(廣東海洋大學水產(chǎn)學院,廣東 湛江 524088;廣東省藻類養(yǎng)殖及應用工程技術中心,廣東 湛江 524025)
長莖葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)隸屬蕨藻科(Caulerpaceae),蕨藻屬(Caulerpa),俗稱“海葡萄”,又名“綠色魚子醬”,是一種富含礦物質、不飽和脂肪酸、蛋白質、膳食纖維的食用綠藻[1-3],其在治療糖尿病、肥胖癥、增強免疫力和抗炎癥等方面顯示出廣泛的醫(yī)藥應用前景[4-5]。長莖葡萄蕨藻還能富集人體所需微量元素如鐵、鋅、硒等,可用于保健品和功能性食品的開發(fā)[6-7]。
長莖葡萄蕨藻為固著型海藻,通過假根附著于沙地、珊瑚礁等區(qū)域。目前,長莖葡萄蕨藻一般采用陸基室內工廠化水池(箱)的養(yǎng)殖方式,附著基質通常為采用塑料網(wǎng)和尼龍繩網(wǎng)等,利用網(wǎng)片夾住藻體使其附著生長[8],而在開放水域養(yǎng)殖藻體,則利用網(wǎng)籠、泥土、砂礫等作為附著基質,Tanduyan等[9]發(fā)現(xiàn)長莖葡萄蕨藻在砂礫底質、中層水位海域用塑料網(wǎng)籠養(yǎng)殖時產(chǎn)量最高。Pariyawathee 等[10]報道長莖葡萄蕨藻在泥質附著基質上生長更好,Rabia等[11]發(fā)現(xiàn)長莖葡萄蕨藻在池底播種養(yǎng)殖首月增重比托盤吊養(yǎng)高444%。相關研究發(fā)現(xiàn)不同的附著基質會導致藻體營養(yǎng)成分的變化,如Long 等[12]發(fā)現(xiàn)砂礫底質養(yǎng)殖長莖葡萄蕨藻會導致其灰分、碳水化合物含量上升,Perryman 等[13]發(fā)現(xiàn)酸性土壤會導致蕨藻重金屬含量上升。由此可見,前人的研究更多集中在附著基質等環(huán)境因子對藻體總產(chǎn)量的影響,而關于不同附著基質對長莖葡萄蕨藻具有食用價值的直立枝生物學特性的影響以及附著效果比較的研究鮮有報道。因此,本實驗以垂直砂埋、水平砂埋、塑料網(wǎng)網(wǎng)夾、尼龍網(wǎng)網(wǎng)夾及無附著基質(對照組)等五種附著方式,研究不同附著基質對長莖葡萄蕨藻生長、附著效果和營養(yǎng)組分的影響,以期為長莖葡萄蕨藻增產(chǎn)和品質提升奠定基礎。
藻種:長莖葡萄蕨藻從深圳市藍汀鼎執(zhí)生物科技有限公司購買,培養(yǎng)于廣東海洋大學水產(chǎn)學院藻類實驗室。
暫養(yǎng)條件:溫度(25±1)℃,照度(4 000±100)lx,光暗周期12 L∶12 D,額外添加營養(yǎng)鹽(N,0.5 mmol/L NaNO3溶液;P,0.01 mmol/L KH2PO4溶液),海水鹽度30±1,pH 為8.1,連續(xù)充氣培養(yǎng),換水周期為2 d[14]。
實驗選用附著基質為塑料網(wǎng)、尼龍繩網(wǎng)和海砂,海砂采于廣東省湛江市硇洲島沙灘,經(jīng)海水清洗和滅菌鍋高溫滅菌后,烘干待用。長莖葡萄蕨藻的附著基質與種植方式如圖1 所示。
實驗前,將整株藻體剪至2~3 cm,放入的滅菌海水中暫養(yǎng)1 d。采用 1.5 L 塑料盒作為培養(yǎng)容器,添加1 L 滅菌海水,設計A、B、C、D、E 組,A 組為藻體垂直砂埋于砂礫,B 組為藻體水平砂埋于砂礫,C 組藻體以兩層塑料網(wǎng)網(wǎng)夾并置于容器底部,D 組藻體以兩層尼龍網(wǎng)網(wǎng)夾并置于容器底部,對照組E 為無附著基質培養(yǎng)。選取健康藻體,隨機分布至各組,每組5 株,每組設置3 個平行組,每天都添加1 mL 培養(yǎng)液(N,0.5 mmol/L NaNO3溶液;P,0.01 mmol/L KH2PO4溶液),換水周期3 d,光照度為(2000±100) lx,其余培養(yǎng)條件同1.1,每天觀察,15 d 后結束實驗。
培養(yǎng)前測量藻體初始質量m0(各組藻體的初始質量無顯著差異),初始直立枝長度LZ0及匍匐莖長度LP0,最大光能轉化效率(Fv/Fm)及實際光化學效率Y(II)。
1.4.1 藻體生長指標測定 實驗結束后,取出藻體用無菌海水沖洗,用吸水紙吸干藻體表面水分,用游標卡尺測量新生直立枝長度LZ、匍匐莖長度LP及新生球狀小枝直徑d,天平秤稱取實驗末藻體總質量、新生直立枝質量及新生匍匐莖質量分別為m15、mZ、mP,計算藻體特定生長率(SGR)及新生直立枝質量長度比(R)[15]。
1.4.2 附著能力指標測定 實驗結束后,取出藻體用無菌海水沖洗干凈,計算假根數(shù)量和長度。將五組藻體的假根部分重新埋入海砂中,3 d 后取出,用毛刷刷下假根附著砂粒,在烘箱烘干后計算砂礫質量m[16]。
1.4.3 葉綠素熒光參數(shù) 在實驗開始后6 h、1 d(24 h)、3 d(96 h)、7 d(168 h)、15 d(360 h)分別取出藻體進行暗處理10 min,用葉片夾固定直立枝在葉綠素熒光儀(PAM-2500)下測量葉綠色熒光參數(shù),包括Fv/Fm、Y(II)[14,17],重復3 次(包括暗處理),取平均值。
1.4.4 營養(yǎng)指標 將藻體進行剪切,勻漿,稀釋,按照南京建成試劑盒說明書測量指標,分別測其可溶性糖和總蛋白含量。
SGR=ln(m15/m0)/t,
式中m0為初始質量(g),m15為最終質量(g)。
長莖葡萄蕨藻直立枝的球狀小枝密度與直徑大小、質量長度比值是衡量該食品品質的重要標準之一[15,18],因此,測量新生直立枝質量長度比(R,g/mm)作為商品品質的評價指標:
R=mZ/LZ,
式中mZ為新生直立枝質量(g),LZ為新生直立枝長度(mm)。
總蛋白質量濃度(g/L)=(待測D值-空白D值)/(標準D值-空白D值)×標準品質量濃度(0.524 g/L)×稀釋倍數(shù),在λ=595 nm 處測量。
可溶性糖質量濃度(mg/mL)=(待測D值-空白D值)/(標準D值-空白D值)×標準品質量濃度(100 μg/mL)×稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白濃度,在λ=620 nm 處測量。
實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23 進行分析,以平均值±標準誤表示,并作單因素方差分析和Duncan 多重比較,P<0.05 時差異有統(tǒng)計學意義,用GraphPad Prim7 作圖,比較結果的顯著與否判斷僅限于統(tǒng)計意義范疇。
各組長莖葡萄蕨藻培養(yǎng)2 d,從其斷口處均長出白色絲狀組織,參照以往資料可判斷出該組織為藻體假根[16];4 d,A 組在原有的直立枝側面或末端長出新直立枝,其新生匍匐莖在原直立枝下端生長,B 組新生直立枝從原匍匐莖上生長,其余組在匍匐莖斷口有新生匍匐莖出現(xiàn);7 d,除A、B 組外,其余組仍無新生直立枝,C、D 組的匍匐莖分支數(shù)最多;15 d,A、B 兩組新生直立枝數(shù)與其他各組相比顯著增多(P<0.05),其中A 組新生直立枝長度最長,而C、D 組新生匍匐莖數(shù)顯著增多(P<0.05)。長莖葡萄蕨藻培養(yǎng)15 d,A 組的新生直立枝數(shù)與新生直立枝質量最優(yōu),與其余組相比有顯著提高(P<0.05),其新生直立枝數(shù)為3.00,質量為0.313 3 g,最大長度為41.11 mm,新生球狀小枝直徑為1.67 mm。C 組的新生匍匐莖數(shù)和長度與其他各組相比有顯著提高(P<0.05),其新生匍匐莖數(shù)為8.75,新生匍匐莖質量為0.210 2 g,新生匍匐莖長度為100.05 mm(圖2、表1)。
長莖葡萄蕨藻特定生長率,如圖(3-Ⅰ),A 組長莖葡萄蕨藻特定生長率最高,為4.576 3 %·d-1,明顯高于其余組(P<0.05),其余各組之間無明顯差異(P>0.05);新生直立枝質量長度比如圖(3-Ⅱ)所示,A 組最高,為0.085 6 g/mm,與對照組E 相比有顯著差異(P<0.05),是E 組的8.92 倍。
可見,垂直砂埋組藻體的生長最好,垂直砂埋對藻體新生直立枝的質量、長度及球狀小枝直徑有顯著影響,而網(wǎng)夾組對藻體新生匍匐莖的長度及分支有顯著影響。
圖1 附著基質類型與種植方式Fig.1 Types of substrates and planting methods
圖2 不同附著基質下長莖葡萄蕨藻培養(yǎng)15 d 的生長情況Fig.2 Effect of different substrates on growth of Caulerpa lentillifera after 15 day
表1 不同附著基質下長莖葡萄蕨藻再生生長情況Table 1 Effect of different substrates on growth of Caulerpa lentillifera after 15 day
圖3 不同附著基質對長莖葡萄蕨藻生長的影響Fig.3 Effect of different substrates on growth of Caulerpa lentillifera
實驗結束后,不同附著基質對藻體附著效果,如圖4 所示。B 組假根長度最長,均值為30.25 mm,明顯高于E 組(P<0.05),A、C、D、E 組各組間無顯著差異(P>0.05)(圖4-Ⅰ);A 組假根數(shù)最多,為32 根,顯著高于假根為9 根的E 組(P<0.05),其余組間無顯著差異(P>0.05)(圖4-Ⅱ);B 組假根附著砂礫質量最高,為0.556 0 g,E 組為0.160 0 g,明顯高于E 組(P<0.05),B 組是E 組的3.48 倍,其余組與E 組無顯著性差異(P>0.05)(圖4-Ⅲ)。
由此可見,水平砂埋對藻體的假根長度、假根數(shù)及假根附著砂礫干物質質量有顯著影響。
不同附著基質對長莖葡萄蕨藻Fv/Fm的影響,如圖5 所示。各組在6 h 顯著下降,A 組Fv/Fm值最高,明顯高于E 組(P<0.05);24 h,A 組最大,為0.855 μmol·m-2·s-1,是E 組的1.1 倍,其余組與E組無明顯差異(P>0.05);15 d,A、B、C、D 均恢復原有水平,其組間無明顯差異(P>0.05),都明顯高于E 組(P<0.05)。
圖4 不同附著基質對長莖葡萄蕨藻附著效果的影響Fig.4 Effect of different substrates on attachment effect of Caulerpa lentillifera
圖5 不同附著基質對長莖葡萄蕨藻Fv/Fm 的影響Fig.5 Effect of different substrates on Fv/Fm of Caulerpa lentillifera
不同附著基質對長莖葡萄蕨藻Y(II)的影響,如圖6 所示。在6 h,各組顯著下降,各組無顯著差異(P>0.05);24 h,A 組最高,為0.851 μmol·m-2·s-1,明顯高于E 組的0.777 μmol·m-2·s-1(P<0.05),其余組無顯著差異(P>0.05);7 d,除E組外,各組無明顯差異(P>0.05),均恢復到初始狀態(tài);15 d,A、B、C、D 組均與E 組有顯著差異(P<0.05)。
可見,A 組與其余組相比,其Fv/Fm和Y(II) 值恢復最快,比較Fv/Fm值恢復快慢,其數(shù)值順序為:A>B>D>C>E,而E 組低于原始水平。
圖6 不同附著基對長莖葡萄蕨藻Y(II)的影響Fig.6 Effect of different substrates on Y(II) of Caulerpa lentillifera
不同附著基質對長莖葡萄蕨藻可溶性糖含量的影響,如圖7 所示。
圖7 不同附著基質對長莖葡萄蕨藻可溶性糖含量的影響Fig.7 Effect of different substrates on content of soluble sugar of Caulerpa lentillifera
A、B 組可溶性糖含量與對照組相比有顯著降低(P<0.05),其余各組間無顯著差異(P>0.05),藻體可溶性糖含量E 組最高,為147.2 mg/mL。
不同附著基質對長莖葡萄蕨藻蛋白質濃度的影響如圖8。A 組總蛋白含量顯著高于E 組(P<0.05),為30.00 g/L,是E 組(23.80 g/L)的1.26倍,其余各組無顯著差異(P>0.05)。由此可見,砂埋處理的藻體會導致其可溶性糖含量顯著下降,而垂直砂埋處理的藻體其蛋白質含量明顯上升。
圖8 不同附著基質對長莖葡萄蕨藻蛋白質濃度含量影響Fig.8 Effect of different substrates on content of total Protein of Caulerpa lentillifera
附著基質是影響海藻生長發(fā)育的主要生態(tài)因子之一,能影響海藻根莖生長、物種遷移、生殖發(fā)育等[19-21]。海藻附著基質的研究一直備受關注。在育苗方面,成熟的海帶(Saccharina japonica)是以育苗簾收集其游孢子并栽培[22],壇紫菜(Pyropia haitanensis)是以貝殼為附著基質附著絲狀體[23],而長莖葡萄蕨藻的栽培主要以網(wǎng)、繩子、網(wǎng)籠或砂礫充當附著基質進行栽培[24]。在長莖葡萄蕨藻附著基質研究中,譚圍等[25]用雙面網(wǎng)栽培海葡萄比底播方式生長更好,Rabia 等[11]發(fā)現(xiàn)采用底播方式,海葡萄產(chǎn)量比托盤吊養(yǎng)高444%,Tanduyan 等[9]用塑料網(wǎng)籠與砂礫栽培海葡萄3 個月增重413.3 g。關于其他海藻附著基質的研究中,Voerman 等[26]發(fā)現(xiàn)海藻在砂礫附著基質上栽培其葉片更長,鼠尾藻(Sargassum thunbergii)在水泥塊培育期幼苗顯著增長[27]。
長莖葡萄蕨藻的直立枝為可食用部分,其新生直立枝質量、質量長度比、球狀小枝直徑等是評判長莖葡萄蕨藻品質的標準,指標越高恰好說明藻體生長良好,產(chǎn)量高,品質優(yōu)良。本實驗條件下,藻體在垂直砂埋處理下其新生直立枝長度和數(shù)目均顯著增加,其新生直立枝的質量和質量長度比值最大,對比塑料網(wǎng)、尼龍網(wǎng)栽培的藻體,新生直立枝質量增幅633.73%和464.50%,新生直立枝質量長度比增幅205.71%和235.68%,說明砂礫附著基質能提高直立枝的產(chǎn)量,垂直砂埋更符合藻體形態(tài)學生長特性,且砂礫附著基質更接近蕨藻自然海域的生長環(huán)境[28-29];另外,塑料網(wǎng)、尼龍網(wǎng)栽培的藻體新生匍匐莖長度和分枝數(shù)值顯著增高,原因可能是栽培網(wǎng)一定程度遮蔽光照,低光照能促進匍匐莖生長,這與吳啟藩[15]的研究成果一致??梢姡瑢Ρ染W(wǎng)夾栽培,垂直砂埋更能促進長莖葡萄蕨藻直立枝的生長。
蕨藻的假根為絲狀假根,用于固著附著基質。羽狀蕨藻(Caulerpa mexicana)[30]和育枝蕨藻(Caulerpa prolifera)[31]的假根會分泌一種植物蛋白幫助藻體附著。假根的生長會直接影響海藻的成活率及產(chǎn)量[32],若根不夠多、長,則附著不牢固,會造成脫苗、死苗等現(xiàn)象[33]。所以增殖根莖對海藻栽培有直接必要性。大型海藻可通過組織切割誘導假根生長[34-35],Duarte 等[36-37]發(fā)現(xiàn)以砂埋方式栽培的絲粉藻(Cymodocea nodosa)生長更快,葉片、根莖的長度等指標均上升;蕨藻在低氮磷、低光照、砂礫底質等條件會促進假根生長,同時藻體葉片生長率會隨著假根的生長而提高[16]。
假根的數(shù)量和長度與附著砂粒質量呈正相關,假根附著砂礫干質量是測試假根附著力的重要標準之一[16]。本實驗中水平砂埋的藻體假根數(shù)和假根長度顯著性增加,其假根長度超過3 cm,是其他附著基質藻體的3 倍,可能是因為砂埋的方式使假根處于低光或無光的環(huán)境,營養(yǎng)鹽吸收量不及直接暴露在海水中的多[20],對比網(wǎng)附著基,砂礫附著基為假根提供更大附著面積及粗糙附著面[30,38],促進藻體生長出更多、更長的假根,從而增強其附著力;實驗中水平砂埋藻體假根附著砂礫質量明顯重于其余處理組,對比網(wǎng)夾栽培的藻體,增幅152.89%和155.56%,進一步證實海葡萄水平砂埋處理后,其附著效果最佳,其次為垂直砂埋。
葉綠素熒光是探討光合作用的指標,其中Fv/Fm和Y(II)表示光系統(tǒng)II(PSII)最大光化學量子產(chǎn)量[39],在海藻的研究中,葉綠素熒光參數(shù)可反映環(huán)境因子對海藻產(chǎn)生脅迫程度[40]。如杉葉蕨藻(Caulerpa taxifolia)以紗網(wǎng)為附著基質,其Fv/Fm值會降低[41],水流過緩、群體密度增大會影響海藻光合作用[42],海藻在適宜條件下該參數(shù)幾乎沒有波動,但在受到脅迫情況下該參數(shù)會明顯降低[43]。本研究中,垂直砂埋處理的藻體Fv/Fm和Y(II)值恢復最快,其次為水平砂埋藻體,網(wǎng)夾栽培藻體Fv/Fm和Y(II)值恢復最初水平的時間比砂埋的藻體長,因為垂直砂埋更接近藻體自然生長的狀態(tài),在同一時間點其光合速率越快,藻體光合產(chǎn)物合成越多,藻體能量供給充足,促進藻體生長,而水平砂埋和網(wǎng)夾栽培限制了藻體光照和營養(yǎng)鹽的吸收,無附著基質的海葡萄在充氣水體中不斷翻滾、漂浮,影響藻體葉綠素的合成,其感應重力方向不斷變化,體內生長素分配不連續(xù),進而抑制蕨藻的生長,與以往的研究[41,44]相一致。
不同的附著和栽培基質會導致植物體的營養(yǎng)成分發(fā)生改變[45-46]。本實驗中,水平和垂直沙埋組的可溶性糖含量分別下降 34.24%和33.93%,這與Long 等[45]報道的砂礫底質使長莖葡萄蕨藻可溶性糖含量下降37.96%的結果相似;同時,本研究中垂直砂埋組藻體蛋白質含量明顯高于其余組,這可能是因為砂礫基質有助于植物蛋白質合成[47],對于火山地貌的硇洲島海域,其砂礫成分中的泥碳與珍珠巖混合基質也會使植物體蛋白含量上升[48],且垂直沙埋更符合藻體生長特性。
可見,通過調節(jié)附著基質組分,可選擇性地促進長莖葡萄蕨藻營養(yǎng)物質的積累,為長莖葡萄蕨藻功能性食品開發(fā)提供參考。
長莖葡萄蕨藻以垂直砂埋方式種植在砂礫附著基質中,可顯著增加藻體新生直立枝的鮮質量、長度及球狀小枝直徑,并提高藻體的蛋白質含量。藻體在砂礫附著基質的附著能力明顯增強,但會降低藻體可溶性糖含量。