劉媛媛，賀 朝(.咸陽職業(yè)技術學院,咸陽 72000；2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,咸陽 72000)

阿可拉定(Ica)又稱淫羊藿苷元，是從多年生草本植物淫羊藿中分離的淫羊藿提取物經酶轉化得到的一種異戊二烯黃酮類化合物單體[1]。早期研究發(fā)現，Ica具有抗炎、抑制骨質疏松、保護神經系統(tǒng)和調節(jié)免疫等藥理作用[2]，近年來研究發(fā)現，Ica能夠抑制肝癌、肺癌和乳腺癌等腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡等藥理活性[3]。Ica在水中的溶解度小于1.0 μg·mL-1，導致口服吸收不完全，生物利用度較低，降低了藥物的治療效果[4]。為了改善Ica的溶解度，研究人員將其制備成膠束[5]、磷脂復合物[6]和脂質體[7]等新型給藥系統(tǒng)。本研究將Ica制備成納米混懸劑(Ica-NSs)，采用Box-Behnken實驗設計優(yōu)化得到Ica-NSs的最優(yōu)處方，為Ica的體內藥動學研究奠定實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1儀器 LGJ-18N型普通多歧管冷凍干燥機(北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司)；JY98-ⅢN型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；S10-3型數顯恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；RYX-12D 型全自動溶出取樣收集系統(tǒng)(北京北研科儀儀器有限責任公司)；JSM-IT500型掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)；Malvern Zetasizer Nano型激光納米粒度儀(英國馬爾文公司)。

1.2材料 阿可拉定原料藥(上海熹垣生物科技有限公司，質量分數為98.5%，批號20180923)；羥丙基纖維素(HPC SSL，日本曹達株式會社)；羥丙甲纖維素(HPMC E5，亞什蘭中國公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS，德國默克密理博公司)；聚維酮(PVP K30)和泊洛沙姆188(F68)均購于上海巴斯夫輔料公司；吐溫80(T-80，日本油脂公司)。

2 方法與結果

2.1Ica-NSs的制備 采用反溶劑沉淀-超聲法[8-9]制備Ica-NSs。①配制藥物乙醇溶液：稱取處方量Ica加入到2 mL乙醇中溶解，經0.45 μm微孔濾膜過濾，除去不溶性固體雜質，得到藥物的有機相溶液，備用；②配制反溶劑：按照實驗設計稱取處方量穩(wěn)定劑(HPC SSL、PVP K30和HPMC E5)和表面活性劑(SDS、F68和T-80)，溶解到一定體積的蒸餾水中，經0.8 μm微孔濾膜過濾，得到反溶劑，備用；③Ica-NSs的制備：設置磁力攪拌速度為1 500 r·min-1，通過帶有7號針頭的注射器將含藥物的有機相溶液滴加到反溶劑中，快速析出藥物晶體，持續(xù)攪拌10 min，在45 ℃條件下真空除去乙醇；將上述懸濁液經探頭超聲(超聲2 s，間隔2 s，超聲功率為380 W)處理5 min，即得到Ica-NSs。

取新制備的Ica-NSs 5 mL，加入15 mL西林瓶中，加入質量濃度為100 g·L-1的甘露醇，溶解，置于冷凍干燥機中冷凍干燥，預凍溫度為-40 ℃，一次干燥溫度為-5 ℃，真空度為30 Pa，干燥時間為10 h，解析干燥溫度為25 ℃，真空度為5 Pa，干燥時間為6 h，干燥結束后加塞密封保存。

2.2含量測定方法

2.2.1色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：10 g·L-1磷酸-甲醇(20∶80)；檢測波長：272 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。

2.2.2線性考察 精密稱取Ica對照品10 mg，置于20 mL量瓶中，加入甲醇5 mL溶解，再加入流動相定容，得到對照品儲備液，取上述儲備液加入流動相逐步稀釋成藥物質量濃度分別為50.0，10.0，5.0，1.0，0.5 μg·mL-1的溶液，進樣檢測。以藥物質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得到方程為A=49 325.6C+2 902.6(r=0.999 9)，說明Ica質量濃度在0.5～50.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好。取低、中、高(0.5,5.0,50.0 μg·mL-1)3個質量濃度Ica對照品溶液，分別進行日內精密度與日間精密度考察，結果顯示，低、中和高3個質量濃度的Ica對照品溶液的日內精密度RSD值分別為0.9%，1.0%，0.5%(n=6)，日間精密度RSD值分別為1.2%，0.8%，1.1%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.3Ica-NSs處方研究

2.3.1穩(wěn)定劑種類篩選 文獻報道[10]，穩(wěn)定劑的種類和質量濃度會對納米混懸劑的粒徑分布產生顯著影響，因此本研究需要對穩(wěn)定劑的種類進行篩選。高分子聚合物穩(wěn)定劑選擇PVP K30、HPC SSL和HPMC E5，表面活性劑選擇SDS、F68和T-80，將二者聯合應用考察其對Ica-NSs制劑性質的影響，結果見表1。

表1 穩(wěn)定劑篩選結果

由表1可知，以PVP K30和SDS聯合使用作為穩(wěn)定劑制備的Ica-NSs粒徑分布較小，Zeta電位絕對值較大，放置12 h未發(fā)生聚集和沉降現象。因此本研究選擇PVP K30和SDS作為Ica-NSs的穩(wěn)定劑，并對二者的質量濃度做進一步的研究。

2.3.2穩(wěn)定劑質量濃度篩選 固定Ica質量濃度為10 mg·mL-1，分別考察PVP K30質量濃度為2，6 mg·mL-1，SDS質量濃度為0.4，1.0 mg·mL-1，制備Ica-NSs，測定粒徑分布、PDI及Zeta電位，篩選穩(wěn)定劑的質量濃度，結果見表2。

表2 穩(wěn)定劑質量濃度篩選結果

研究結果表明，穩(wěn)定劑質量濃度對Ica-NSs的粒徑分布影響較大，當體系中PVP K30質量濃度較低時，制備的Ica-NSs粒徑相對較小，而PVP K30質量濃度較高時，溶液黏度增大，促使Ica-NSs粒子之間相互黏附聚集，粒徑變大，因此需要對穩(wěn)定劑質量濃度進一步優(yōu)化。

2.3.3Ica質量濃度篩選 固定PVP K30質量濃度為2 mg·mL-1、SDS質量濃度為0.4 mg·mL-1，選擇Ica質量濃度分別為10，30，50 mg·mL-1制備Ica-NSs，測定粒徑分布、PDI及Zeta電位，篩選Ica質量濃度，結果見表3。

表3 Ica質量濃度篩選結果

研究結果表明，Ica質量濃度由10 mg·mL-1增加到50 mg·mL-1時，制備的Ica-NSs粒徑從(278.2±26.7) nm增加到(494.3±29.3) nm，說明粒徑隨著Ica質量濃度的增加而增大，因此需要對Ica質量濃度進一步優(yōu)化。

2.4Ica-NSs處方優(yōu)化

2.4.1Box-Behnken實驗設計 通過前期處方篩選結果可知，粒徑大小對Ica-NSs的穩(wěn)定性起到關鍵作用，因此本研究以納米混懸劑的粒徑分布(Y)作為評價指標，以Ica質量濃度(X1)、PVP K30質量濃度(X2)和SDS質量濃度(X3)作為變量因素，自變量水平見表4。利用Box-Behnken實驗設計法對Ica-NSs的處方組成進行優(yōu)化，實驗設計及結果見表5。

表4 Box-Behnken實驗設計自變量與水平

表5 Box-Behnken實驗設計及結果

2.4.2模型的建立及顯著性檢驗 通過Box-Behnken實驗設計軟件對表5數據進行分析處理，以評估Ica、PVP K30和SDS的質量濃度與Ica-NSs粒徑分布之間的相關性。方差分析結果見表6。由表6可知，模型Y的P值均為0.000 8，小于0.05，說明建立的模型顯著；而失擬項P值為0.389 1，大于0.05，說明實測值和預測值之間差異無統(tǒng)計學意義，模型擬合可信度較高。建立的模型擬合方程為：

Y=822.54-44.98X1+9.93X2-287.64X3+0.54X1X2+2.71X1X3+34.75X2X3+0.97X12-0.03X22+115.79X32(R2=0.982 0)。

結果表明，Ica、PVP K30和SDS的質量濃度對Ica-NSs的粒徑分布影響顯著(P<0.05)。通過效應面圖更能直觀地分析自變量與因變量之間的關系。效應面圖見圖1。

表6 方差分析結果

圖1 Ica質量濃度(X1)、PVP K30質量濃度(X2)和SDS質量濃度(X3)對Ica-NSs的粒徑分布(Y)的效應面圖

由圖1可知，當PVP K30質量濃度恒定時，隨著Ica質量濃度的增加，Ica-NSs的粒徑呈先減小后增大趨勢；當Ica質量濃度恒定時，隨著PVP K30質量濃度的增加，Ica-NSs的粒徑呈增大趨勢；當PVP K30質量濃度恒定時，隨著SDS質量濃度的增加，Ica-NSs的粒徑呈增大趨勢。

本研究要求制備的Ica-NSs具有最小化的粒徑分布，經軟件優(yōu)化得到最佳處方組成為：Ica、PVP K30和SDS質量濃度分別為20.0,3.0,0.7 mg·mL-1，預測得到Ica-NSs的粒徑分布為340.6 nm。根據最佳處方制備Ica-NSs，測定粒徑分布為(335.2±18.5) nm，實驗測定值與預測值接近，模型預測準確性較高。

2.5Ica-NSs及凍干粉末表征

2.5.1掃描電鏡觀察 取少量Ica-NSs，用蒸餾水稀釋，取1滴加到錫箔紙上，揮干水分，黏附至電膠布上，噴金；另取凍干后的Ica-NSs固體粉末，黏附至電膠布上，噴金。在掃描電鏡下分別觀察2份樣品的微觀結構，并拍攝電鏡照片，見圖2。

圖2 Ica-NSs(A)及其Ica-NSs凍干粉末(B)掃描電鏡圖

在掃描電鏡下可觀察到凍干前Ica-NSs粒徑較小，大部分粒徑分布在200～400 nm，且顆粒呈不規(guī)則狀態(tài)；Ica-NSs凍干粉末呈多孔纖維狀結構，可以看到Ica-NSs沉積在表面。

2.5.2粒徑分布測定 取Ica-NSs及該批Ica-NSs制備的凍干粉末，加入蒸餾水稀釋，并輕輕振搖，分散成透明狀溶液，取上述樣品，采用Malvern Zetasizer Nano型激光納米粒度儀測定粒徑分布、PDI及Zeta電位，結果見表7。

由表7可知，Ica-NSs凍干前后的粒徑分布、PDI和Zeta電位未發(fā)生顯著變化，說明冷凍干燥沒有促使其聚集。

表7 Ica-NSs凍干前后的理化性質

2.6溶出度對比研究 比較Ica原料藥、Ica-NSs及Ica-NSs凍干粉末的體外藥物溶出度，溶出度測定參數為：介質為pH6.8磷酸鹽緩沖液(加入10 mg·mL-1T-80)，體積為500 mL，攪拌槳轉速為50 r·min-1。分別取Ica原料藥，Ica-NSs及Ica-NSs凍干粉末，加入到溶出杯中，依次在5，10，15，30，45，60 min取出5 mL介質溶液，過濾，稀釋至適當質量濃度，檢測藥物含量，計算藥物溶出量，繪制時間-溶出曲線。見圖3。

圖3 Ica原料藥、Ica-NSs及Ica-NSs凍干粉末的體外溶出曲線 (n=6)

實驗結果表明，Ica-NSs在10 min內藥物溶出度基本達到100%，Ica-NSs凍干粉末在5 min時溶出度較納米混懸劑稍慢，到10 min時藥物溶出度與納米混懸劑基本一致，Ica原料藥溶出非常緩慢，在60 min溶出度僅為50%左右。說明將Ica制備成納米混懸劑可顯著提高藥物的溶出度。

2.7穩(wěn)定性研究 取Ica-NSs凍干粉末密封于西林瓶中，放置在加速實驗(40 ℃、相對濕度為75%)條件下考察其穩(wěn)定性，在設定時間間隔取樣，測定其粒徑分布、PDI、Zeta電位、含量以及10 min藥物溶出度，結果見表8。穩(wěn)定性實驗結果表明，Ica-NSs凍干粉末在加速條件放置3個月后粒徑分布、PDI、Zeta電位、含量以及10 min藥物溶出度幾乎無變化，說明其穩(wěn)定性良好。

表8 加速實驗穩(wěn)定性結果

3 討論

納米混懸劑是以少量高分子聚合物和/或表面活性劑作為穩(wěn)定劑，通過機械性超微粉碎技術或者控制結晶析出條件將藥物制備成粒徑小于1 000 nm且具有良好的物理穩(wěn)定性的膠體分散體[11]，由于納米混懸劑粒徑較小，將藥物制備成納米混懸劑后能夠顯著增加藥物的溶解度和生物利用度[12-13]。然而，納米混懸劑比表面積巨增，熱力學體系處于不穩(wěn)定狀態(tài)，因此會自發(fā)地通過相互聚集以減小比表面積，最終導致納米混懸劑出現聚集、團聚、沉降和晶型轉變等現象，因此需要在處方中加入穩(wěn)定劑阻止納米混懸劑的聚集或團聚，以增加體系的穩(wěn)定性，目前常用的穩(wěn)定劑分為高分子聚合物類和表面活性劑2種類型[14-16]。本研究通過實驗篩選表明，以PVP K30和SDS聯合使用作為穩(wěn)定劑制備的Ica-NSs粒徑分布較小，Zeta電位絕對值較大，放置12 h體系未發(fā)生聚集和沉降現象，這是由于PVP K30作為聚合物高分子能有效地吸附在納米混懸劑表面，產生空間位阻作用，另外SDS吸附在納米混懸劑表面增加了微粒之間的靜電作用，進一步阻礙納米混懸劑聚集，通過PVP K30和SDS在納米混懸劑表面形成緊密的聚合物/表面活性劑二元保護層，提高了體系的穩(wěn)定性。

目前文獻報道，對于納米混懸劑的處方篩選和優(yōu)化可以選擇正交實驗設計法[17]、中心復合實驗設計法[18]和Box-Behnken實驗設計法[19]等，每種實驗設計各有特點，正交實驗設計只能給出所篩選實驗的最佳組合，而Box-Behnken實驗設計法可以克服正交實驗設計存在的弊端，可以在整個區(qū)域內提供最佳實驗組合，該設計使用方便，預測性良好，是解決實際問題的有效手段[20]。本實驗采用了Box-Behnken實驗設計法優(yōu)化了Ica-NSs的處方，實測值與預測值接近，預測準確性較高。