鄧夢琪 張艷芹 常翔宇 吳 迪 徐春玉 苗勁蔚

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100006)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是病死率最高的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，其生物學(xué)行為特性是起病隱匿、進(jìn)展迅速、復(fù)發(fā)及病死率高。由于缺乏早期診斷手段，發(fā)病后多在短時(shí)間內(nèi)盆腹腔廣泛種植和轉(zhuǎn)移，因此60%的OC在首次就診已為晚期[2]。

B7同系物3(B7 homolog 3，B7-H3)是2001年發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子B7家族成員之一，也是重要的免疫檢查點(diǎn)[3]。研究[4]顯示，與PD-1/PD-L1、CTLA-4主要作用T細(xì)胞不同，B7-H3能在降低CD8+T細(xì)胞活化的同時(shí)抑制自然殺傷細(xì)胞的活性，并在細(xì)胞增生分化等方面起調(diào)控作用。B7-H3在眾多惡性腫瘤的細(xì)胞增生中發(fā)揮重要作用[5-6]，本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)建立B7-H3敲降的ES-2細(xì)胞株，檢測B7-H3表達(dá)情況并觀察敲降組與對照組細(xì)胞增生活性改變，為研究以B7-H3為靶點(diǎn)的ES-2細(xì)胞株增生機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國 Thermo Fisher Scientific公司)、超凈細(xì)胞工作臺 (美國 Thermo Fisher Scientific公司)、微量可調(diào)移液槍(法國Glison公司)、eclipse TS100-F倒置光學(xué)顯微鏡(日本NiKon公司)、MULTIFUGE X3R 臺式離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)和precision GP 10型水浴鍋(美國Thermo Fisher Scientific公司)、免疫熒光顯微鏡(日本NiKon公司)、Applied BiosystemsTM7500 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀(美國 Thermo Fisher Scientific公司)、LSR FORTESSA流式細(xì)胞儀(美國BD公司)、酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.2 主要儀器

人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞株(ES-2)購自武漢普諾賽公司。McCoy-s-5-A培養(yǎng)基(北京索萊寶公司)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(美國Life公司)、1XPBS溶液(北京 索萊寶公司)、0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶-EDTA溶液(北京索萊寶公司)、Trizol(美國Invitrogen公司)、TIAN Script RT試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、 SYBR FAST qPCR試劑盒(美國KAPA Biosystems公司)、 氯仿(北京化學(xué)試劑廠)、異丙醇(北京化學(xué)試劑廠)、兔抗人B7-H3抗體(美國Abcam公司ab134161)、山羊F(ab′)2抗人Fc-PE抗體(美國Abcam公司，Ab98596)、青鏈霉素(北京索萊寶公司)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)(北京索萊寶公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒載體檢測B7-H3的轉(zhuǎn)染

將ES-2人卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的McCoy-s-5-A培養(yǎng)物中，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃，75%±5%濕度條件下培養(yǎng)。以國家生物技術(shù)信息中心(National Coalition Building Institute，NCBI)基因庫中記錄的B7-H3的基因序列為基礎(chǔ)，分別設(shè)計(jì)3條shRNA，將3條shRNA分別進(jìn)行引物合成，并插入慢病毒表達(dá)骨架質(zhì)粒中，完成慢病毒基因沉默質(zhì)粒構(gòu)建。比較測序和篩選正確的克隆結(jié)果后，進(jìn)行質(zhì)粒提取。使用限制酶消化獲得線性化載體。通過線性化載體和退火產(chǎn)物制備反應(yīng)體系，線性載體與設(shè)計(jì)的底漆連接，產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化。適當(dāng)擴(kuò)大克隆培養(yǎng)并提取以用于下游病毒包裝。293 T細(xì)胞與攜帶靶序列的工具載體質(zhì)粒GV115，Helper 1.0和Helper 2.0共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染完成后48～72 h收集未純化的細(xì)胞上清液。然后，將上清液相對濃縮并純化以獲得高滴度的慢病毒溶液，并測定慢病毒的滴度。實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組為感染編號為429病毒的對照組(對照病毒429)，另一組為分別感染編號為526、527及528病毒的B7-H3敲降組(沉默病毒526、527及528)，其序列信息如表1。將ES-2細(xì)胞珠與慢病毒載體孵育72 h以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 RT-qPCR檢測B7-H3 mRNA的表達(dá)

在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞生長至80%融合條件下收集細(xì)胞。提取總RNA。首先將細(xì)胞以2 000 r/min 離心5 min。然后除去上清液，加入1 mL Trizol。在室溫下靜置5 min后，將其轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL Eppendorf管中。加入200 μL氯仿后，將混合物在室溫放置10 min。將混合物在4 ℃以12 800 r/min離心15 min。收集上部上清液，并加入等體積的預(yù)冷異丙醇。在4 ℃下靜置10 min后，再次在4 ℃下以12 800 r/min離心12 min，棄去上清液。用1 mL新鮮的DEPC水制備的75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌殘余物。將懸浮液在4 ℃以11 800 r/min離心5 min兩次并棄去上清液。在獲得總RNA之后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)標(biāo)通過RT-qPCR檢測B7-H3的相對表達(dá)改變B7-H3和GAPDH的序列如下：B7-H3，正向引物：5′-AGC ACT GTG GTT CTG CCTCAC A-3′，反向引物：5′-CAC CAG CTG TTT GGT ATC TGT CAG-3′；GAPDH，正向引物：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′，反向引物：5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3′。循環(huán)參數(shù)如下：第一步，預(yù)變性95 ℃ 30 s。第二步，95 ℃ 5 s，然后60 ℃ 30 s，40循環(huán)。第三步，95 ℃ 15 s,60 ℃持續(xù)30 s和95 ℃持續(xù)15 s。

1.5 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測B7-H3的蛋白表達(dá)

將上述各組實(shí)驗(yàn)樣本用PBS洗滌2次，消化，1 000 r/min 條件下離心5 min收集細(xì)胞，加入100 μL PBS懸浮細(xì)胞后，加入5 μLB7-H3抗體混勻后，于4 ℃ 在避光條件下反應(yīng)30 min。收集細(xì)胞用PBS洗3遍后，加入5 μL二抗混勻后，于4 ℃在避光條件下反應(yīng)30 min。待反應(yīng)完全后，離心，去除抗體，用300 μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.6 CCK-8測定檢測轉(zhuǎn)染后ES-2細(xì)胞的增生活性

將shB7-H3和shNC組中的細(xì)胞分別接種在96孔板中進(jìn)行孵育。從接種后第2天到孵育結(jié)束前，進(jìn)行CCK-8處理4 h，并使用酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)在490 nm波長光下測量吸光度值，檢測活細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 shRNA序列

根據(jù)目的基因序列，分別設(shè)計(jì)3條shRNA，其序列信息如表1所示。

表1 shRNA序列Tab.1 shRNA sequence

2.2 B7-H3 shRNA慢病毒在ES-2細(xì)胞中的感染情況

B7-H3 shRNA沉默病毒(526、527及528)和對照組(429)均有綠色熒光蛋白標(biāo)簽。選取高表達(dá)B7-H3蛋白的卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞株ES-2，用526、527、528、429分別感染72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。感染72 h后，均可觀察到均勻明亮的綠色熒光且細(xì)胞狀態(tài)正常，各組病毒均可成功感染ES-2細(xì)胞(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白在ES-2細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.1 Green fluorescent protein expression in ES-2 cells under a fluorescence microscope(10×)A:silent virus 526; B: silent virus 527; C: silent virus 528; D:control virus 429.

2.3 敲降效果

連續(xù)篩選并傳代5次后，qRT-PCR檢測B7-H3 mRNA的表達(dá)量(圖2)，流式細(xì)胞術(shù)檢測B7-H3蛋白表達(dá)(圖3)。與對照病毒429組(1.03±0.25)相比，沉默病毒526組(0.22±0.01)及沉默病毒528組(0.12±0.03)B7-H3 mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.05,P<0.001)；蛋白水平檢測可見沉默病毒526及528組中B7-H3蛋白的表達(dá)明顯低于對照組(shNC-429)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3 222.68，P<0.001)，詳見表2。

圖2 qRT-PCR檢測B7-H3 mRNA的表達(dá)量Fig.2 qRT-PCR detection of B7-H3 mRNA expression***P<0.001.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測B7-H3 蛋白表達(dá)Fig.3 Flow cytometry to detect B7-H3 protein expression

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測B7-H3 蛋白表達(dá)Tab.2 Flow cytometry detection of B7-H3 protein expression

2.4 B7-H3基因敲低前后ES-2細(xì)胞增生活性改變

使用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光值檢測，并對第0、24、48、72小時(shí)的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間ES-2細(xì)胞增生活性在B7-H3基因敲低后48 h(F=20.595,P<0.001)及72 h時(shí)(F=61.882，P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對照病毒429組細(xì)胞相比，沉默病毒526組及528組細(xì)胞增生速度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

圖4 CCK-8檢測細(xì)胞增生Fig.4 CCK-8 detects cell proliferationCCK-8:cell counting kit-8; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3 討論

OC是惡性程度極高的婦科生殖系統(tǒng)，晚期患者5年生存率低于40%[7]。OC預(yù)后差的一個(gè)至關(guān)重要的原因是癌細(xì)胞早期出現(xiàn)化學(xué)藥物治療耐藥，雖然近年來婦科腫瘤領(lǐng)域開展了一些研究[8-9]，并發(fā)現(xiàn)了一些可能的耐藥機(jī)制，如DNA損傷修復(fù)功能加強(qiáng)、凋亡通路阻滯等[8-9]，但尚無突破性進(jìn)展，OC耐藥仍然是OC治療難以攻克的瓶頸問題。但隨著人們對腫瘤發(fā)生學(xué)的研究深入，發(fā)現(xiàn)OC是典型的免疫抑制性腫瘤，免疫逃逸是其發(fā)生、發(fā)展過程中的重要機(jī)制。在過去的40年里，免疫靶向治療策略在腫瘤的臨床治療中一直沒有受到重視，但是最近免疫檢查點(diǎn)PDL1(B7-H1)抑制劑的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了免疫腫瘤學(xué)的新紀(jì)元[10-11]。B7-H3屬于B7家族，是重要的免疫檢查點(diǎn)[12]。B7-H3除了調(diào)節(jié)腫瘤免疫外，還具有調(diào)節(jié)腫瘤侵襲性的非免疫功能。研究[13-14]表明，B7-H3可通過Janus激酶2(Janus kinase 2，Jak2)/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)-9信號通路[13]調(diào)節(jié)各種癌細(xì)胞[14]的遷移、侵襲和黏附。此外，B7-H3在結(jié)直腸癌和乳腺癌細(xì)胞中的過度表達(dá)通過激活Jak2/STAT3/凋亡抑制蛋白survivin信號通路增強(qiáng)對凋亡的抵抗，進(jìn)而削弱了腫瘤細(xì)胞對化療藥物紫杉醇的敏感性[15-16]。B7-H3更是被證明可以調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP-1)，MMP-2，TIMP-2，STAT3和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)，影響疾病的預(yù)后[17]。總之，B7-H3能在不同腫瘤中通過不同機(jī)制促進(jìn)腫瘤的侵襲和侵襲。通過此次實(shí)驗(yàn)，成功構(gòu)建了B7-H3基因敲低及敲除ES-2細(xì)胞系，同時(shí)檢測B7-H3基因敲降程度對ES-2細(xì)胞增生率的影響，提出B7-H3基因敲降可以抑制ES-2細(xì)胞增生，為后續(xù)B7-H3在卵巢癌細(xì)胞增生方面的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。