劉學(xué)文，吳紅梅，白瑛，曾群，曹澤民，吳秀山，唐旻

鉀離子通道蛋白Shaker對果蠅心臟衰老的保護(hù)作用

劉學(xué)文1，吳紅梅1，白瑛1，曾群1，曹澤民1，吳秀山2，唐旻1

1. 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，衡陽 421001 2. 湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研究中心, 發(fā)育生物學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081

鉀離子通道在心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極過程中起著重要作用。鉀離子通道蛋白種類繁多，已知鉀離子通道蛋白KCNQ和HERG/eag參與心臟動(dòng)作電位的形成，調(diào)節(jié)心臟收縮節(jié)律。鉀離子通道蛋白Shaker是果蠅()體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)電壓門控鉀離子通道，維持神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞的電興奮性，但是目前其在成人心臟功能中的作用仍不清楚。本研究以果蠅為模型，高頻電刺激模擬心臟應(yīng)激狀態(tài)，觀察鉀離子通道蛋白基因突變體的心衰發(fā)生率。同時(shí)，利用心臟特異性啟動(dòng)子Gal4特異性敲低鉀離子通道蛋白Shaker的表達(dá)；果蠅成體心臟生理學(xué)功能分析系統(tǒng)分析了1、3、5周齡特異性敲低鉀離子通道蛋白Shaker的心臟表型。結(jié)果表明，基因突變將嚴(yán)重影響果蠅心臟抗應(yīng)激能力，表現(xiàn)在高頻電刺激后的心力衰竭發(fā)生率顯著性升高；心臟特異性敲低基因?qū)е?周齡果蠅心律失常發(fā)生率顯著性增加；心臟特異性敲低將顯著降低果蠅壽命。綜上所述，本研究推測鉀離子通道蛋白Shaker在衰老過程中維護(hù)果蠅正常的心臟功能。

鉀離子通道；心律失常；Shaker；心臟衰老；果蠅

心律失常是一種常見的心臟疾病，其患病率和死亡率隨著年齡的增長而顯著增加[1]。年齡相關(guān)性心律失常的發(fā)病機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。心臟結(jié)構(gòu)和離子通道的重構(gòu)是老年性心律失常發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)，但其發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚。

鉀離子通道在心臟動(dòng)作電位復(fù)極中起著重要作用[2～5]。鉀離子通道家族作為心臟離子通道中種類最多的家族，由結(jié)構(gòu)相似但功能不同的亞型組成，每一種鉀離子通道都具有特定的動(dòng)力學(xué)和電壓依賴性[3]。在果蠅()和脊椎動(dòng)物中，/和鉀離子通道基因突變會(huì)導(dǎo)致心臟復(fù)極能力減弱和心臟動(dòng)作電位延長，從而增加心律失常的發(fā)生率；且其基因表達(dá)水平在衰老心臟中也顯著減少，這可能是年齡依賴性心臟功能障礙的重要標(biāo)志之一[6～9]。鉀離子通道蛋白Shaker是果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)電壓門控鉀離子通道，維持神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞的電興奮性[10,11]，但其在衰老心臟中的作用仍不清楚。因此，本研究利用果蠅作為模型，研究鉀離子通道蛋白Shaker在年齡依賴性心率失常發(fā)生發(fā)展中的功能。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

野生型果蠅w、突變體果蠅shaker、突變體果蠅KCNQ和基因缺失系均來自于Bloomington果蠅品系中心。的RNAi品系(v23673)來自于維也納果蠅RNAi中心(VDRC)。心臟特異性表達(dá)的Gal4果蠅品系由美國Sanford Burnham醫(yī)學(xué)研究所Rolf Bodmer實(shí)驗(yàn)室提供，Gal4與RNAi品系中的UAS序列結(jié)合啟動(dòng)下游RNA干擾序列的表達(dá)，在心臟中特異性敲低基因的表達(dá)。

1.2 電刺激實(shí)驗(yàn)

利用高頻電刺激實(shí)驗(yàn)?zāi)M人類心臟的應(yīng)激狀態(tài)，構(gòu)建果蠅心衰模型，具體方法請參考文獻(xiàn)[12,13]。利用脈沖電激儀循環(huán)交流電(6 Hz、40 V)刺激30 s，電刺激停止后的2 min內(nèi)評估心臟功能，存在如下3種情況：(1)正常：心臟恢復(fù)正常而有節(jié)律的收縮跳動(dòng)；(2)心臟纖顫：心臟表現(xiàn)為劇烈的收縮、回旋或者緩慢的蠕動(dòng)等不正常行為；(3)心臟停搏：心臟停止跳動(dòng)。心衰率是指果蠅發(fā)生心臟纖顫或心臟停搏的百分比。每個(gè)基因型檢測150只以上，卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 果蠅成體心臟功能分析

在模擬果蠅生理緩沖液(108 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2 mmol/L CaCl2、8 mmol/L MgCl2、15 mmol/L HEPES、1 mmol/L NaH2PO4、4 mmol/L NaHCO3、10 mmol/L Sucrose、5 mmol/L Trehalose，pH 7.1)中解剖果蠅，剪去果蠅的大腦和胸部的腹神經(jīng)節(jié)，排除神經(jīng)對果蠅心跳的影響。暴露于模擬生理緩沖液中的心臟仍可以處于有節(jié)律的跳動(dòng)，方法詳見文獻(xiàn)[14]。1周齡、3周齡和5周齡果蠅相當(dāng)于人類的青年、中年和老年[15]。用高速EM-CCD攝像機(jī)(Hamamatsu C9300，日本)以130幀/秒的速度拍攝1周齡、3周齡和5周齡的果蠅心跳30 s，利用果蠅成體心臟功能分析軟件分析獲得M-mode心跳圖譜，并測得心跳周期、收縮期和舒張期、收縮直徑和舒張直徑、縮短分?jǐn)?shù)，以及心律失常指數(shù)等參數(shù)。心率失常指數(shù)是指果蠅心臟每個(gè)心跳周期與整個(gè)心跳周期中值的差異大小，代表果蠅不規(guī)律心跳的程度[7,14,16]。

1.4 生存曲線分析

果蠅在25℃環(huán)境下培養(yǎng)，每管不超過25只。每隔3 d換一次果蠅食物管，并記錄每管果蠅中的死亡數(shù)。根據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上果蠅死亡的數(shù)量，繪制生存曲線，分析果蠅的平均壽命。每個(gè)雜交組收集大約250只F1子代果蠅，并進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。利用Graphpad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Mantel-Cox統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果呈現(xiàn)的是1次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 shaker突變體心臟抗應(yīng)激能力下降

老齡心臟在靜息時(shí)表現(xiàn)功能正常，但由于生理儲(chǔ)備下降在應(yīng)激狀態(tài)下表現(xiàn)為心衰。為了模擬人類心臟在應(yīng)激狀態(tài)下的生理表現(xiàn)，本研究利用脈沖電激儀對果蠅心臟進(jìn)行高頻電刺激30 s[12,15]。野生型w果蠅心臟出現(xiàn)心臟纖顫或心臟停搏的比例相對較低，心衰率為24%；鉀離子通道蛋白純和突變體KCNQ果蠅的心衰率為75% (圖1)，與Ocorr等[7]研究數(shù)據(jù)相近。shaker突變破壞了鉀離子通道S5-S6跨膜區(qū)域，鉀離子不能通過[17]。電刺激實(shí)驗(yàn)顯示，缺失系的雜合體(Df/+)和純合突變體(shakerhomo)的心衰率分別為50%和56% (圖1)，具有顯著性差異，表明Shaker鉀離子通道功能的喪失或降低使電刺激誘發(fā)心衰的易感性顯著增加，標(biāo)志著心臟抗應(yīng)激能力的下降。

2.2 鉀離子通道蛋白Shaker維護(hù)老齡果蠅心臟的生理功能

為了進(jìn)一步闡明鉀離子通道蛋白Shaker在調(diào)節(jié)老齡心臟的生理學(xué)功能，本研究利用心臟特異性驅(qū)動(dòng)子Gal4品系與基因的RNAi品系雜交，獲得F1代，在心臟中特異性敲低(KD)。利用高速EM-CCD攝像機(jī)拍攝果蠅心跳，獲得M-mode心跳圖，顯示果蠅心臟壁隨著心臟收縮和舒張的運(yùn)動(dòng)軌跡。與對照組相比，5周齡心臟特異性KD果蠅的收縮期和舒張期延長，出現(xiàn)纖維性震顫(圖2)。

圖1 Shaker鉀離子通道功能的喪失或降低增加電刺激誘發(fā)的心衰發(fā)生率

樣本量分別標(biāo)記在柱形圖內(nèi)，****：<0.0001。

圖2 心臟特異性敲低shaker基因的果蠅M-mode心跳圖

M-mode圖揭示了對照組(control,/+)和心臟特異性敲低shaker組(KD,4.2>shaker RNAi) 5周齡果蠅心臟壁在10 s內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡。綠色代表舒張期，紅色線條代表收縮期，藍(lán)色線條代表心跳周期。

基于M-mode心跳圖譜分析測得心跳周期、收縮期和舒張期、收縮直徑和舒張直徑、縮短分?jǐn)?shù)，以及心律失常指數(shù)等參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，1周齡和3周齡心臟特異性KD果蠅心臟收縮期、舒張期以及心率不齊指數(shù)沒有明顯的異常；5周齡心臟特異性KD果蠅心臟雖然代表收縮功能的縮短分?jǐn)?shù)沒有顯著差異(圖3G)，但是心跳周期明顯延長，包括收縮期和舒張期的延長，心律失常指數(shù)明顯增加(圖3：A～D)，表明鉀離子通道蛋白Shaker參與了老齡而非低齡果蠅心臟功能的維持。

正常果蠅的收縮期在0.15～0.25 s之間，舒張期在0.3～0.5 s之間。鑒于5周齡心臟特異性r KD果蠅出現(xiàn)了心臟纖顫和心臟短暫停搏，本研究記錄了收縮期大于0.4 s和舒張期大于1 s的心跳為異常長收縮期(long systolic interval)和異常長舒張期(long diastolic interval)[18,19]。與對照組相比，心臟特異性KD果蠅心臟從3周齡開始出現(xiàn)長時(shí)間的收縮或者舒張的發(fā)生率增加，并且隨著年齡的增長，這種異常的表型會(huì)進(jìn)一步加重(圖3：E～F)。為了排除個(gè)別果蠅出現(xiàn)異常表型引起的實(shí)驗(yàn)誤差，本研究對出現(xiàn)長收縮期的果蠅或者長舒張期的果蠅數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果也顯示出了相似的趨勢(圖3：H～I(xiàn))。綜上所述，鉀離子通道蛋白Shaker在維持老齡果蠅心臟功能中具有非常重要作用。

圖3 心臟特異性敲低shaker基因?qū)е履挲g依賴性心衰

A～D、G：1周齡、3周齡和5周齡果蠅心臟特異性KD (4.2>RNAi)和對照組果蠅(4.2/+和RNAi/+)的心臟生理功能參數(shù)，包括心跳周期、收縮期、舒張期、心律不齊指數(shù)和縮短分?jǐn)?shù)。E, F：異常長收縮期(收縮期大于0.4 s)或者異常長舒張期(舒張期大于1 s)的百分比。H、I：含有長收縮期或者長舒張期的果蠅數(shù)量百分比所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。*：<0.5；***：<0.01。每個(gè)樣本量為20～30個(gè)果蠅，error bar為SEM。

2.3 心臟特異性敲低shaker基因影響果蠅壽命

鑒于鉀離子通道蛋白Shaker在維持衰老心臟功能方面的顯著作用，本研究檢測了心臟特異性KD對果蠅壽命的影響。與對照組果蠅(51 d)相比，心臟特異性KD果蠅的中位生存期(42 d)顯著降低(圖4)，中位生存期縮短了17.6%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義，表明心臟特異性敲低鉀離子通道蛋白Shaker縮短果蠅壽命，而心臟功能的衰退可能是決定壽命的重要因素。

3 討論

隨著人類壽命的不斷增加，對年齡相關(guān)性心臟功能障礙的研究越來越被關(guān)注。然而，對脊椎動(dòng)物心臟衰老的研究存在著一些局限性。首先，在哺乳動(dòng)物中與心衰發(fā)生相關(guān)的基因突變通常具有致死性；其次，哺乳動(dòng)物壽命相對較長，不利于研究年齡相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制。果蠅是唯一具有心臟的無脊椎動(dòng)物模型，其氧氣供給不受心臟功能影響，心臟特異性敲低心衰發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)可能不致死；果蠅的生命周期短暫，有利于年齡相關(guān)性疾病的研究[18,20]。此外，果蠅具有與人類相似的心臟功能障礙，如擴(kuò)張型心肌病、心律失常等；與人類心律失常相關(guān)的基因在果蠅中具有同樣的功能。因此，果蠅是研究心衰的理想模型[18]。

圖4 心臟特異性敲低shaker基因會(huì)影響果蠅生存

X軸為成體果蠅的存活時(shí)間(d)，Y軸為存活果蠅的百分?jǐn)?shù)。黑線和紅線分別代表對照組(4.2/+)和KD (4.2 >RNAi)的生存曲線。樣本量為250只果蠅，Mandel-Cox對數(shù)秩檢驗(yàn)，****：<0.0001。

鉀離子通道負(fù)責(zé)心臟動(dòng)作電位的復(fù)極相，從而保證心臟節(jié)律性收縮；鉀離子通道功能喪失，如和/，會(huì)導(dǎo)致果蠅或人類的年齡依賴性心律失常[7～9]。突變體果蠅在1周齡時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)明顯的心率失常，并且呈現(xiàn)年齡依賴性惡化。而心臟特異性KD果蠅在1周齡和3周齡時(shí)表現(xiàn)正常，只有在5周齡時(shí)才表現(xiàn)出異常的生理功能，表明鉀離子通道蛋白Shaker對低齡果蠅心臟功能不是必須的，但是參與了老齡果蠅心臟功能的維持。5周齡KD果蠅心臟的收縮力沒有受損，表明KD不影響心臟結(jié)構(gòu)的重塑。

心臟衰老的特征之一是心臟抗應(yīng)激能力下降。本研究利用電刺激實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)突變體對應(yīng)激刺激誘發(fā)心衰的易感性較高，類似于人類心臟衰老。同時(shí)，心臟特異性KD會(huì)顯著提高老齡果蠅心律失常的發(fā)生率。我們推測心律失常發(fā)生率的增加和抗應(yīng)激刺激能力的降低很可能是由于老齡果蠅心臟中基因表達(dá)下調(diào)，心肌電位復(fù)極異常引起的。鉀離子通道蛋白Shaker的研究可能為年齡依賴性心衰的治療提供新的靶標(biāo)。

致謝

感謝美國Sanford Burnham醫(yī)學(xué)研究所Rolf Bodmer教授和湖南師范大學(xué)吳秀山教授提供果蠅成體心臟功能分析平臺(tái)和心臟特異性驅(qū)動(dòng)子4.2 Gal4；感謝瑞典斯德哥爾摩大學(xué)Mattias Mannervik教授對本論文的指導(dǎo)。

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Potassium channel Shaker play a protective role against cardiac aging in

Xuewen Liu1, Hongmei Wu1, Ying Bai1, Qun Zeng1, Zemin Cao1, Xiushan Wu2, Min Tang1

Potassium channels, which are the most diverse group of the ion channel family, play an important role in the repolarization of cardiomyocytes. Recent studies showed that potassium channels, such as KCNQ and HERG/eag, play an important role in regulating adult heart function through shaping the action potential and maintaining the rhythm of cardiac contraction. The potassium channel protein Shaker is the first voltage-gated potassium channel found into maintain the electrical excitability of neurons and muscle cells, but its role in adult cardiac function is still unclear. In this study,was used as a model to study the role of Shakerchannel in the maintenance of cardiac function under stress and aging. The incidence of heart failure was observed in smutant after external electrical pacing, which simulates cardiac stress. Additionally, The cardiac-specific driverGal4 was used to specifically knock down the expression of the potassium channelin. The cardiac parameter was analyzed at 1, 3, 5 weeks of age on cardiac specific knockdown of susingadult cardiac physiological assay. The results showed that the mutation ofgene seriously affect the cardiac function under stress, demonstrated by significant increase in heart failure rate under electrical stimulation. In addition, cardiac specific knockdown ofincreased the incidence of arrhythmias inat the age of 5 weeks. Cardiac-specific knockdown ofreduces life span. Therefore, the results of this study suggest a vital role of the potassium channelin maintaining normal cardiac function during aging.

potassium channel; arrhythmias;; cardiac aging;

2020-08-11;

2020-12-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81500311，81711530050)和湖南省科技廳課題(編號(hào)：2015JC3080)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.81500311,81711530050)，and Key Program of Hunan Provincial Department of Science and Technology (No.2015JC3080)]

劉學(xué)文，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：果蠅心衰的表觀遺傳調(diào)控。E-mail: 1547962520@qq.com

唐旻，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：果蠅心衰的分子機(jī)制研究。E-mail: mtang2014@163.com

10.16288/j.yczz.20-253

2020/12/31 11:23:00

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201231.0954.001.html

(責(zé)任編委: 韓俊海)