孫權(quán) 徐偉明 韓雪 張鵬霞 孟德欣

(1佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154002；2濰坊市坊子區(qū)仁康醫(yī)院；3保山中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校)

當(dāng)今，全球糖尿病患者已經(jīng)超出2億例，在我國(guó)糖尿病患者超過(guò)7 000萬(wàn)例〔1〕。糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病引起的一種心臟疾病〔2〕，主要病理特征為心肌間質(zhì)增生、細(xì)胞肥大、增殖、凋亡等，臨床表現(xiàn)主要以心臟舒張功能缺陷為主、左心室重構(gòu)，隨病情加重、病變進(jìn)展出現(xiàn)心臟收縮功能異?！?〕。氧化應(yīng)激是由于多種因素刺激機(jī)體，體內(nèi)產(chǎn)生超量的活性氧簇(ROS)；機(jī)體內(nèi)抗氧化能力下降，進(jìn)而機(jī)體內(nèi)氧化-還原反應(yīng)平衡被打破，氧化損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致生命活動(dòng)受到影響的一種狀態(tài)〔4〕。糖尿病引起的高血糖和高脂肪酸能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過(guò)量的ROS，高血糖所致的糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)異常升高也可導(dǎo)致心肌細(xì)胞ROS大量產(chǎn)生〔5〕。ROS在體內(nèi)過(guò)多產(chǎn)生或者消除減少，會(huì)直接引起生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性、DNA受損、細(xì)胞死亡或凋亡，造成組織損傷。褪黑素(MT)屬于吲哚類(lèi)激素，由松果體分泌，是具有很強(qiáng)的抗氧化劑，高效清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基〔6〕，高效增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)和血清丙二醛(MDA)存量〔7，8〕，另外可通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化防御酶和抑制整個(gè)細(xì)胞凋亡，從而充分發(fā)揮其抗氧化能力，對(duì)許多疾病防治療效甚好。本文擬分析MT對(duì)糖尿病大鼠心功能及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 體重(200±20)g，雄性Wistar大鼠(由長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供)80只，清潔級(jí)，常規(guī)飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)提供的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，每天12 h日常光照，室內(nèi)氣溫、濕度正常，正常飲食。鏈脲佐菌素(STZ)由美國(guó)Sigma公司提供；MT由浙江黃巖延年褪黑素有限公司提供。

1.2分組和建立模型 大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)環(huán)境性喂養(yǎng)1 w后，按隨機(jī)分配原則分組：正常組、模型組、低劑量MT組(10 mg/kg體重)和高劑量MT組(20 mg/kg體重)，一組20只，每5只一籠飼養(yǎng)。

除正常組外的3組都給予高脂高糖飲食4 w后，實(shí)驗(yàn)大鼠禁食12 h，1%STZ 50 mg/kg體重腹腔注射，72 h尾靜脈采血測(cè)血糖，在以后實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每4 w測(cè)一次血糖，達(dá)到空腹血糖≥16.7 mmol/L以上，視為糖尿病大鼠模型成功。正常組按照同等劑量注射檸檬酸緩沖液。造模成功之后，每天一次10∶00～14∶00灌胃MT，低劑量MT組按10 mg/kg體重，高劑量MT組按兩倍低劑量組，剩余兩組給予同等劑量的生理鹽水，一直持續(xù)至16 w。

1.3取材 用藥前、后對(duì)空腹血糖進(jìn)行測(cè)量。禁食、水12 h后，大鼠尾靜脈采血，動(dòng)物血糖儀測(cè)出血糖值。斷髓法處死大鼠，剖開(kāi)大鼠胸腔，心臟暴露眼前。順著大鼠心底大血管根部剪斷心臟，剪開(kāi)心耳，心室進(jìn)針，0.75%鹽水沖洗，多聚甲醛固定，10%中性甲醛浸泡，蠟塊包埋，制成5 μm厚石蠟切片。

1.4指標(biāo)觀察 ①使用生理記錄儀，記錄大鼠心臟左室收縮壓(LVSP)、左室舒張期末壓(LVEDP)、室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)和室內(nèi)壓上升達(dá)最大速率所需時(shí)間(t-dp/dt)。②HE染色觀察心肌組織的形態(tài)變化。③比色法測(cè)定各組心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)，制備10%心肌組織勻漿后，利用可見(jiàn)光分光光度計(jì)，測(cè)定各組心肌組織中MDA、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)含量的變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MT對(duì)心臟功能的影響 與正常組比較，模型組心功能LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低、t-dp/dt升高，差異具有顯著性(P<0.05)；與正常組比較，MT各組心功能LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、t-dp/dt差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，MT各組心功能LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高、t-dp/dt降低，差異具有顯著性(P<0.05)，低劑量組和高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組心功能指標(biāo)比較

2.2HE染色結(jié)果 普通光鏡下觀察結(jié)果，顯示正常組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，層次鮮明，核圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，心肌間隙清晰可見(jiàn)，膠原纖維著色淡，分布稀疏；模型組心肌結(jié)構(gòu)不清，排列雜亂，組織腫脹，細(xì)胞間質(zhì)及毛細(xì)血管增生，胞體增大，大小不均，排列雜亂，胞質(zhì)豐富，胞質(zhì)變淺，胞核呈現(xiàn)長(zhǎng)桿狀，排列雜亂，核膜皺縮，核固縮，有呈雙核，染色質(zhì)呈顆粒狀。MT處理過(guò)后心肌間隙清晰，心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)均勻，低劑量MT組較明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織(HE，×200)

2.3各組MDA、CAT和GSH-PX含量 經(jīng)過(guò)MT灌胃16 w后，與模型組比較，MT用藥組MDA含量明顯降低(P<0.05),CAT和GSH-PX含量明顯升高(P<0.05)；而與正常組比較，模型組MDA含量顯著升高，CAT、GSH-Px顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組心肌組織中MDA、CAT和GSH-PX含量測(cè)定

3 討 論

高血糖可導(dǎo)致心臟膠原沉積并且誘發(fā)心肌間質(zhì)纖維化程度加重，致使AGEs含量升高，心肌硬度增加，引發(fā)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，激活核因子(NF)-κB調(diào)控基因表達(dá)，從而改變心肌收縮能力〔9，10〕。MT通過(guò)改善胰島素敏感性，下調(diào)胰島素抵抗，調(diào)節(jié)心肌的代謝平衡，使其能更有效清除體內(nèi)自由基，對(duì)抗心肌細(xì)胞損傷。

有學(xué)者研究表明，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，心功能下降〔11〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明MT對(duì)糖尿病大鼠心肌具有保護(hù)作用。體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是氧化與抗氧化動(dòng)態(tài)平衡的破壞因素之一，導(dǎo)致體內(nèi)炎性細(xì)胞過(guò)度浸潤(rùn)，氧化代謝的中間產(chǎn)物——ROS大量產(chǎn)生、聚集。ROS是導(dǎo)致人體衰老及各種疾病所不可忽視的因素。ROS以游離的自由基形式存在于體內(nèi)，主要含有超氧陰離子(O2-)、H2O2和OH等等。機(jī)體內(nèi)造成組織嚴(yán)重?fù)p害正是由于ROS的大量堆積，驅(qū)使細(xì)胞凋亡。氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)共存于機(jī)體內(nèi)，抗氧化系統(tǒng)包括兩大類(lèi)：一是酶類(lèi)系統(tǒng)，包括SOD、CAT、GSH-PX等；一類(lèi)是非酶類(lèi)系統(tǒng)，有GSH、金屬硫蛋白(TM)、維生素C等，還包括微量元素硒、鋅和銅等〔12〕?？寡趸到y(tǒng)直接或間接地降低ROS含量，如CAT主要分解體內(nèi)的H2O2，降低含量，降低細(xì)胞損傷。CAT屬于酶類(lèi)ROS清除劑，存在于動(dòng)物機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)，動(dòng)物肝臟內(nèi)濃度最高，成為防御體系的重要酶，催化H2O2分解成H2O與O2，使機(jī)體細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害；GSH-PX廣泛存在機(jī)體內(nèi)，是重要的體內(nèi)過(guò)氧化物分解酶，硒半胱氨酸是GSH-PX的活性中心。包括組織GSH-PX、血漿GSH-PX、磷脂氫過(guò)氧化物GSH-PX和胃腸道專(zhuān)屬性GSH-PX等四種。CAT和GSH-PX都是生物機(jī)體內(nèi)研究抗氧化的重要指標(biāo)。而MDA是機(jī)體內(nèi)重要的氧化常用指標(biāo)，MDA是機(jī)體氧化代謝的終產(chǎn)物，自由基作用于脂質(zhì)后發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，可引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子發(fā)生交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性。MDA也會(huì)影響線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物和線(xiàn)粒體內(nèi)關(guān)鍵酶的活性，加劇質(zhì)膜損傷。

MT是機(jī)體天然抗氧化劑，由松果體分泌，可以自由通過(guò)細(xì)胞膜，清除自由基可以增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶類(lèi)的活性。MT與膜上受體結(jié)合后，由第二信使如環(huán)磷酸腺苷(cAMP)介導(dǎo)使胞內(nèi)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，并影響相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)主動(dòng)切除松果體后，導(dǎo)致大鼠體內(nèi)的ROS基團(tuán)堆積、活性上調(diào)、增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)〔13〕。而Kornelia 等〔14〕給予患者外源性MT 1個(gè)月后，MDA濃度下降，證明MT可以改善2型糖尿病患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的狀態(tài)。研究表明給予糖尿病患者外源性MT 2個(gè)月后，MDA濃度下降，血漿和胞質(zhì)中GSH-PX活性增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)水平減緩，空腹血糖和糖化血紅蛋白水平明顯改善〔15〕。Geeta等〔16〕給予STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠外源性MT后，發(fā)現(xiàn)MT可讓部分坐骨神經(jīng)的傳導(dǎo)速度得到一定恢復(fù)，并明顯降低血清內(nèi)MDA含量，降低了體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，MT能改善糖尿病患者神經(jīng)病變得到了進(jìn)一步的證實(shí)。綜上，給予外源性MT可以對(duì)抗體內(nèi)增強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以保護(hù)細(xì)胞，緩解細(xì)胞所受傷害，抵抗機(jī)體的應(yīng)激。MT可通過(guò)多條件途徑抑制糖尿病心肌細(xì)胞中的過(guò)度氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而減輕糖尿病大鼠心肌損傷程度。

致謝：感謝黑龍江省北藥與功能食品優(yōu)勢(shì)特色學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目的大力支持。