吳中豪 龔子珊 姜小梅 許舒欣 韓文念 李 艷 汪 曣*

(1.天津大學(xué)，精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300399；2.中科院蘇州醫(yī)工所天津工程技術(shù)研究院，天津300399)

1 引言

免疫抑制劑是一類可抑制機體異常免疫反應(yīng)的藥物，其在防治移植排斥、治療超敏反應(yīng)引起的疾病和自身免疫性疾病中占據(jù)著十分重要的地位，臨床常用的免疫抑制類藥物有環(huán)孢菌素A、西羅莫司、他克莫司、依維莫司、霉酚酸酯、糖皮質(zhì)激素等[1]。這類藥物的血藥濃度與免疫抑制程度和肝腎毒性密切相關(guān)，它們大多表現(xiàn)出較高的藥代動力學(xué)變異性，具有相對狹窄的治療窗口和暴露-反應(yīng)關(guān)系[2-4]。因此在臨床應(yīng)用時必須及時地監(jiān)測其血藥濃度，在保證治療效果的同時應(yīng)最大限度地減少排異反應(yīng)及毒副作用[5]。目前該類藥物的檢測方法以LC-MS/MS法和免疫法(FPIA)為主，但是免疫分析法多以抗原抗體特異性結(jié)合為原理進行標(biāo)記和篩選，在方法選擇性和特異性方面會有很大區(qū)別，有時還會發(fā)生嚴(yán)重的交叉反應(yīng)[6]，而LC-MS/MS法由于其精密度、準(zhǔn)確度及靈敏度方面的巨大優(yōu)勢，是目前藥物檢測的金方法。

在器官移植術(shù)后的藥物治療中，多次采集全血增加了患者的生理負(fù)擔(dān)，也增加了門診患者的單次門診留院時間，而干血斑(Dried blood spots，DBS)采樣技術(shù)具有微創(chuàng)、成本低、樣本易于保存和運輸?shù)葍?yōu)勢，非常適用于臨床血藥濃度檢測[7]。目前多數(shù)DBS方法僅用于一種或兩種免疫抑制劑的檢測，這限制了DBS方法在高通量檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力。迄今為止，只有兩份報告記錄了LC-MS/MS方法在同時分析干血斑中4種免疫抑制劑方面的應(yīng)用[8,9]。前者討論了紅細(xì)胞壓積和免疫抑制劑濃度對回收率的影響，并進行了詳細(xì)的方法學(xué)驗證，但與其它3種藥物的回收率相比(85.7%～98.8%)，所建方法使得環(huán)孢菌素A的提取受血藥濃度和紅細(xì)胞壓積影響較大，導(dǎo)致其在低濃度水平下的回收率異常高(121.3%)[8]。后者建立了穩(wěn)定可行的免疫抑制劑檢測方法，但4種藥物的回收率較低(59.1%～80.0%)，具有更高提取回收率的新方法有待進一步探索[9]。

本實驗建立了一種同時定量檢測DBS中環(huán)孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司的高通量LC-MS/MS方法，并根據(jù)美國FDA發(fā)布的《生物分析方法驗證指南》[10]對方法的線性范圍、定量限、提取回收率、精密度與準(zhǔn)確度、殘留效應(yīng)和穩(wěn)定性進行考察，根據(jù)歐洲EMA發(fā)布的《生物分析方法驗證指南》[11]對基質(zhì)效應(yīng)進行考察，以確保方法的可靠性，旨在為臨床免疫抑制劑的血藥濃度監(jiān)測提供良好的參考方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API 4000型三重四極桿質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司；島津LC-20A液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司；5427R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；CE-7200A型超聲波清洗機，東莞潔康超聲波清洗機設(shè)備有限公司；VSD150-1A型氮吹儀，無錫沃信儀器制造有限公司；Milli-Q Advantage A10純水儀，德國Merck Millipore公司。

環(huán)孢菌素A、西羅莫司、他克莫司、依維莫司、子囊霉素(環(huán)孢菌素A與他克莫司的內(nèi)標(biāo))、西羅莫司-d3(西羅莫司氘代內(nèi)標(biāo))和依維莫司-d4(依維莫司氘代內(nèi)標(biāo))均購自加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，美國Fisher Scientific公司；鹽酸(分析純)，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；乙酸銨、七水硫酸鋅，美國Sigma-Aldrich公司；空白全血樣本(EDTA抗凝不含待測藥物的全血)來自健康志愿者；質(zhì)控樣本為實驗室自制樣本；干血濾紙片為Whatman 903號濾紙(批號：10538018)，英國Whatman公司；實驗用水為超純水。

1.2 儲備液和工作液的制備

分別用甲醇溶解環(huán)孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司標(biāo)準(zhǔn)品，制備成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液(-20℃保存)；分別精密吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，混合后用甲醇依次稀釋，制備成含環(huán)孢菌素A濃度分別為400、800、1600、2000、3200、6400、16000、20000ng/mL，含西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度分別為40、80、160、200、320、640、1600、2000ng/mL的4藥混合系列標(biāo)準(zhǔn)品工作液，于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

分別用甲醇溶解子囊霉素、西羅莫司-d3和依維莫司-d4內(nèi)標(biāo)物，制備成100μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液(-20℃保存)；分別精密吸取一定量的內(nèi)標(biāo)儲備液，混合后用甲醇稀釋，制備成含西羅莫司-d3濃度為350ng/mL，子囊霉素、依維莫司-d4濃度為100ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作液，于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品的制備

精密吸取10μL標(biāo)準(zhǔn)品工作液分別添加到190μL空白全血中，渦旋混勻1min，室溫放置30min后，制得含環(huán)孢菌素A濃度分別為20、40、80、100、160、320、800、1000ng/mL，含西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度分別為2.0、4.0、8.0、10、16、32、80、100ng/mL的“全血標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品”，室溫下放置，當(dāng)天使用；同時制備定量下限、低、中、高4個濃度水平的“全血質(zhì)控樣品”，其中環(huán)孢菌素A樣本濃度分別為20、40、320、800ng/mL，西羅莫司、他克莫司和依維莫司樣本濃度分別為2.0、4.0、32、80ng/mL，于4℃冰箱內(nèi)保存。

精密吸取30μL全血樣品(全血標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、全血質(zhì)控樣品)垂直滴于Whatman 903濾紙的采樣環(huán)中心，將濾紙轉(zhuǎn)移至試管架上，室溫過夜晾干后制得“DBS標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品”和“DBS質(zhì)控樣品”。其中，DBS標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品中環(huán)孢菌素A濃度分別為20、40、80、100、160、320、800、1000ng/mL，西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度分別為2.0、4.0、8.0、10、16、32、80、100ng/mL。定量下限、低、中、高濃度的DBS質(zhì)控樣品中環(huán)孢菌素A濃度分別為20、40、320、800ng/mL，西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度分別為2.0、4.0、32、80ng/mL。備用樣品干燥后裝入密封袋中，于-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.4 樣品前處理

于DBS中心位置打孔取樣直徑8mm的圓形血斑，置于微量離心管中，加入290μL甲醇-乙腈(80∶20，v/v)提取液、10μL混合內(nèi)標(biāo)工作液和20μL鹽酸溶液(0.05mol/L)。渦旋混勻后密封，50℃水浴下超聲提取并孵化30min[12]，隨后在預(yù)置好的4℃高速冷凍離心機內(nèi)14000g/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至自動進樣器微量試管中，室溫下氮氣吹干，底物用80μL甲醇溶液渦旋復(fù)溶3min，離心5min(14000g/min)，取上清液10μL進樣檢測。具體流程如圖1所示。

圖1 DBS樣品前處理方法流程圖

1.5 實驗方法

1.5.1色譜條件

Shim-pack GIST-HP型C18色譜柱(100mm × 2.1mm，3μm)，柱溫60℃，流速0.9mL/min，進樣量10μL，分析時間4.5min；流動相A為含有2mM乙酸銨和0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含有2mM乙酸銨和0.1%甲酸的甲醇溶液；梯度洗脫：0～0.4min，40%B；0.4～2.2min，40%～100%B；2.2～3.0min，100%B；3.0～3.5min，100%～40%B；3.5～4.5min，40%B。

1.5.2質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子電離(ESI+)和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行檢測，電噴霧電壓為4500V，離子源溫度為300℃，氣簾氣、霧化氣、輔助加熱氣壓力分別為25psi、70psi、55psi；去簇電壓為43～60V，碰撞室入口電壓為11V，碰撞能為23～29eV，碰撞室出口電壓為10～26V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實驗考察了甲醇-水、乙腈-水作為流動相時的影響，實驗發(fā)現(xiàn)，對于同等濃度的分析物，甲醇-水作為流動相時得到的色譜圖分離效果較好，其信號響應(yīng)值和穩(wěn)定性也較高。同時，在流動相中加入2mM的乙酸銨改善了分析物的峰形，加入0.1%甲酸提高了4種化合物的質(zhì)譜響應(yīng)值，降低了定量限。在此條件下，4種免疫抑制劑藥物在4.5min內(nèi)便可有效分離(如圖2所示)。根據(jù)4種免疫抑制劑的親脂特性，選取C18柱，考察了流速、柱溫對分離效果和信號強度的影響，最終采用“1.5.1”的洗脫梯度，0.9mL/min的流速，以及60℃的柱溫分析條件。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在MRM模式下，采用手動優(yōu)化方法，依次對去簇電壓、碰撞室入口電壓、碰撞能量、碰撞室出口電壓、分析物及其內(nèi)標(biāo)的母離子和子離子等條件進行優(yōu)化，最終確定的質(zhì)譜分析條件如表1所示。

表1 4種免疫抑制劑及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜分析條件

2.3 定量下限和標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用已建立的LC-MS/MS分析方法測定3個濃度值接近檢出限的DBS樣品，每濃度進行6個樣本分析，連續(xù)測定3個批次，通過分析各濃度樣本測定結(jié)果的總變異系數(shù)(CV)和與理論值的偏差來確定方法的定量下限。根據(jù)2018年FDA發(fā)布的《生物分析方法驗證指南》[10]要求，CV值應(yīng)≤ 20%，偏差應(yīng)在±15%以內(nèi)。結(jié)果顯示，環(huán)孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司的定量下限分別為20、2.0、2.0、2.0ng/mL，測定結(jié)果的偏差在-8.3%至8.6%之間，最大CV值為11.43%，方法滿足FDA的指南要求。此結(jié)果與Koster[8]等人所報道方法的定量下限(環(huán)孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司的定量下限分別為20、1.0、1.0、1.0ng/mL)相近，可完全覆蓋臨床用藥的低限濃度。4種免疫抑制劑的定量下限色譜圖及分子結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖2 4種免疫抑制劑定量下限色譜圖及分子結(jié)構(gòu)式a.環(huán)孢菌素；b.西羅莫司；c.他克莫司；d.依維莫司

用所建方法測定“DBS標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品”中4種免疫抑制劑的濃度(8個質(zhì)量濃度梯度)，每一濃度進行雙樣本分析，記錄色譜圖。以各組分與其內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，各組分的濃度值(x)為橫坐標(biāo)，用加權(quán)(w=1/X2)最小二乘法進行回歸計算。得到4種免疫抑制劑的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)及定量下限如表2所示。

表2 4種免疫抑制劑的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和定量下限

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

在對方法的提取回收率進行考察時，應(yīng)準(zhǔn)確知道打孔取樣的DBS樣品的負(fù)載血量，進而精確計算出空白對照樣中應(yīng)加入的待測物和內(nèi)標(biāo)的用量。D.H. Vu[13]等人報道了用紅細(xì)胞壓積為32%～38%的全血制備的直徑8mm的血斑含血量約20μL。因此，本實驗采用剛好可以覆蓋8mm圓形濾紙片的20μL全血[14]來進行提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的驗證。

用20μL的低、中、高3個濃度水平的“全血質(zhì)控樣品”制備DBS樣品，每濃度進行6個樣本分析，根據(jù)峰面積計算提取回收率。同時制備低、中、高3個濃度水平的純?nèi)芤簶悠?溶劑為甲醇)，每濃度進行3個樣本分析，根據(jù)2011年EMA發(fā)布的《生物分析方法驗證指南》[11]進行基質(zhì)效應(yīng)驗證，通過計算4種免疫抑制劑在不同濃度水平下的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子[11]及其CV值來評價基質(zhì)效應(yīng)。提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明：方法具有較高的提取回收率，其中環(huán)孢菌素A為70.9%～76.4%；西羅莫司為81.7%～105.3%；他克莫司為105.4%～115.8%；依維莫司為89.1%～110.6%。本方法與Koster[8]等人的研究相比，可降低環(huán)孢菌素A藥物的濾紙片色譜效應(yīng)，使其在不同濃度下的提取回收率水平相當(dāng)；方法的回收率比den Burger[9]等人的研究(環(huán)孢菌素A，59.1～65.9%；西羅莫司，65.8%～64.1%；他克莫司，78.6%～80.0%；依維莫司，64.1%～64.2%)要高，可實現(xiàn)對DBS樣本中的4種免疫抑制劑進行更高效的提取。4種免疫抑制劑在低、中、高濃度水平下的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子的CV值均<15%，基質(zhì)效應(yīng)滿足EMA指南的相關(guān)規(guī)定[11]。

表3 4種免疫抑制劑的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)驗證結(jié)果

2.5 精密度與準(zhǔn)確度

用所建方法檢測定量下限、低、中、高4個濃度水平的“DBS質(zhì)控樣品”，每濃度進行5個樣本分析，連續(xù)測定3d。以當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算DBS質(zhì)控品濃度，以質(zhì)控品測定結(jié)果來評估方法的精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果如表4所示，4種免疫抑制劑的日內(nèi)和日間精密度(CV)為1.9%～12.9%，準(zhǔn)確度為-13.9%～8.6%。方法的精確度較高，結(jié)果滿足FDA指南的相關(guān)要求[10]。

表4 4種免疫抑制劑的精密度與準(zhǔn)確度驗證結(jié)果

2.6 殘留效應(yīng)

用所建方法連續(xù)測定低濃度的“DBS質(zhì)控樣品”后，隨行交替測定高、低濃度的DBS質(zhì)控品，通過比較低濃度質(zhì)控樣品在第1次進樣和后續(xù)進樣的測定值來計算殘留效應(yīng)[15]。結(jié)果顯示，環(huán)孢菌素A、西羅莫司、他克莫司和依維莫司的殘留率分別為8.1%、-0.7%、-2.8%、-2.6%，殘留效應(yīng)均小于定量下限樣本濃度的20%。

2.7 穩(wěn)定性

選用-20℃保存3個月的儲備液與新配儲備液制備低、高(環(huán)孢菌素A濃度為40、800ng/mL，西羅莫司、他克莫司和依維莫司濃度為4.0、80ng/mL)2個質(zhì)控品濃度的儲備液樣本，每濃度進行5個樣本分析來考察儲備液穩(wěn)定性；選用低、中、高3個濃度水平的“DBS質(zhì)控樣品”，每濃度進行5個樣本分析。其中，前處理后樣品于20℃自動進樣器中放置1d后進行分析來考察自動進樣器穩(wěn)定性，其余質(zhì)控樣品裝入密封袋中，分別在不同溫度條件(25℃、4℃、-20℃)下保存不同時間(5d、14d、21d)后進行分析來考察DBS樣本穩(wěn)定性。結(jié)果如表5所示，所有質(zhì)控品濃度測定結(jié)果的準(zhǔn)確度在-14.9%～14.2%之間，CV值均<14.2%，結(jié)果滿足FDA指南的相關(guān)規(guī)定[10]。表明儲備液于-20℃下至少可以穩(wěn)定保存3個月，處理后樣品在自動進樣器內(nèi)至少可以穩(wěn)定保存1天，DBS樣品在室溫、4℃、-20℃條件下至少可以穩(wěn)定保存5天、14天和21天。

表5 4種免疫抑制劑的穩(wěn)定性驗證結(jié)果(n=5)

續(xù)表5

3 結(jié)論

本研究建立了一種高通量液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時定量檢測干血斑中環(huán)孢菌素A、西羅莫司、他克莫司、依維莫司的方法。通過對檢測條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了對免疫抑制劑的高效、精準(zhǔn)分析。樣品前處理采用了甲醇-乙腈混合溶液提取和沉淀蛋白并結(jié)合氮氣吹干和甲醇復(fù)溶的方式，使方法獲得了較高的提取回收率(73.6%～110.8%)和較低的定量限。本方法具有快速、高效、準(zhǔn)確度和精密度高、對病患友善、樣本采集、儲存和運輸方便等優(yōu)點，為臨床免疫抑制劑的血藥濃度監(jiān)測提供了良好參考方法。

值得注意的是，紅細(xì)胞壓積可通過影響血液的黏稠度進而影響滴加到采血濾紙片上的血液的擴散。因此，與高紅細(xì)胞壓積的血液相比，單位體積的低紅細(xì)胞壓積的血液獲得的干血斑會更大，這在打孔取樣時，可能會對固定面積的DBS樣品中的免疫抑制劑含量產(chǎn)生影響，進而造成分析誤差。此外，紅細(xì)胞壓積也會影響血液在濾紙片上的滲透性，可能使得藥物與濾紙片纖維之間的作用力發(fā)生變化，進而對方法的提取回收率造成影響。未來的研究可針對免疫抑制劑與濾紙片間的結(jié)合和提取機理進行深入探索，并考察和校正紅細(xì)胞壓積對本方法的影響。另外，本研究為滿足方法建立和驗證過程中需要大量樣本的要求，選擇了用移液槍吸取靜脈全血滴加于濾紙片上制成DBS樣本。日后的研究可采集真實病人樣本，包括靜脈全血、靜脈全血DBS、指尖血DBS，來進行方法考察，全面比較不同采集方式的樣本在該方法下所測得的免疫抑制劑藥物濃度差異，探討用指尖血DBS進行藥物濃度測定來代替目前常規(guī)的用靜脈全血進行藥物濃度測定的可行性，將本方法真正應(yīng)用于臨床。