馮 超 史煜華 張文婷*

(1.杭州康侖中藥飲片有限公司，杭州 311100；2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310052)

山楂葉提取物是薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂 Crataegus pinnatifida Bge. 的干燥葉經(jīng)加工制成的提取物[1]。其主要藥效組分為黃酮類成分，現(xiàn)代藥理研究表明該黃酮類成分具有抗心肌缺血性損傷[2]、 非酒精性脂肪性肝病肝細(xì)胞抗氧化、降壓和心臟保護(hù)[3]、抗腦缺血和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[4]、鎮(zhèn)痛和抗炎[5]等作用，臨床上用于治療冠心病、冠狀動脈供血不足，心絞痛等心腦血管疾病[6，7]。

益心酮分散片為是以山楂葉提取物為原料制成的單方制劑，是益心酮片的劑改品種，該藥具有活血化瘀、宣通血脈的功效。目前該制劑全國已有4家企業(yè)獲得批準(zhǔn)文號并生產(chǎn)，均執(zhí)行其注冊標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載內(nèi)容各不相同。本研究參照2015版《中國藥典》一部中有關(guān)山楂葉提取物、益心酮片的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立益心酮分散片中牡荊素鼠李糖苷和牡荊素葡萄糖苷含量測定方法，并對現(xiàn)有收集到的3家生產(chǎn)企業(yè)12批樣品進(jìn)行了測定了,以期為益心酮分散片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent 1260系列高效液相色譜儀(G1312B 1260四元泵，G1329B 1260自動進(jìn)樣儀，G1316A 1260柱溫箱，G4212B 1260DAD檢測器，Chemstation色譜工作站),色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×250mm)；XA-105型萬分之一微量電子天平(瑞士梅特勒)；超純水器 ：Milli-QA10型超純水處理系統(tǒng)(美國密理博)；DS-8510DTH型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器)。

牡荊素鼠李糖苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供 (批號111668-200602，供含測用)，牡荊素葡萄糖苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供 (批號111979-201501，含測用，純度：92.8%)，甲醇、乙腈和四氫呋喃為色譜純(美國 MERCK 公司)，其它試劑均為分析純，購自杭州雙林化工試劑有限公司。

1.2 方法

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×250mm)；流動相：四氫呋喃-甲醇-乙腈-乙酸-水(38∶3∶3∶4∶152)；檢測波長為360nm，柱溫30℃。

1.3 溶液配制

1.3.1對照品溶液的制備

取牡荊素葡萄糖苷對照品、牡荊素鼠李糖苷對照品適量，精密稱定，加60%乙醇制成每1mL分別含41.57μg、118.74μg的混合溶液，即得。

1.3.2供試品溶液的制備

取本品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于山楂葉提取物25mg)置25mL量瓶中，加60%乙醇適量振搖使山楂葉提取物溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3空白溶液的制備

分別取不同廠家的輔料，按1.3.2項(xiàng)供試品制備方法制備陰性對照溶液。

1.3.4線性關(guān)系考察

精密吸取對照品混合溶液(牡荊素葡萄糖苷41.57μg/mL，牡荊素鼠李糖苷118.74μg/mL )1、2、5、10、12、15μL注入液相色譜儀。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件確定

由于山楂葉提取物中主要含有牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷等黃酮苷類成分，其中以牡荊素葡萄糖苷和牡荊素鼠李糖苷所占比例較高[8,9]。因此選取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷來作為指標(biāo)性成分。在不同品牌色譜柱和柱溫比較中發(fā)現(xiàn)柱溫過高使牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷的出峰時(shí)間提前，分離度降低，綜合柱效和分析時(shí)間考慮，其柱溫應(yīng)控制在20～30℃。

取制備好的混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液，分別注入液相色譜儀，結(jié)果顯示在此色譜條件下能達(dá)到很好分離結(jié)果，輔料無干擾，見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取線性考察結(jié)果所記錄峰面積，以色譜峰面積(Y)對進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，計(jì)算回歸方程，牡荊素葡萄糖苷的線性方程為Y=1.9256X+12.261，r2=0.9997，牡荊素鼠李糖苷的線性方程為Y=1.8881X+10.907，r2=0.9999說明牡荊素葡萄糖苷在進(jìn)樣量41.57～623.55ng范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，牡荊素鼠李糖苷在進(jìn)樣量118.74～1781.1ng范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度

精密吸取對照品混合溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果牡荊素葡萄糖苷峰面積的RSD為1.0%，牡荊素鼠李糖苷峰面積的RSD為0.7%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

圖1 益心酮分散片HPLC色譜圖A.混合對照品溶液;B.益心酮片;C.輔料，1.牡荊素葡萄糖苷;2.牡荊素鼠李糖苷橫坐標(biāo)為保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為色譜峰響應(yīng)(mAU)

2.4 重復(fù)性

取同一批供試品(廠家2，批號：160204)6份，按供試品溶液制備方法制備，測定并計(jì)算含量，結(jié)果牡荊素葡萄糖苷平均含量為5.52 mg/g，RSD為2.0%，牡荊素鼠李糖苷平均含量為21.52 mg/g，RSD為2.0%，

2.5 加標(biāo)回收率

精密稱取供試品(廠家2，批號：161204)6份，分別精密加入對照品溶液適量，按正文供試品制備法制備，并依法測定，結(jié)果見表1，牡荊素葡萄糖苷平均回收率為98.22%，RSD為0.83%，牡荊素鼠李糖苷平均回收率為100.81%，RSD為0.86%。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性

精密吸取同一份供試品溶液和對照品溶液，在16小時(shí)內(nèi)，每間隔一定時(shí)間進(jìn)樣一次，結(jié)果牡荊素葡萄糖苷峰面積對照品溶液RSD為1.50%，供試品溶液為1.7%；牡荊素鼠李糖苷峰面積對照品溶液RSD為1.28%，供試品溶液為1.65%。表明供試品溶液和對照品溶液在16小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 樣品測定

對收集到的4家生產(chǎn)企業(yè)共12批益心分散片按擬定的方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 益心酮片樣品測定結(jié)果(mg/片，n=2)

續(xù)表2

3 結(jié)論

本研究建立了益心酮分散片中牡荊素葡萄糖苷和牡荊素鼠李糖苷含量測定方法，進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，并對收集到的在產(chǎn)的4家生產(chǎn)企業(yè)共12個(gè)批次的樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示該方法重現(xiàn)性好，且四家企業(yè)的輔料皆無干擾，可用于益心酮分散片的質(zhì)量控制，根據(jù)2015版《中國藥典》中益心酮片含量限量，所測12批樣品皆符合規(guī)定，但不同廠家產(chǎn)品含量差異較大,可能是由于不同企業(yè)所使用不同批次原料藥或制劑工藝差異所致，因此，加強(qiáng)中藥的質(zhì)量控制具有重要意義。