王贊麗(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，咸陽 712000)

熊果苷是從熊果葉子中提取得到的一種對苯二酚糖苷類單體化合物。藥理學(xué)研究表明[1-2]，熊果苷能通過直接與黑色素細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸酶結(jié)合，阻斷酪氨酸酶的生物活性，從而抑制皮膚組織中的黑色素沉積，加速黑色素分解與排泄，達(dá)到皮膚美白、祛斑的作用。熊果苷不干擾正常皮膚細(xì)胞與黑色素細(xì)胞的分裂增殖，對皮膚組織無刺激性、致敏性等毒性和不良反應(yīng)[3-4]，具有一定的殺菌與消炎作用[5-6]，被認(rèn)為是當(dāng)今最安全、有效的皮膚美白祛斑劑之一[7]。但熊果苷屬于脂溶性低的化合物，無法通過皮膚的疏水性角質(zhì)層進(jìn)入黑色素細(xì)胞內(nèi)部[8]。研究人員將其制備成聚合物納米粒[9]、膠束[10]和微針[11]等新型給藥系統(tǒng)來增強(qiáng)熊果苷的皮膚透過性。本研究針對熊果苷皮膚滲透性差的缺點，采用殼聚糖作為載體材料，將熊果苷制備成殼聚糖納米粒，以提高熊果苷的透皮性，增強(qiáng)美白效果。

1 儀器與材料

1.1儀器 H-9500型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；UltiMate 3000標(biāo)準(zhǔn)型液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；Zetasizer Nano ZS 90型激光粒度儀(英國馬爾文公司)；RYJ-6B型藥物透皮擴(kuò)散實驗儀(上海珂淮儀器有限公司)；TG25KR型高速冷凍離心機(jī)(上海繼譜電子科技有限公司)；MP511型數(shù)顯實驗室pH計(上海三信儀表廠)。

1.2試藥 熊果苷原料藥(批號836276L2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%)，湖北帝鑫化工制造有限公司；殼聚糖(脫乙酰度為95%，相對分子質(zhì)量為5.0×104)，北京酷來搏科技有限公司；三聚磷酸鈉(TPP)，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；冰醋酸，西安泰華醫(yī)藥科技有限公司。

1.3動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量為(250±20)g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK-(軍)2007-007。

2 方法與結(jié)果

2.1熊果苷殼聚糖納米粒(Arb-CS-NPs)的制備 采用離子凝膠化法制備Arb-CS-NPs。取純化水45 mL，加入冰醋酸調(diào)節(jié)至一定pH值；稱取處方量的殼聚糖加入上述溶液中，攪拌溶解，形成澄清透明狀溶液；再稱取處方量熊果苷加入該溶液中，攪拌至完全溶解；以3 000 r·min-1磁力攪拌，將一定質(zhì)量濃度的TPP溶液5 mL通過7號注射器針頭緩慢加入上述溶液中，持續(xù)攪拌30 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.4處方優(yōu)化

2.4.1Box-Behnken實驗設(shè)計優(yōu)化處方 參考文獻(xiàn)[13]并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，以殼聚糖質(zhì)量濃度(X1)、TPP質(zhì)量濃度(X2)和溶液pH值(X3)作為自變量，以平均粒徑(Y1)和包封率(Y2)作為因變量，通過3因素3水平的Box-Behnken實驗設(shè)計評價3個關(guān)鍵處方變量對粒徑分布和包封率的影響，實驗設(shè)計包括3個重復(fù)中心點和一系列多維實驗點，因素與水平見表1，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 因素與水平

表2 實驗設(shè)計與結(jié)果

2.4.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 通過Box-Behankn實驗設(shè)計對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3和表4。

表3 粒徑分布的方差分析結(jié)果

表4 包封率的方差分析結(jié)果

由表3可知，模型P值為0.043 4，小于0.05，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項P值為0.173 4，大于0.05，表明實測值與預(yù)測值之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，模型擬合可信度較高；建立的多元二項式擬合方程為：Y1=839.05-201.56X1-335.70X2-111.78X3-22.44X1X2+55.03X1X3-4.98X2X3+15.80X12+92.48X22+0.71X32(R12=0.902 1)。方程中X1和X1X3對粒徑分布影響較顯著(P<0.05)，即在TPP質(zhì)量濃度和溶液pH值固定的條件下，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，Arb-CS-NPs的平均粒徑呈增大趨勢，這可能是由于殼聚糖質(zhì)量濃度增加使整個溶液體系的黏稠度增大，因此粒徑呈增大趨勢[14]，見圖1。

圖1 殼聚糖質(zhì)量濃度、TPP質(zhì)量濃度和溶液pH值對Arb-CS-NPs粒徑分布影響的效應(yīng)面圖

由表4可知，模型P值為0.001 8，小于0.05，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項P值為0.128 0，大于0.05，表明實測值與預(yù)測值之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，模型擬合可信度較高；建立的多元二項式擬合方程為：Y2=26.27+2.87X1+6.04X2+23.71X3+2.46X1X2+1.31X1X3-2.93X2X3-1.55X12-1.46X22-3.11X32(R22=0.974 9)。方程中X1、X2、X3、X1X2、X2X3、X12和X32對包封率影響差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，即Arb-CS-NPs的包封率隨著殼聚糖質(zhì)量濃度增加而增加，隨著TPP質(zhì)量濃度和溶液pH值的減小而增加，這是由于納米粒的形成很大程度上取決于殼聚糖的質(zhì)量濃度以及游離氨基的數(shù)量，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度增加時(相對于TPP質(zhì)量濃度減小)，得到的納米粒數(shù)量更多，另外，溶液pH值降低，使得游離氨基數(shù)量增加，形成的納米粒數(shù)量增加，包封率提高[15]。見圖2。

圖2 殼聚糖質(zhì)量濃度、TPP質(zhì)量濃度和溶液pH值對Arb-CS-NPs包封率影響的效應(yīng)面圖

2.4.3最佳處方預(yù)測與驗證 要求制備的Arb-CS-NPs粒徑分布最小，包封率最大為目標(biāo)，通過軟件擬合得到最佳處方為：殼聚糖質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1，TPP質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1，溶液pH值為3.5，預(yù)測得到Arb-CS-NPs的粒徑分布為126.6 nm，包封率為79.5%。通過制備3批Arb-CS-NPs以驗證最優(yōu)處方的可靠性，結(jié)果顯示，粒徑分布平均值為(132.5±12.2)nm，包封率為78.9%±1.1%，實測值與預(yù)測值接近，最佳處方的可信度較高。

2.5粒徑分布及Zeta電位的測定 使用Zetasizer Nano ZS 90型激光粒度儀，按照2.2項下粒徑測定方法測定Arb-CS-NPs的粒徑分布和Zeta電位，見圖3。由圖3可知，粒徑呈正態(tài)分布，分布較窄，粒徑分布在100～200 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為(132.5±12.2)nm，Zeta電位為(24.6±0.9)mV，說明Arb-CS-NPs表面帶有正電荷。

圖3 Arb-CS-NPs的粒徑分布(A)和Zeta電位(B)

2.6微觀形態(tài)觀察 取2.1項下少量新制備的Arb-CS-NPs，加入蒸餾水稀釋，外觀呈淡藍(lán)色透明狀，取1滴溶液滴加到碳涂層的銅網(wǎng)格上，均勻展開，用濾紙吸干水分，再滴加1滴質(zhì)量濃度為50 mg·mL-1的磷鎢酸鈉溶液，負(fù)染10 min，揮干水分，通過透射電鏡觀察其微觀形態(tài)，見圖4。由圖4可知，透射電鏡下可觀察到Arb-CS-NPs呈類球狀，表面光滑，分散良好，納米粒粒徑大小與Zetasizer Nano ZS 90型激光粒度儀的測得值接近。

圖4 Arb-CS-NPs透射電鏡圖

表5 Arb-CS-NPs與熊果苷美白乳液的累積透皮量

由表6可知，Arb-CS-NPs的12 h累積透皮量(Q12)和穩(wěn)態(tài)滲透速率(Js)分別是熊果苷美白乳液的4.71，4.68倍，表明Arb-CS-NPs能夠顯著提高熊果苷的透皮性能。

表6 Arb-CS-NPs與熊果苷美白乳液體外透皮參數(shù)

3 討論

殼聚糖作為一種天然的N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰聚合物，具有生物相容性好、可降解、安全無毒等優(yōu)點，皮膚滲透性和保濕性較強(qiáng)，在局部透皮給藥中具有潛在的應(yīng)用價值[16-17]，在醫(yī)藥領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[18-19]。本研究將熊果苷制備成殼聚糖納米粒，并通過Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化得到最佳處方為：殼聚糖質(zhì)量濃度為3.0 mg·mL-1，TPP質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1，溶液pH值為3.5，制備得到的Arb-CS-NPs的平均粒徑為(132.5±12.2)nm，Zeta電位為(24.6±0.9)mV，包封率為78.9%±1.1%。體外透皮實驗結(jié)果顯示，Arb-CS-NPs在12 h內(nèi)累積透皮量和穩(wěn)態(tài)滲透速率分別是熊果苷美白乳液的4.71，4.68倍，這可能是由于Arb-CS-NPs粒徑較小，納米?？赏ㄟ^表皮細(xì)胞間的緊密連接進(jìn)入皮膚內(nèi)部[15]；另一方面，人體表皮細(xì)胞表面帶有負(fù)電荷，Arb-CS-NPs表面帶有正電荷，通過靜電相互作用，能夠?qū)д姾傻臍ぞ厶羌{米粒牢固地結(jié)合到帶有負(fù)電荷的細(xì)胞表面，再通過細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入到皮膚內(nèi)部[20]。同時，本研究也為親水性藥物透皮吸收提供了新方法，將水溶性藥物制備成殼聚糖納米粒可促進(jìn)藥物透皮吸收。