（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens) 又稱靈桿菌，屬于腸桿菌科沙雷氏屬一種產(chǎn)生鮮紅色素的細(xì)菌，廣泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群。在害蟲生防領(lǐng)域，目前已發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌對多種昆蟲具有致病性，包括大蠟螟Galleria mellonella[1]、印度谷螟Plodia interpunctella[2]、地中海粉螟Anagasta kuehniella[2]、甜菜夜蛾Spodoptera exigua[3]、斜紋夜蛾Spodoptera litura[3]、小菜蛾P(guān)lutella xylostella[4]、馬鈴薯塊莖蛾P(guān)hthorimaea operculella[5]、黑翅土白蟻Odontotermes formosanus[6]、德國小蠊[7]、蝗蟲[8]、蚜蟲[9]、天牛[10]等昆蟲。另有報道黏質(zhì)沙雷氏菌作為植物內(nèi)生菌還能增強(qiáng)植株防御酶活性進(jìn)而提高植物抗病性[11]，因此黏質(zhì)沙雷氏菌在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用備受關(guān)注。然而紅樹林特殊生境下分離到的黏質(zhì)沙雷氏菌有何生理生化特點(diǎn)及其殺蟲活性如何，未見相關(guān)報道。

本研究對分離自湛江紅樹林灘涂的菌株ZJ9通過形態(tài)觀察、生理生化特性測定以及16S rDNA 序列測定分析，確定該菌株菌種，并就菌株ZJ9對草地貪夜蛾和大蠟螟幼蟲的喂毒、血腔毒性進(jìn)行測定，為該菌株用于控制農(nóng)業(yè)害蟲的微生物殺蟲劑開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

實驗所用大蠟螟蟲種購自天津惠裕德生物科技有限公司，為實驗室長期人工飼養(yǎng)，飼料配方為麩皮60 g、面粉60 g、玉米粉60 g、酵母粉30 g、奶粉50 g、蜂蜜50 g、甘油50 mL。實驗用大小一致的老熟幼蟲。草地貪夜蛾種群為實驗室采自湛江玉米地，在室內(nèi)采用新鮮玉米葉進(jìn)行飼養(yǎng)[12]，挑選3 齡幼蟲進(jìn)行試驗。

1.2 供試菌株及其分離培養(yǎng)

菌株蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis（LWCC1017）購自上海魯微科技有限公司，短隱桿菌Empedobacter brevis(GXW15-4) 購自鎮(zhèn)江市潤宇生物科技開發(fā)有限公司，大腸桿菌Escherichia coli(HB101) 購自Takara。

菌株ZJ9 分離自湛江沿海灘涂紅樹林，現(xiàn)保存于廣東海洋大學(xué)海洋微生物實驗室。在營養(yǎng)瓊脂（NA）平板上劃線恒溫（30 ℃）培養(yǎng)24 h 后，觀察菌落大小、形狀、輪廓、透明度、隆起形狀、邊緣、氣味及顏色等形態(tài)特征。細(xì)菌革蘭氏染色和芽孢染色方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.3 生理生化反應(yīng)

菌株的生理生化特性是對菌株種類進(jìn)行分類鑒定的重要依據(jù)之一。測定該菌株15 個主要生理生化特性指標(biāo)：丙二酸利用、檸檬酸鹽利用、葡萄糖氧化發(fā)酵、阿拉伯糖發(fā)酵、木糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、山梨醇發(fā)酵、甲基紅測定、乙酰甲基甲醇測定、淀粉水解、硝酸鹽還原、吲哚反應(yīng)、明膠液化、水楊苷反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)等，具體方法參考文獻(xiàn)[13]。各生化反應(yīng)實驗前，先將該菌株進(jìn)行平板劃線，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h 后備用。

1.4 DNA 提取及16S rDNA 序列擴(kuò)增

采用TIANGEN 公司的基因提取試劑盒提取菌株DNA并于-20 ℃保存。分子鑒定選用16S rDNA，引物為 27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。PCR 反應(yīng)體系:超純水36.5 μL、Takara 10×PCR Buffer 5 μL、模板DNA 2 μL (100 ng)、dNTPMixture (2.5 mmol/L) 4 μL、引物（10 μmL/L）各1 μL、Taq 酶0.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行初步檢測，條帶清晰的PCR 產(chǎn)物送往天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)一步純化和測序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用NCBI 的Blast 程序進(jìn)行比對，下載相似度大于90%的16S rNDA 序列以及該屬中其他細(xì)菌的序列。所用序列菌名、登錄號見圖 2，以Escherichia coli作為外群。用ClustalX 1.83 進(jìn)行序列比對、手工校對后，用 MEGA 7.0 鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14-15]。

1.6 生物測定

發(fā)酵液胃毒法：各菌株通過NA 平板活化后，在LB 培養(yǎng)基中30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，然后以2%接種量二次發(fā)酵48 h 即為待測發(fā)酵液。用各發(fā)酵菌液浸泡玉米葉5 s，自然晾干后分別單頭飼喂草地貪夜蛾3 齡幼蟲，各3 次重復(fù)，每重復(fù)30 頭。置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，統(tǒng)計各處理試蟲1、3、5、7 d 死亡率。記錄時以鑷子碰觸蟲體尾部，不能正常爬行作為死亡標(biāo)準(zhǔn)，若發(fā)現(xiàn)葉片食盡則補(bǔ)充新鮮葉片。

注射法：待測發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min 離心10 min 獲得菌體，加入無菌水重現(xiàn)懸浮備用。使用尖頭微量進(jìn)樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）吸取5 μL菌體溶液，通過大蠟螟老熟幼蟲的第一腹足，將菌體注射到幼蟲體內(nèi)。上清注射，以離心獲得的菌體上清液，經(jīng)針頭過濾器（孔徑為0.1 μm）過濾除菌后注射使用，注射方法同菌體注射法，無菌水為空白對照，各3 次重復(fù)，每重復(fù)10 頭，30℃恒溫下24 h 后統(tǒng)計死亡率并做比較。

1.7 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS 20 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同處理的死亡率進(jìn)行差異顯著性分析（Duncan 法多重比較，顯著水平α為0.05），方差分析之前，先將百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換。采用GraphPad Prism5 軟件作圖。校正死亡率公式如下：

校正死亡率=（處理死亡率-對照死亡率）/(1-對照死亡率)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZJ9 的菌落形態(tài)及生理生化性狀

經(jīng)30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，菌落為小菌落、近圓形，表面光滑，邊緣整齊，不透明，突起為凸鏡狀，紅色（圖1）。革蘭染色后鏡檢表明ZJ9 呈紅色，短桿狀，為革蘭陰性菌。而芽孢染色實驗表明ZJ9 無芽孢。菌株ZJ9 生理生化特性中丙二酸、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-蔗糖、D-山梨醇、明膠酶、吲哚、甲基紅等指標(biāo)均符合黏質(zhì)沙雷氏菌的特性[13]。與同屬其它沙雷氏菌區(qū)別在于格式沙雷氏菌S.grimesii木糖呈陽性、居泉沙雷菌S.fonticola丙二酸呈陽性、氣味沙雷氏菌S.odorifera阿拉伯糖呈陽性、變形斑沙雷氏菌S.proteamaculans阿拉伯糖呈陽性、普城沙雷氏菌S.plymuthica木糖呈陽性、嗜線蟲沙雷氏菌S.nematodiphila淀粉酶呈陽性、無花果沙雷氏菌S.ficaria阿拉伯糖和木糖呈陽性、S.ureilytica無顏色、甲基紅呈陽性、木糖產(chǎn)酸等[16-18]。另外，本研究還測定了菌株ZJ9 檸檬酸鹽、水楊苷、硝酸鹽還原、接觸酶等生理生化特性，詳見表1。

2.2 菌株ZJ9 的分子鑒定

菌株ZJ9 的16S rDNA 測序大小為1 411bp（GenBank 登錄號為MN420867.1），在NCBI 數(shù)據(jù)平臺通過BLAST 同源性比較，菌株ZJ9 與黏質(zhì)沙雷氏菌S.marcescens（登錄號：FJ530951.1，KC171984.1）同源性達(dá)100%，與S.nematodiphila和S.ureilytica同源性分別為99.93%和99.79%。以16S rDNA 利用MEGA7.0 軟件按Neighbor-Joining法構(gòu)建了包括黏質(zhì)沙雷氏菌及同屬臨近種細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。菌株ZJ9 與Serratia marcescens、S.nematodiphila、S.ureilytica聚在同一分支上，遺傳進(jìn)化距離相近。結(jié)合菌株生理生化實驗及16S rDNA 序列分析，菌株ZJ9 鑒定為黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）。

圖1 ZJ9 菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of ZJ9 strain

表1 菌株ZJ9 的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of ZJ9 strain

圖2 鄰接法構(gòu)建的ZJ9 16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain ZJ9

2.3 菌株ZJ9 殺蟲活性

飼喂處理7 d 中，各處理組死亡率均有上升，其中非致病大腸桿菌與無菌水空白對照無顯著差異。供試菌株中，蘇云金芽孢桿菌、隱地桿菌、黏質(zhì)沙雷氏菌校正致死率均在80%以上且顯著高于大腸桿菌（F4,10=28.90,P＜0.05）。黏質(zhì)沙雷氏菌處理1 d 時出現(xiàn)明顯致死率并且顯著高于蘇云金芽孢桿菌和隱地桿菌，隨后在5、7 d 時蘇云金芽孢桿菌和隱地桿菌致死率超過黏質(zhì)沙雷氏菌，但差異不顯著（表2）。草地貪夜蛾幼蟲被黏質(zhì)沙雷氏菌感染后，身體變軟，部分幼蟲體色顯紅且體壁容易破裂流出體液（圖3）。

表2 供試菌株對草地貪夜蛾3 齡幼蟲的致死率比較Table 2 Comparison of the influence of the test strains on the mortality rate of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperda %

圖3 被黏質(zhì)沙雷氏菌感染的草地貪夜蛾幼蟲Fig.3 Spodoptera frugiperda larvae infected by Serratia marcescens

通過對發(fā)酵液離心，血腔注射表明，ZJ9 菌體和上清液（無菌）均可致大蠟螟100%死亡，略高于蘇云金芽孢桿菌菌體的致死率但顯著高于其上清液致死率（F7,16=69.87,P＜0.05），實驗中大腸桿菌的菌體和上清液注射后24 h 與無菌水一樣無死亡（圖4）?？梢娋闦J9 發(fā)酵液中含有一些對大蠟螟高致死作用的活性成分。

圖4 菌株ZJ9 對大蠟螟老熟幼蟲的血腔毒性Fig.4 Hemocoelomotoxicity of strain ZJ9 to the mature larvae of Galleria mellonella

3 討論

菌株ZJ9 菌落及發(fā)酵液均有明顯紅色，無芽孢、革蘭陰性，這些特征從形態(tài)學(xué)角度可以初步鑒定為沙雷氏菌屬[19]。對菌株ZJ9 16S rDNA 測序，生物信息學(xué)分析表明其與黏質(zhì)沙雷氏菌同源性達(dá)100%。而與相近菌種嗜線蟲沙雷氏菌Serratia nematodiphila和Serratia ureilytica可通過生理生化特性區(qū)分，淀粉酶呈陽性的為S.nematodiphila，甲基紅呈陽性、木糖產(chǎn)酸的為S.ureilytica。根據(jù)是否產(chǎn)色素還可以將黏質(zhì)沙雷菌分為2 個亞種[17]，為此ZJ9屬于黏質(zhì)沙雷氏菌粘質(zhì)亞種(S.marescenssubsp.marcens）。然而黏質(zhì)沙雷氏菌還可以分為10 個生物亞群100 多個血清型，要想進(jìn)一步劃分則需要進(jìn)一步血清學(xué)鑒定。

研究表明黏質(zhì)沙雷氏菌對昆蟲、真菌、線蟲等多種有害的生物均具有致病性[20-21]。其致病機(jī)理可能有多種：其一，黏質(zhì)沙雷氏菌基因組中至少含有ChiA、ChiB和ChiC3 種幾丁質(zhì)酶基因，可以產(chǎn)生大量幾丁質(zhì)酶，這些幾丁質(zhì)酶可以提高蘇云金芽孢桿菌殺蟲效果，將ChiA轉(zhuǎn)入水稻中還能提高水稻對紋枯病和稻瘟病的抗性[22]；其二，黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的靈菌紅素具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗瘧疾、抗藻類、抑制癌細(xì)胞、免疫抑制等多種生物學(xué)活性[23]；其三，菌體本身進(jìn)入血腔大量增殖引起宿主患壞血癥而死[16]。本研究中以大蠟螟為試蟲時，發(fā)現(xiàn)ZJ9血腔毒性很高，其無菌上清液也具有很高致病性，這表明菌體外分泌的靈菌紅素或其它活性成分對昆蟲有明顯致病性，同時從草地貪夜蛾幼蟲喂毒死亡癥狀中可以看出該菌明顯含有幾丁質(zhì)酶，致使蟲體體壁破裂組織液化，而究竟哪種關(guān)鍵因子引起宿主發(fā)病值得進(jìn)一步研究。另外，在如何提高菌株殺蟲的效果方面還可以進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化和劑型研究。值得關(guān)注的是該菌對剛在我國定殖的草地貪夜蛾[24-25]低齡幼蟲具有較高的致死率，這是首次報道，這將為利用細(xì)菌防治該蟲提供新的選擇。

總之，本研究通過菌落形態(tài)觀察、細(xì)菌生理生化特性測定和分子鑒定三方面確定了分離自紅樹林的一株細(xì)菌 ZJ9 為黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescensZJ9）。該菌對草地貪夜蛾3 齡幼蟲校正死亡率能達(dá)到80.21%。另外，血腔注射表明菌體及無菌上清液均具有很高致病性，在害蟲生物防治方面值得進(jìn)一步研究。