wěn)定性分析

本實(shí)驗(yàn)對光照、溫度、pH等因素對VK2穩(wěn)定性的影響進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究，以為建立其科學(xué)、準(zhǔn)確的分析方法提供科學(xué)依據(jù)。

2.1.1溫度

將VK2標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于室溫、60℃條件下放置0、5、10、30、60、120、240min后進(jìn)行液相色譜檢測，以各時(shí)間與0min時(shí)VK2峰面積比(Ai/A0)為縱坐標(biāo)，以放置時(shí)間(min)為橫坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在室溫下(圖2(A))，VK2相對峰面積基本保持一致，說明室溫條件下VK2穩(wěn)定。在60℃條件下(圖2(B))，VK2相對峰面積略有升高，推測是因?yàn)樵谠摐囟认?，溶液溶劑揮發(fā)導(dǎo)致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，適當(dāng)?shù)母邷夭挥绊慥K2的穩(wěn)定性。

圖2 不同溫度條件下維生素K2的穩(wěn)定性(A).室溫；(B)60 ℃

2.1.2光照

將VK2標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于普通燈光、陽光照射條件下放置0、5、10、30、60、120、240min后進(jìn)行液相色譜檢測，以各時(shí)間與0min時(shí)維生素K2峰面積比(Ai/A0)為縱坐標(biāo)，以放置時(shí)間(min)為橫坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在普通燈光下(圖3(A))，VK2相對峰面積基本保持一致，說明普通燈光光源對VK2穩(wěn)定性無影響。而在陽光直射下(圖3(B))，VK2急劇降低，約5min時(shí)即下降至原含量的50%，60min后幾乎完全降解。類似地，當(dāng)將VK2至于紫外光輻射下也得到了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說明，VK2對陽光和紫外光極為敏感。

圖3 不同光照射下維生素K2的穩(wěn)定性(A).普通燈光；(B).日光

2.1.3pH

將VK2標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于0.1M HCl (pH 1)、pH 7.5PBS緩沖液、0.1M NaOH (pH 13)的下放置0、10、30、60、120、240min后進(jìn)行液相色譜檢測，以各時(shí)間與0min時(shí)VK2峰面積比(Ai/A0)為縱坐標(biāo)，以放置時(shí)間(min)為橫坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)，在酸性和弱堿性(pH 7.5)條件下，VK2相對峰面積基本保持一致，說明酸、弱堿對VK2穩(wěn)定性無明顯影響。而在強(qiáng)堿性條件下，VK2隨時(shí)間有所降解。上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說明，VK2在強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定。

圖4 在不同pH條件下維生素K2的穩(wěn)定性

以上穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，強(qiáng)堿性條件、紫外輻射會(huì)導(dǎo)致VK2明顯降解，而酸性條件、溫度并未對VK2的穩(wěn)定性造成顯著影響。鑒此，在試樣預(yù)處理過程中，須避免陽光直射、強(qiáng)堿試劑的使用。

2.2 酶解條件優(yōu)化

VK2是脂溶性維生素，共存的脂質(zhì)對其提取、檢測均會(huì)造成不良影響。因VK2在強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定，無法采用皂化方法去除脂肪基質(zhì)。本文采用脂肪酶酶解的方法降解基底中脂肪。由文獻(xiàn)[20]可知米根霉產(chǎn)脂肪酶最適pH為7.5，最適溫度為35℃，前期穩(wěn)定性研究表明，在該pH和溫度范圍內(nèi)VK2穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)選用pH 7.5和35℃為酶解條件。

酶的用量及酶解時(shí)間對VK2的提取有一定影響。本實(shí)驗(yàn)以油基類軟膠囊保健品為研究模型，采用空白基質(zhì)加標(biāo)方法，考察了不同酶用量(0.1 g、0.3 g、0.6 g)和酶解時(shí)間(10 min、30 min、60min、120 min、240 min)下樣品的分析結(jié)果(見表1)。結(jié)果表明，在相同酶解時(shí)間下(120 min)，樣品在酶用量為0.3 g時(shí)可酶解完全。考慮經(jīng)濟(jì)效益，本文選取0.3 g酶用量。在相同酶用量條件下(酶用量0.3 g)，酶解時(shí)間小于60 min結(jié)果偏低，分析是酶解不完全所致。酶解120 min、240 min，VK2回收率趨于穩(wěn)定，考慮效率問題，本實(shí)驗(yàn)選取酶解時(shí)間為120 min。

表1 酶解條件的優(yōu)化

2.3 液相色譜條件

參考國家衛(wèi)生計(jì)生委2016年第8號公告中關(guān)于VK2液相色譜檢測方法并作了些許改動(dòng)： C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7μm)；柱溫：35℃；流動(dòng)相：甲醇，等度洗脫；流速：0.3 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：2.5 μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限

取1.3.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2方法上機(jī)測定，記錄峰面積。以維生素K2質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)(x)，峰面積作為縱坐標(biāo)(y)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。本法在1.00 mg/L、2.00 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=8.28×103x-1.37×103，R2=0.9999。以處理后的空白基質(zhì)溶液逐步稀釋標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)測定，檢出限和定量限分別以3倍和10倍信噪比(峰高)計(jì)。結(jié)果表明，當(dāng)取樣量為1 g，定容至10 mL時(shí)，方法檢出限為1 μg/g，定量限為3μg/g。

2.5 方法重復(fù)性

選擇油基類保健品VK2軟膠囊作為典型性樣本，按1.3.3方法平行制備7份樣品溶液，按1.2方法上機(jī)測定，記錄峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算維生素K2含量及重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，7次平行實(shí)驗(yàn)RSD為1.2%，表明該法具有良好重復(fù)性。

表2 方法重復(fù)性

2.6 方法準(zhǔn)確性

選擇油基類空白基質(zhì)樣本作為研究模型，選取標(biāo)準(zhǔn)曲線低、中、高3水平添加維生素K2標(biāo)準(zhǔn)溶液，每水平3次平行，按1.3.3方法制備樣品溶液，按1.2方法上機(jī)測定，記錄峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算維生素K2含量及加標(biāo)回收率，以加標(biāo)回收率來考察本法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表3。從表可得，利用此方法測定的加標(biāo)樣品數(shù)據(jù)結(jié)果均落在加標(biāo)值附近，回收率范圍98.7～102.2%，RSD為0.6～1.4%，準(zhǔn)確性較好。

表3 方法準(zhǔn)確性

2.7 試樣溶液穩(wěn)定性

取2.5方法重復(fù)性上機(jī)試液，于4℃避光保存24 h，按1.2方法上機(jī)測定，記錄峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算24 h前后維生素K2含量，以考察試樣溶液中VK2的穩(wěn)定性(見表4)。由表可知，3次平行實(shí)驗(yàn)VK224 h前后含量的RE值均小于2.6%，說明在試驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)VK2穩(wěn)定性良好。

表4 樣品上機(jī)液穩(wěn)定性

2.8 方法比較

以軟膠囊為分析對象，將本方法與衛(wèi)計(jì)委《關(guān)于海藻酸鈣等食品添加劑新品種的公告(2016年第8號)》附件3中維生素K2的檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5所示。圖5(A)為10 mg/LVK2標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖和PDA光譜圖，圖5(B)和圖5(C)分別為采用公告方法和本法的液相色譜結(jié)果和PDA光譜圖。通過比較可明顯觀察到，公告法采用異丙醇直接萃取VK2，提取不完全且脂質(zhì)類基質(zhì)干擾嚴(yán)重，導(dǎo)致PDA光譜圖畸變(圖5(B-2))，色譜圖基線高且漂移(圖5(B-1))，無法準(zhǔn)確定量。而本法通過酶解去除了大量脂肪，PDA光譜圖(圖5(C-2))與標(biāo)準(zhǔn)溶液(圖5(A-2))匹配性好，液相色譜圖基線平穩(wěn)(圖5(C-1))，定量準(zhǔn)確性大大優(yōu)于前者。

圖5 維生素K2標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖及相應(yīng)光譜圖(A).衛(wèi)計(jì)委2016年第8號公告方法；(B).本法；(C).分析結(jié)果

2.9 方法應(yīng)用

將本方法應(yīng)用于另一款增加骨密度保健食品(顆粒劑)中VK2的檢測。該保健食品中除VD3、VK2、硫酸軟骨素等功效成分外，還添加了大量的可可粉、全脂乳粉等原料進(jìn)行調(diào)味，脂質(zhì)類基質(zhì)含量高，常規(guī)異丙醇直接萃取方法無法有效分離分析其中VK2含量。采用本方法分析結(jié)果如表5所示。方法RSD為2.3%，回收率介于93.2%～95.6%，結(jié)果滿意。

表5 方法應(yīng)用

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜-二極管陣列檢測法檢測油基類保健品中維生素K2的分析方法，并對維生素K2的穩(wěn)定性及酶解條件進(jìn)行了研究。該方法線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。當(dāng)取樣量為1 g，定容至10 mL時(shí)，方法檢出限、定量限分別為1 μg/g、3 μg/g。7次平行實(shí)驗(yàn)RSD=1.2%。低、中、高3水平加標(biāo)回收率介于98.7～102.2%，準(zhǔn)確度良好。采用該方法可以準(zhǔn)確、快速檢測油狀液體、固體類保健食品中維生素K2的含量。