張鶯臍, 張羨宇, 郭慶芳, 許文豪, 馬 崢, 石 碩, 張 倩, 劉 鷹

氟苯尼考對太平洋牡蠣()早期發(fā)育的影響

張鶯臍1, 2, 張羨宇1, 2, 郭慶芳1, 許文豪1, 馬 崢1, 石 碩1, 張 倩1, 2, 劉 鷹1, 2

(1. 大連海洋大學(xué), 海洋科技與環(huán)境學(xué)院, 遼寧 大連 116023; 2. 設(shè)施漁業(yè)教育部重點實驗室, 大連海洋大學(xué), 遼寧 大連 116023)

氟苯尼考作為氯霉素的替代物, 理化性質(zhì)穩(wěn)定, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用, 致使其在多種水體環(huán)境中大量殘留。本研究分析了氟苯尼考(0.1、1.0和10 mg/L)對牡蠣幼蟲的生長發(fā)育、運動能力、免疫抗性的影響。結(jié)果表明, 氟苯尼考暴露24 h后, 隨著暴露濃度的增加, 牡蠣幼蟲的存活量呈升高趨勢, 而幼蟲殼高和殼寬顯著降低; 氟苯尼考暴露不會引起牡蠣幼蟲移動速度的變化, 1 mg/L氟苯尼考暴露后, 牡蠣幼蟲移動距離呈顯著性增加(<0.05)。氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲存活量及水體細(xì)菌總數(shù)之間呈顯著性相關(guān), 但水體細(xì)菌總數(shù)的變化并不是造成牡蠣幼蟲發(fā)育、生長狀態(tài)不同的主要原因。牡蠣幼蟲在不同濃度氟苯尼考的暴露下,、和等生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)受到影響, 進而影響其生長發(fā)育、運動能力。另一方面, 高濃度氟苯尼考的暴露, 引起牡蠣幼蟲和基因相對表達(dá)量上調(diào), 積極地參與抵抗氟苯尼考暴露引起的應(yīng)激反應(yīng)。養(yǎng)殖水環(huán)境中抗生素殘留可能會影響水生動物早期發(fā)育階段的生長發(fā)育及免疫抗性, 需提高對養(yǎng)殖水體中抗生素殘留危害的認(rèn)識及監(jiān)測, 進一步加強養(yǎng)殖水體水質(zhì)的凈化。

氟苯尼考; 牡蠣幼蟲; 生長發(fā)育; 運動行為; 免疫抗性

隨著抗生素的大量生產(chǎn)和廣泛使用, 抗生素可通過多種途徑進入環(huán)境, 包括制藥和醫(yī)療廢水的排放、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中疫病的治療和預(yù)防用藥等[1]。因部分抗生素具有生物利用性低及不易降解的特性, 導(dǎo)致其常在多種類型的環(huán)境介質(zhì)中被檢測到[2-4]。水環(huán)境中殘留的抗生素會對水生動物產(chǎn)生較大的影響, 包括生長發(fā)育異常、繁殖功能紊亂、生理功能和氧化應(yīng)激水平變化等[5-6]。環(huán)境濃度的磺胺嘧啶暴露斑馬魚胚胎()96 h后, 會引起胚胎畸形率增多、心跳速率加快、自主運動增強等現(xiàn)象[7]。利用不同濃度(0、5、10 mg/L)的恩諾沙星浸泡眼斑雙鋸魚幼魚()發(fā)現(xiàn), >5 mg/L的恩諾沙星浸泡24 h后, 對眼斑雙鋸魚幼魚的消化酶、免疫酶活性和氧化產(chǎn)物含量產(chǎn)生顯著影響[8]。

氟苯尼考(Florfenicol, FFC)屬于聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)批準(zhǔn)可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的抗生素之一。作為動物專用的氯霉素類廣譜抗生素[9], 氟苯尼考對氣單孢菌()、鏈球菌()、弧菌()和愛德華氏菌()等病原菌引起的魚類疾病有明顯的防治效果[10-11], 其理化性質(zhì)穩(wěn)定、不易被水解和生物降解, 大量連續(xù)地向水環(huán)境中排放導(dǎo)致其在水生環(huán)境中呈“假”持久性存在, 常在多種水域生態(tài)環(huán)境中被檢出。有調(diào)查顯示, 我國江蘇省某規(guī)?；a(chǎn)養(yǎng)殖場和丹麥某漁場附近水域中氟苯尼考的殘留量分別為937.21 ng/L和8 ng/L[12-13]。在沿海水域、沉積物及生物體內(nèi)均檢測到不同濃度的氟苯尼考?xì)埩鬧15], 在大連市的大連灣養(yǎng)殖場周邊的水域檢測到氟苯尼考?xì)埩魸舛雀哌_(dá)11 mg/L[14]。對長江下游的環(huán)太湖流域的養(yǎng)殖區(qū)域進行調(diào)查發(fā)現(xiàn), 該流域內(nèi)的養(yǎng)殖生物體內(nèi)幾乎均檢測出氟苯尼考?xì)埩鬧16]。與早期的氯霉素類藥物相比, 氟苯尼考不會引起再生障礙性貧血, 但能夠可逆性地抑制紅細(xì)胞生成, 且具有胚胎毒性[17]。氟苯尼考暴露會抑制虹鱒魚()體內(nèi)吞噬作用、淋巴細(xì)胞增殖等過程[18], 對南美白對蝦()無節(jié)幼蟲有較高的毒性[19]。

太平洋牡蠣()是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一, 因其生長速度快、適應(yīng)能力強、營養(yǎng)價值高等特點, 在我國乃至全球大量培育, 具有重要的經(jīng)濟價值[20]。水生生物的早期發(fā)育階段對外源性污染物具有較高的敏感性[21-22], 被認(rèn)為是指示各種污染物毒性的前哨生物[23]。低濃度的抗生素殘留對成體生物未造成明顯毒性作用時, 卻可能會引起胚胎和幼蟲的中毒反應(yīng)[24]。

為探究養(yǎng)殖水環(huán)境中氟苯尼考?xì)埩魧λ鷦游镌缙谏A段的影響, 本研究以太平洋牡蠣受精卵為研究對象, 分析不同濃度的氟苯尼考(0.1、1.0和10 mg/L)對牡蠣幼蟲生長發(fā)育、運動能力、免疫抗性等方面的影響, 進一步探討氟苯尼考?xì)埩舻臐撛陲L(fēng)險及其使用的安全濃度范圍。本研究將為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素的科學(xué)合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 牡蠣體外人工授精

太平洋牡蠣()于2019年6月購自大連市長興海鮮市場, 低溫運輸至實驗室, 于海水中暫養(yǎng)一天, 控制水溫為(24 ± 1)℃。挑選健康性腺飽滿的牡蠣用于實驗, 使用無菌解剖針挑取牡蠣性腺進行涂片, 在光學(xué)顯微鏡(745T/SMZ1000, Nikon)下觀察, 通過鑒定生殖細(xì)胞種類確定牡蠣性別, 選擇生殖細(xì)胞活力較好的個體用于后續(xù)體外授精。

牡蠣親本通過解剖取卵、人工授精的方法進行繁殖。取5只雌性牡蠣和3只雄性牡蠣, 分別剝離牡蠣性腺, 使其通過400目的篩絹以去除多余的生殖腺組織雜質(zhì), 再使用200目篩絹分別收集卵母細(xì)胞和精子, 于24℃海水中活化20 min, 使卵母細(xì)胞形體趨于飽滿, 激活精子。將卵母細(xì)胞與精子以1︰10的比例混合受精, 保持較暗的光照條件, 不定時攪動水體, 受精15 min后, 利用光學(xué)顯微鏡觀察, 確保受精成功。

1.2 實驗設(shè)計

太平洋牡蠣受精卵胚胎毒性的測定參考Quiniou等人[25]方法。取約300個/mL受精卵于220×150× 180 mm的玻璃缸中孵化, 加入3 L相應(yīng)濃度的氟苯尼考暴露溶液。受精卵于黑暗條件下培養(yǎng)24 h, 水溫控制在(24 ± 0.5)℃, 持續(xù)微量曝氣。參考氟苯尼考在環(huán)境中檢出的濃度以及養(yǎng)殖過程中的投喂?jié)舛萚26], 設(shè)置氟苯尼考終濃度為0、0.1、1和10 mg/L, 每組設(shè)置三個重復(fù)。從牡蠣受精卵開始暴露24 h后, 收集樣品, 進行下一步分析。

利用高效液相色譜儀(HPLC, SPD-20A, 島津)測定10 mg/L氟苯尼考暴露液的實際濃度。流動相為乙腈(A)和超純水(B), 流動相比例為40︰60(v︰v), 保留時間為4.2 min。檢測暴露液中氟苯尼考實際濃度約為標(biāo)稱濃度的96.2%, 與標(biāo)稱濃度差異性較小, 因此將使用標(biāo)稱濃度進行實驗計算。

1.3 水體中細(xì)菌總數(shù)的測定

測定不同濃度的氟苯尼考暴露24 h后養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌總數(shù)[27]。取10 mL暴露組水樣, 進行等比例稀釋, 制成1︰1、1︰10、1︰100、1︰1 000的樣品勻液。吸取1 mL樣品勻液于瓊脂培養(yǎng)平板中, 涂布均勻, 每個稀釋度的樣品勻液做三個平行。在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后對菌落進行計數(shù), 選取平板菌落個數(shù)在30~300個之間的平板進行計數(shù), 并計算不同濃度處理組的菌落平均值。

1.4 牡蠣幼蟲的生長發(fā)育

氟苯尼考暴露24 h后從各實驗組隨機收集1 mL暴露溶液, 置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中于4倍光學(xué)顯微鏡(N-10E, Novel)下統(tǒng)計牡蠣幼蟲存活量。從各實驗組隨機挑選20只D型幼蟲, 加入2%的戊二醛進行固定, 在顯微鏡下觀察牡蠣幼蟲形態(tài), 并利用NIS-Elements圖像軟件統(tǒng)計幼蟲的殼高、殼寬。

1.5 牡蠣幼蟲運動行為檢測

對氟苯尼考暴露24 h后牡蠣D型幼蟲的運動行為進行追蹤分析。各實驗組隨機選取15只牡蠣幼蟲置于48孔微板中, 適應(yīng)5 min后, 使用體視顯微鏡(P-DSL32, Nikon)于16倍鏡下進行垂直拍攝5 min。利用視頻追蹤系統(tǒng)(EthoVision XT, Nodus)對牡蠣幼蟲運動行為軌跡進行分析, 計算幼蟲游泳距離、移動速度。

1.6 熒光定量PCR基因表達(dá)

取氟苯尼考暴露24 h后的牡蠣D型幼蟲置于液氮中冷凍, 于–80℃保存。使用RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取牡蠣幼蟲總RNA, 利用超微量核酸蛋白檢測儀(IN0311, Monad)檢查RNA濃度(260 nm)和純度(260/280 nm)。使用Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (AG11705, 湖南艾科瑞生物工程有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。使用TransStart TOP Green qPCR SuperMix試劑盒(Transgen Biotech)進行熒光定量PCR(Lightcycle 96, Roche)。選擇與牡蠣幼蟲生長發(fā)育相關(guān)的基因,和, 根據(jù)太平洋牡蠣幼蟲基因組設(shè)計引物, 序列如表1所示[28]。qPCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為: 94℃預(yù)變性30 s, 94℃變性30 s, 退火30 s, 72℃延伸60 s, 共30個循環(huán), 循環(huán)完成后72℃延伸5 min。各引物序列及優(yōu)化的退火溫度如表1所示。選擇核糖體蛋白L7()為管家基因用于標(biāo)準(zhǔn)化其他目標(biāo)基因的表達(dá)水平, 該基因在各處理組間未顯示差異性, qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2–ΔΔCt法進行分析。每個樣品測量進行三次檢測。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件和Origin Pro軟件對測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析, 實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE)表示。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對對照組和處理組間進行統(tǒng)計學(xué)差異分析, 采用LSD檢驗或Duncan法進行事后檢驗。當(dāng)<0.05時, 認(rèn)為具有顯著性差異, 當(dāng)<0.01時, 認(rèn)為具有極顯著性差異。對氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲生存量和水體細(xì)菌總數(shù)進行相關(guān)性分析, 選擇分別選擇線性回歸(2)和皮爾遜相關(guān)系數(shù)作為計算類型, 利用相關(guān)系數(shù)的大小判斷變量間相關(guān)關(guān)系的密切程度。

2 實驗結(jié)果

2.1 氟苯尼考對牡蠣幼蟲的胚胎毒性

不同濃度氟苯尼考暴露24 h對牡蠣幼蟲存活量的影響如圖1所示。隨著氟苯尼考暴露濃度的增加, 牡蠣幼蟲的存活量呈上升趨勢, 在10 mg/L的 FFC實驗組中, 牡蠣幼蟲的存活量達(dá)到最高, 約為(122.9± 5.3)個/mL, 顯著高于對照組和0.1 mg/L氟苯尼考濃度組(109.9±3.8和101.1±3.6個/mL), 與1 mg/L氟苯尼考濃度組中的存活量無顯著性差異。

進一步對氟苯尼考暴露24 h后各實驗組養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌總數(shù)進行檢測。實驗結(jié)果顯示, 對照組水體中細(xì)菌總數(shù)為(214.2±35.3) CFU/mL, 1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考的實驗組水體內(nèi)細(xì)菌總數(shù)分別為(304.2±58.7) CFU/mL、(296.8±50.4) CFU/mL, 各實驗組與對照組水體中的細(xì)菌總數(shù)并無顯著性差異。

圖1 氟苯尼考對牡蠣幼蟲存活量的影響

注: 不同上標(biāo)字母表示處理組間具有差異性顯著(<0.05)。

對氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲24 h存活量、水體細(xì)菌總數(shù)之間的相關(guān)性進行分析(表2)。統(tǒng)計結(jié)果顯示, 氟苯尼考暴露濃度與牡蠣幼蟲24 h存活量、水體細(xì)菌總數(shù)間具有線性關(guān)系, 且水體細(xì)菌總數(shù)與氟苯尼考暴露濃度、幼蟲存活量之間顯著性相關(guān)(0.5<||≤0.8), 氟苯尼考暴露濃度與幼蟲存活量間呈高度相關(guān)性(0.8<||≤1)。

表2 氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲24 h存活量、水體細(xì)菌總數(shù)之間的相關(guān)性分析

2.2 氟苯尼考暴露對牡蠣幼蟲生長的影響

太平洋牡蠣受精卵在培養(yǎng)24 h后, 進入D型幼蟲期, 開始早期外殼的發(fā)育。與對照組相比, 高濃度氟苯尼考(≥1 mg/L)暴露24 h后, 牡蠣幼蟲的大小顯著性降低(圖2)。在1 mg/L、10 mg/L氟苯尼考暴露后, D型幼蟲的殼高顯著降低(<0.05), 殼高的均值分別為(62.95 ± 0.19) μm、(52.83 ± 0.93) μm, 與對照組相比, 平均殼高分別減少5.50%、20.69%。不同濃度的氟苯尼考暴露24 h后, D型幼蟲殼寬的變化程度較小, 其中10 mg/L氟苯尼考暴露組對殼寬(48.49 ± 0.76) μm的抑制作用顯著高于其他實驗組(<0.05), 與對照組相比降低16.55%。

圖2 氟苯尼考對牡蠣幼蟲生長的影響

注: 不同小寫字母表示不同處理組間殼寬具有差異性顯著(<0.05), 不同大寫字母表示不同處理組間殼高具有差異性顯著(<0.05)。

2.3 氟苯尼考對牡蠣幼蟲運動行為的影響

氟苯尼考對牡蠣幼蟲自主運動行為的影響如圖3所示。不同濃度的氟苯尼考暴露對D型幼蟲的移動速度均未產(chǎn)生明顯的影響, 但在1 mg/L氟苯尼考的暴露后, D型幼蟲的移動速度呈上升趨勢(圖3a)。氟苯尼考對D型幼蟲移動距離的影響如圖3b所示, 低濃度氟苯尼考(<1 mg/L)暴露24 h后, 幼蟲的移動距離并無明顯變化, 在1 mg/L濃度組中D型幼蟲的移動距離顯著增加(<0.05), 相比于對照組(5.80 ± 0.53) cm, 1 mg/L組的移動距離增加了53.20%。10 mg/L氟苯尼考暴露后, 對牡蠣幼蟲的移動距離、移動速度并未產(chǎn)生明顯影響。

2.4 氟苯尼考對牡蠣幼蟲生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

、、和基因參與牡蠣的細(xì)胞發(fā)育和殼的生長過程。如圖4所示,、基因的相對表達(dá)量出現(xiàn)明顯變化(<0.05) (圖4a, b), 而和的轉(zhuǎn)錄水平與對照組相似(圖4c, d)。相較于1 mg/L濃度組, 在0.1 mg/L氟苯尼考暴露下, 牡蠣幼蟲中的相對表達(dá)量顯著增加1.13倍, 高于對照組、10 mg/L氟苯尼考濃度組, 但無顯著性差異。各實驗組中牡蠣幼蟲基因的表達(dá)水平與對照組相似, 但1 mg/L濃度組中基因的表達(dá)水平顯著低于0.1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考濃度組(<0.05), 分別降低為0.47和0.38倍?；蚝偷幕虮磉_(dá)水平隨著氟苯尼考暴露濃度的增加而下調(diào), 但無顯著性差異。的表達(dá)水平在10 mg/L氟苯尼考暴露組出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象, 高于其他實驗組。

圖3 氟苯尼考對牡蠣幼蟲移動行為的影響

注: 不同上標(biāo)字母表示不同處理組間差異性顯著(<0.05)

圖4 氟苯尼考對牡蠣幼蟲生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

注: 不同上標(biāo)字母表示不同處理組間具有顯著性差異(<0.05)。

、和基因與牡蠣的免疫功能相關(guān)。如圖5所示, 氟苯尼考暴露組中基因表達(dá)水平與對照組相比呈升高趨勢, 但無顯著性差異。牡蠣幼蟲體內(nèi)基因表達(dá)水平隨著氟苯尼考暴露濃度的增加而增加, 呈劑量依賴效應(yīng)。與對照組相比, 1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考暴露組中基因表達(dá)水平顯著性升高, 分別增加1.41和0.90倍。低濃度氟苯尼考(<1 mg/L)對基因表達(dá)水平無明顯影響, 1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考暴露組中表達(dá)水平呈下降趨勢。

圖5 氟苯尼考對牡蠣幼蟲免疫功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

注: 不同上標(biāo)字母表示不同處理組間具有顯著性差異(<0.05)。

3 討論

抗生素廣泛應(yīng)用于水生動物疾病的預(yù)防和治療, 大量未被吸收利用的抗生素通過多種途徑最終進入到水環(huán)境介質(zhì)中?？股氐臍埩舨粌H會引起耐藥性的產(chǎn)生, 還會打破生態(tài)平衡, 影響生物多樣性等。水生動植物對抗生素的富集現(xiàn)象會導(dǎo)致抗生素沿食物鏈進行傳遞并放大, 對人類健康造成影響。大量研究表明, 高濃度氟苯尼考暴露對微藻[29-31]、甲殼類水生動物[32]等的生長產(chǎn)生顯著的抑制作用, 但較低濃度的氟苯尼考會對微藻生長產(chǎn)生刺激作用。已有研究利用牡蠣探究農(nóng)藥等污染物的毒性[33-34], 而關(guān)于抗生素對雙殼類動物毒性作用的研究較少。本研究結(jié)果顯示, 牡蠣幼蟲的存活量隨著氟苯尼考暴露濃度的增加而增大。然而, 高濃度的氟苯尼考(>1 mg/L)暴露對牡蠣幼蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生顯著的抑制作用, 牡蠣D型幼蟲的殼高和殼寬均顯著降(<0.05)。牡蠣幼蟲早期發(fā)育階段對外源性化學(xué)污染物較為敏感, 與殼發(fā)育相關(guān)的生理、生化功能易受到影響, 進而影響牡蠣幼蟲后期的附著變態(tài)發(fā)育等過程。

在水產(chǎn)動物人工育苗過程中, 水體中的細(xì)菌含量與養(yǎng)殖生物胚胎能否健康地生長和發(fā)育密切相關(guān)[35]。通常認(rèn)為, 添加抗生素會抑制細(xì)菌病毒的繁殖, 促進養(yǎng)殖生物的生長。本研究中, 不同濃度的氟苯尼考暴露牡蠣幼蟲24 h后, 各處理組的養(yǎng)殖水體中細(xì)菌總數(shù)無顯著性差異。這可能由于牡蠣幼蟲培育時間較短, 水體中細(xì)菌總數(shù)含量較低有關(guān)。本研究培育水體中細(xì)菌總數(shù)比其他魚類、貝類養(yǎng)殖水體中細(xì)菌總數(shù)低2~3個數(shù)量級[36-37]。根據(jù)氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲存活量及水體細(xì)菌總數(shù)之間的相關(guān)性分析結(jié)果提示水體中氟苯尼考的添加會對水體中細(xì)菌的總數(shù)產(chǎn)生影響, 但并不是造成牡蠣幼蟲發(fā)育、生長狀態(tài)不同的主要原因, 可能還與抗生素種類、作用方式、暴露時間有關(guān)。

行為反應(yīng)是水生動物對環(huán)境適應(yīng)的直接結(jié)果, 行為學(xué)參數(shù)的研究是識別和評估環(huán)境壓力的有效工具[>38]。牡蠣幼蟲的泳動能力是貝類浮游幼蟲階段重要的行為表現(xiàn)。不同濃度的氟苯尼考暴露24 h均未引起牡蠣幼蟲移動速度的顯著性變化, 牡蠣幼蟲的移動距離隨著暴露濃度的增加呈倒“U”型, Guo等[39]研究發(fā)現(xiàn)氟苯尼考暴露會影響牙鲆初孵仔魚()的自發(fā)性游泳能力, 與本研究結(jié)果相似。低濃度的氟苯尼考對牡蠣幼蟲的移動距離無明顯的影響, 1 mg/L氟苯尼考暴露會顯著增加牡蠣幼蟲的移動距離, 可能由于氟苯尼考會引起牡蠣幼蟲的運動神經(jīng)興奮, 導(dǎo)致其靜止的時間比例降低。而高濃度的氟苯尼考(10 mg/L)可能會對牡蠣幼蟲產(chǎn)生神經(jīng)毒性, 導(dǎo)致其自由泳動能力下降。Gamain等人[40]發(fā)現(xiàn)銅和S-異丙甲草胺暴露后, 牡蠣幼蟲直線型運動軌跡與對照組無顯著差異, 但圓形軌跡的百分比顯著增加, 提示10 mg/L氟苯尼考暴露對牡蠣幼蟲的移動能力產(chǎn)生脅迫, 可能導(dǎo)致其游泳多呈圓形軌跡, 使得移動距離出現(xiàn)下降趨勢。

雙殼貝類的早期發(fā)育時期對各種環(huán)境壓力較為敏感, 不僅表現(xiàn)在形態(tài)、生理功能改變, 同時對細(xì)胞中基因和蛋白質(zhì)水平產(chǎn)生影響。類胰島素生長因子系統(tǒng)在無脊椎動物生長、發(fā)育、繁殖等過程中起著重要作用。胰島素多肽受體基因()在貝類早期發(fā)育過程中表達(dá)量較高, 負(fù)責(zé)向細(xì)胞內(nèi)傳遞不同配體的信號, 使貝類發(fā)育順利進行[41]。本研究中隨著氟苯尼考暴露濃度的升高表達(dá)水平呈先升高后降低趨勢, 可能是由于低濃度的氟苯尼考會對牡蠣幼蟲產(chǎn)生的毒性興奮效應(yīng), 激活表達(dá)水平升高, 而高濃度的氟苯尼考暴露抑制表達(dá), 影響細(xì)胞內(nèi)配體的信號傳遞, 進而可能會影響牡蠣幼蟲的生長發(fā)育?；蚺c軟體動物的非鈣化殼的形成有密切的關(guān)系, 參與貝殼角質(zhì)層的形成[42], 在1 mg/L氟苯尼考的暴露下,基因水平出現(xiàn)顯著性下降(0.05), 提示氟苯尼考暴露可能會抑制牡蠣幼蟲殼的生成與鈣化, 這與前文D型幼蟲的生長結(jié)果相一致?；騾⑴c細(xì)胞生長、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和細(xì)胞解毒等過程, 10 mg/L氟苯尼考的暴露引起基因表達(dá)水平的上調(diào), 可能是氟苯尼考參與了細(xì)胞內(nèi)催化氧化反應(yīng), 促進官能團與極性分子結(jié)合, 使得其水溶性增加進而促進排泄, 對氟苯尼考起到解毒的功能[43]。牡蠣幼蟲內(nèi)鐵蛋白參與牡蠣幼蟲纖毛功能的發(fā)育, 氟苯尼考暴露降低了基因的表達(dá)水平, 進而影響牡蠣幼蟲的自主運動能力。

牡蠣在面對生物或非生物壓力時, 可催化細(xì)胞內(nèi)羥基自由基的形成, 細(xì)胞受到氧化脅迫的影響。在氟苯尼考的暴露下, 牡蠣幼蟲的基因、免疫功能基因變化較小。參與保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[44]。隨著氟苯尼考暴露濃度的增加,基因相對表達(dá)量出現(xiàn)上升趨勢, 提示其可能參與機體抵御氟苯尼考暴露引起的氧化脅迫。在牡蠣血細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá), 與早期造血細(xì)胞的形成相關(guān), 在誘導(dǎo)造血活性的雙殼軟體動物的免疫系統(tǒng)中起作用。Auffret等[45]人研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)多環(huán)芳烴暴露濃度超過100 μg/L時, 歐洲扇貝()血細(xì)胞數(shù)量增加, 這是面對環(huán)境脅迫時一種常見的反應(yīng)。本研究中基因表達(dá)水平隨著氟苯尼考暴露濃度的升高而顯著上升, 說明基因積極參與氟苯尼考暴露引起的機體免疫排斥反應(yīng)。家族在細(xì)胞凋亡途徑中對凋亡信號的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和增殖起著重要的作用, 通過對靶蛋白的水解, 導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡[46]。隨著暴露濃度的升高,相對表達(dá)量無顯著性變化, 提示氟苯尼考暴露雖然會對牡蠣幼蟲產(chǎn)生氧化脅迫作用但不會引起牡蠣幼蟲發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

綜上, 本研究結(jié)果提示處理濃度的氟苯尼考雖然會提高牡蠣幼蟲的存活量, 但對牡蠣幼蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生了顯著的抑制作用, 隨著暴露時間的延長, 可能會導(dǎo)致牡蠣幼蟲外殼的畸形與鈣化, 影響牡蠣幼蟲后期變態(tài)發(fā)育及附著。此外, 高濃度的氟苯尼考(10 mg/L)暴露會造成纖毛功能的損傷, 影響牡蠣幼蟲的自主運動能力, 可能會對其攝食產(chǎn)生影響。因此, 在養(yǎng)殖育苗過程中, 需密切注意養(yǎng)殖水體的水質(zhì)狀態(tài), 提高對養(yǎng)殖水體中抗生素殘留危害的認(rèn)識及監(jiān)測, 進一步加強養(yǎng)殖水體水質(zhì)的凈化。

4 結(jié)論

本實驗以太平洋牡蠣幼蟲為實驗對象, 研究不同濃度的氟苯尼考暴露24 h后對牡蠣幼蟲早期生命階段生長發(fā)育的影響, 探討氟苯尼考對牡蠣幼蟲的作用機理, 得到以下結(jié)論:

1) 高濃度氟苯尼考(10 mg/L)暴露顯著增加牡蠣幼蟲的存活量。低濃度的氟苯尼考暴露(0.1 mg/L)對牡蠣幼蟲的大小未產(chǎn)生顯著性影響, 當(dāng)暴露濃度高于1 mg/L時, 牡蠣幼蟲的殼高、殼寬顯著降低。

2) 氟苯尼考暴露對牡蠣D型幼蟲的移動速度影響較小, 明顯影響牡蠣幼蟲的移動距離。1 mg/L氟苯尼考的暴露后, D型幼蟲的移動速度有上升的趨勢, 移動距離顯著性增加(<0.05)。

3) 氟苯尼考通過影響牡蠣幼蟲生長發(fā)育相關(guān)基因和的表達(dá), 進而對牡蠣幼蟲的生長發(fā)育、運動能力等產(chǎn)生影響;

4) 氟苯尼考暴露會對牡蠣幼蟲產(chǎn)生氧化脅迫作用,和基因參與保護細(xì)胞免受氟苯尼考引起的氧化應(yīng)激損傷。

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Effects of florfenicol on the development ofduring the early developmental stage

ZHANG Ying-qi1, 2, ZHANG Xian-yu1, 2, GUO Qing-fang1, XU Wen-hao1, MA Zheng1, SHI Shuo1, ZHANG Qian1, 2, LIU Ying1, 2

(1. College of Marine Science and Environment, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Key Laboratory of Environment Controlled Aquaculture, Ministry of Education, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Florfenicol, the alternative of chloramphenicol, is the most commonly used antibiotic in aquaculture. Its residues are widely distributed in the aquatic environment because of its low degradability. In the present research, the effects of florfenicol (0.1, 1.0, and 10mg/L) on the growth and development, motor behavior, and immunity oflarvae during the early developmental stage were investigated. The results showed that the survival of larvae increased with increasing florfenicol concentration, whereas the shell height and shell width of the larvae considerably decreased after exposure for 24h. Further, there was little effect on moving velocity, and the moving distance considerably increased when exposed to florfenicol at the concentration of 1mg/L.The correlations among the concentration of florfenicol, survival of the larvae, and total number of bacteria were observed, In contrast, the total numbers of bacteria may not be the main reason for the differences in growth and development. Florfenicol affected the mRNA expression of,and, which further influenced the growth and development as well as the motor ability of the larvae. On the other hand, the high concentration of florfenicol induced oxidative stress in the larvae, the levels ofandwere upregulated, and they participated in the immune stress response. The antibiotic residues in aquaculture may affect the growth and immunity of animals during the early developmental stage. Thus, it is necessary to improve the understanding and monitoring of antibiotic residues in the aquatic environment and to strengthen the water purification efforts.

florfenicol; oyster larvae; growth and development; motor behavior; immune resistance

Jun. 29, 2020

R994.6

A

1000-3096(2021)01-0100-10

10.11759/hykx20200629002

2020-06-29;

2020-08-01

廣東省重點研發(fā)計劃項目(2019B020215001); 遼寧省自然基金計劃項目(2019-BS-035); 遼寧省高水平創(chuàng)新團隊境外培養(yǎng)項目(201818); 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室開放課題(KLIEEE-17-12)

[the Key R&D Program of Guangdong Province, No. 2019B020215001; the PhD Research Funds of Liaoning Province, No. 2019–BS-035; Overseas Training Program for Innovation Team of Liaoning Province, No. 201818; Foundation of Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering, Ministry of Education, No. KLIEEE-17-12]

張鶯臍(1995?), 女, 遼寧省盤錦, 學(xué)士學(xué)位, 在讀研究生, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素相關(guān)研究, 電話: 15504177520, E-mail: 1430152168@qq.com; 張倩,通信作者, 講師, E-mail: qianzhang@ dlou.edu.cn

(本文編輯: 楊 悅)